戚豫-1--遺傳病的實(shí)驗(yàn)室檢查手段-超級簡化版

1、遺傳病的實(shí)驗(yàn)室檢查手段進(jìn)展遺傳病的實(shí)驗(yàn)室檢查手段進(jìn)展北大醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心北大醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心戚豫戚豫 研究員研究員2022-6-1012007,Illumina推出推出Solexa; ABI推出推出SOLid 均能在均能在3天內(nèi)完成天內(nèi)完成1人的全基因組測序人的全基因組測序2022-6-1022022-6-10遺傳病和基因的數(shù)量？遺傳病和基因的數(shù)量？遺傳病總數(shù)：14,861種(Online- Mendelian Inheritance in Man, OMIM, by 2015-3-21)人類基因總數(shù)：24,000個人類各種結(jié)構(gòu)和功能蛋白：100,000種89種表型和基因全清楚；4,381種表現(xiàn)找到致

2、病突變意味著可做直接的基因診斷的病種很少！已知序列：10,391個基因可做間接診斷的很多！3“遺傳病遺傳病” 概念概念廣義：所有疾病。因?yàn)橐磺腥梭w正常生理功能廣義：所有疾病。因?yàn)橐磺腥梭w正常生理功能和病理狀態(tài)都是由基因決定的和病理狀態(tài)都是由基因決定的狹義：因基因突變而引發(fā)的疾病狹義：因基因突變而引發(fā)的疾病如何區(qū)分三個概念：如何區(qū)分三個概念：遺傳性疾?。号c環(huán)境因素引起的疾病對立遺傳性疾?。号c環(huán)境因素引起的疾病對立先天性疾病：可以是圍產(chǎn)期感染先天性疾?。嚎梢允菄a(chǎn)期感染/藥物所致藥物所致家族性疾?。嚎赡茈S著成員的遷出而終止家族性疾?。嚎赡茈S著成員的遷出而終止2022-6-104發(fā)病頻率發(fā)病頻率總計(jì)

3、總計(jì)占我國出生人口占我國出生人口5.6%5.6%；為全球平均；為全球平均5 57 7倍倍每一項(xiàng)只占萬分之幾到千分之幾每一項(xiàng)只占萬分之幾到千分之幾按系統(tǒng)分類排名前按系統(tǒng)分類排名前5位：位：神經(jīng)系統(tǒng)：智力低下、代謝障礙、癲癇神經(jīng)系統(tǒng)：智力低下、代謝障礙、癲癇心血管系統(tǒng)：先心病心血管系統(tǒng)：先心病內(nèi)分泌系統(tǒng)：糖尿病、腎上腺皮質(zhì)增生內(nèi)分泌系統(tǒng)：糖尿病、腎上腺皮質(zhì)增生生殖系統(tǒng)：不孕不育生殖系統(tǒng)：不孕不育骨骼系統(tǒng)：多指骨骼系統(tǒng)：多指/趾趾-并指并指/趾、軟骨發(fā)育不良趾、軟骨發(fā)育不良2022-6-1052022-6-10先天性疾病的誘發(fā)因素先天性疾病的誘發(fā)因素遺傳原因遺傳原因后天環(huán)境所致，因素：后天環(huán)境所致，

4、因素： 物理：物理：X-ray、微波、超聲波、熱、微波、超聲波、熱 化學(xué)：砷、鉛、汞（水俁病）等無機(jī)物；化學(xué)：砷、鉛、汞（水俁病）等無機(jī)物； 橙劑、橙劑、EB（溴乙啶）等有機(jī)物（溴乙啶）等有機(jī)物 生物（感染）：生物（感染）：TORCH、EB、HIV、肝炎病毒等肝炎病毒等圍產(chǎn)期因素誘變，但不肯定致病圍產(chǎn)期因素誘變，但不肯定致病圍產(chǎn)期因素只侵犯到個別器官，但注意與嵌合圍產(chǎn)期因素只侵犯到個別器官，但注意與嵌合遺傳（遺傳（mosaic）區(qū)分）區(qū)分62022-6-10如何檢出？如何檢出？高危人群高危人群環(huán)境暴露環(huán)境暴露既往病史既往病史家族史家族史感染史感染史遷居情況遷居情況 遺傳遺傳 DNA/RNA 環(huán)

5、境環(huán)境無論外來病原體還是本身異常，無論外來病原體還是本身異常，遺傳物質(zhì)遺傳物質(zhì)的檢測都是有效手段的檢測都是有效手段72022-6-10實(shí)驗(yàn)室檢測手段實(shí)驗(yàn)室檢測手段, , 分辨率分辨率, , 和范圍和范圍染色體核型Karyotyping:109bp, 2800倍鏡下可見熒光原位雜交FISH: 107bp, 一個基因的一部分多重探針連接擴(kuò)增多重探針連接擴(kuò)增MLPA:105bp,幾十個基因比較基因組雜交CGH Array:105bp,幾個基因間接基因診斷: 103105bp,一個或數(shù)個基因直接基因診斷PCR-Sequencing: 1bp, 一個基因Affymatric chip: 1bp, 數(shù)千個

6、基因, 半個基因組Genome-Wide-Sequencing: 1bp, 全部2.4萬個基因注：bp, base pair, 堿基對82022-6-10從核型核型; FISH; array CGH; MLPA; 到CMA(chromosomal microarray analysis, 染色體微陣列,分子核型分子核型)細(xì)胞遺傳學(xué)與分子遺傳學(xué)相結(jié)合的方法細(xì)胞遺傳學(xué)與分子遺傳學(xué)相結(jié)合的方法臨床細(xì)胞遺傳學(xué)的歷史是伴隨著一系列識別染色體方法的技術(shù)進(jìn)步發(fā)展臨床細(xì)胞遺傳學(xué)基本工作：核型分析 國內(nèi)主要中期染色體核型，G顯帶在400條 國外高分辨染色體核型， G顯帶在1500條條件 ：細(xì)胞培養(yǎng)，光鏡，核型分

7、析系統(tǒng)軟件92022-6-101、染色體核型、染色體核型 Karyotyping基于顯微鏡下濃聚的染色體形態(tài)檢查方法： G帶、R帶、Q帶（550條，7組） 高分辨染色體分帶（1500條） FISH（熒光原位雜交）：分裂間期染色體畸變種類： 數(shù)目異常（整倍和非整倍） 結(jié)構(gòu)異常:-;+;t; del; ins; inv; dup; inv dup; fra(X)(q27.3):脆性X; der:衍生染色體; r(13):13號染色體呈環(huán)狀（暗示有缺失）; i(Xq):等臂Xq102022-6-102 2、熒光原位雜交技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)FISH ( (fluorescence in situ h

8、ybridization,) )可以結(jié)合，但不依賴于核型分析單色與多色FISH，如SKY-FISH(光譜式多色染色體)是鑒別基因組發(fā)生較大缺失或重復(fù)金標(biāo)準(zhǔn)不足：一次雜交識別的范圍有限需要很好的臨床診斷或其他提示，花費(fèi)大人力多，設(shè)備高級方法：探針標(biāo)記，細(xì)胞或染色體的原位雜交條件：探針(cosmid)、 DNA 提取、PCR、真空干燥、圖像采集與分析112022-6-10FISH需要條件需要條件熒光顯微鏡熒光顯微鏡+圖像分析系統(tǒng)圖像分析系統(tǒng)122022-6-103、多重探針連接擴(kuò)增、多重探針連接擴(kuò)增 MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplific

9、ation ) Schouten JP第一次描述一種基于PCR反應(yīng)，通過毛細(xì)管電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物是一種高分辨的，用于檢測基因組序列拷貝數(shù)變異的方法 ( Nucleic Acids Res. 2002 Jun 15; 30(12): e57) 132022-6-10 同時(shí)檢測40個基因組序列異常，幾乎每個染色體2個 近端粒常有微缺失涉及不育、發(fā)育、智力，可一次查全僅需要20ng的DNA 能檢測單個外顯子exon的拷貝數(shù), 探針辨認(rèn)短的基因組序列,部分變性的DNA,如石蠟包埋,甲醛固定的樣本均可使用 相對定量40個mRNA,鑒定啟動子的甲基化狀態(tài),檢測已知的突變和SNPS MLPA方法功能、特點(diǎn)方法

10、功能、特點(diǎn)142022-6-10MLPA反反應(yīng)應(yīng)過過程程152022-6-10MLPA結(jié)果判定結(jié)果判定相對峰域與對照相比減少相對峰域與對照相比減少35-50%判定缺失判定缺失相對峰域與對照相比增加相對峰域與對照相比增加35-50%判定重復(fù)判定重復(fù)突變突變/多態(tài)性位于探針的連接點(diǎn)或與探針的連接多態(tài)性位于探針的連接點(diǎn)或與探針的連接點(diǎn)很近也可能導(dǎo)致相對峰域減少點(diǎn)很近也可能導(dǎo)致相對峰域減少單一的外顯子缺失需要其他方法證實(shí)單一的外顯子缺失需要其他方法證實(shí)結(jié)果分析結(jié)果分析2例例162022-6-10172022-6-10182022-6-10MLPA需要條件PCR儀測序儀192022-6-104、比較基因

11、組雜交、比較基因組雜交 (Comparative genomic hybridization, CGH)什么是CGH: 1992年Kallioniemi創(chuàng)立的基于熒光標(biāo)記和分子、細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)鑒定基因組DNA的獲得、丟失和擴(kuò)增，并且可以把這些遺傳變異定位在正常的中期染色體上的一種技術(shù)特點(diǎn): 在一個實(shí)驗(yàn)中，用一張中期染色體涂片分析全基因組的大的DNA序列拷貝數(shù)的不平衡改變(獲得和丟失)，即因劑量的變化而不需要分裂的細(xì)胞缺點(diǎn): 與測序相比分辨率不高，擴(kuò)增子約2Mb，檢出的缺失大小510Mb但也是個優(yōu)點(diǎn)：容易辨識和解釋 1997年Solinas-Toldo建立Microarrary/array-CG

12、H 目前最通用的是美國安捷倫公司(Agilent)的平臺，已成為國際上遺傳病診斷、流產(chǎn)組織分析和種植前診斷PGD的第一線手段(first-line)202022-6-10MicroarraynBACs/PACsnDNA探針固定在玻璃片上探針固定在玻璃片上nArrayed by robotically printing DNA onto slidesnAgilent scannerOld array-CGH212022-6-10Patient 2This patient presented to the Laboratory at 12 months of age with infantile

13、spasms and developmental delay. His head circumference was below the 2nd centile and weight was between the 10 to 25th centile. Seizures continued daily. At a review at 32 months brachycephaly, low anterior hairline, hypertelorism, and a large protruding tongue were some of the additional features o

14、bserved. Subtelomeric FISH revealed a deletion of the distal 9q probe PAC112N13. Array-CGH showed the patient has a 1.5-1.8 Mb deletion of distal 9q. Further FISH evaluation established the deletion as 1.7Mb with breakpoints between the BAC clones RP11- 83N9 and RP11-695L17.222022-6-1011q duplicatio

15、n 10q deletionPatient 5Male patient who presented at 18 years of age with intellectual disability, autism and dysmorphic features. Subtelomere FISH showed a unbalanced translocation, with an additional copy of the 11q probe PAC770G7 present on distal 10q. The distal 10q probe PAC137E24Gwas not prese

16、nt.232022-6-10New array-CGH?用不同的顏色熒光標(biāo)記等量病人的測試和參用不同的顏色熒光標(biāo)記等量病人的測試和參照照 DNA加入加入 Human Cot1DNA在在Microarray上進(jìn)行雜交上進(jìn)行雜交 雜交后洗去未結(jié)合的和錯配的雜交后洗去未結(jié)合的和錯配的靶靶 DNA高分辨掃描儀芯片高分辨掃描儀芯片242022-6-10雙色激光掃描n紅色 CY5n綠色 CY3F 值產(chǎn)生 reference DNApatient=25真實(shí)掃描芯片圖(8X60K 芯片)分析軟件界面2022-6-1026Cyto report: 給出23條染色體圖和分析表格（列出部分）2022-6-10272

17、022-6-10什么是基因診斷？什么是基因診斷？狹義：針對致病基因的突變分析是一種直接的診斷擴(kuò)展：利用致病基因的多態(tài)性(polymorphism) ；或利用相鄰的多態(tài)性標(biāo)記(polymorphic markers)進(jìn)行連鎖分析是一種間接的診斷廣義：通過對疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，包括復(fù)制(DNA)、表達(dá)(RNA)和翻譯(蛋白質(zhì))加以全過程分析所做出的診斷282022-6-10基因診斷技術(shù)基礎(chǔ)基因診斷技術(shù)基礎(chǔ):PCR聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR) :1985年發(fā)明,1992諾貝爾獎試管在熱循環(huán)儀(PCR儀)中反應(yīng)幾小時(shí)，待測基因片段，專一地?cái)U(kuò)增上百萬倍PCR

18、過程：加熱變性：加熱變性：分開模DNA雙鏈冷卻復(fù)性：冷卻復(fù)性：使引物與目標(biāo)序列特異結(jié)合 保溫延長：保溫延長：使引物按模板序列延長292022-6-10PCRPCR產(chǎn)物檢測產(chǎn)物檢測PCRPCR反應(yīng)場所反應(yīng)場所 以及以及302022-6-10不適合做不適合做PCR診斷的病種診斷的病種染色體病大片段基因缺失和重排所致的遺傳病： 解決辦法：細(xì)胞遺傳學(xué)，熒光原位雜交FISH、多重探針連接擴(kuò)增MLPA、比較基因組雜交CGH、基因芯片Affymatric array和大規(guī)模全基因組測序基因巨大(Megabases)且無熱點(diǎn)突變的遺傳?。篘F1、DMD、BMD、ADPKD etc. 解決辦法：雜交、酶學(xué)、代謝

19、產(chǎn)物、功能分析，截短蛋白分析法(Protein Truncation Test, PTT)、色譜、串聯(lián)質(zhì)譜312022-6-10哪些遺傳病可以做基因診斷哪些遺傳病可以做基因診斷? 需要查閱OMIM遺傳病數(shù)據(jù)庫()322022-6-10哪些遺傳病可以做基因診斷哪些遺傳病可以做基因診斷? 基因診斷適用范圍和必要性基因診斷適用范圍和必要性有器官組織差異性而不適合做組織活檢的遺傳?。河衅鞴俳M織差異性而不適合做組織活檢的遺傳?。簂ong QT等心臟病、糖原累積癥I型(von Gierke型)、癲癇等腦病診斷后可以治療或提前預(yù)防發(fā)病的遺傳病：診斷后可以治療或提前預(yù)防發(fā)病的遺傳病

20、：如PKU、肝豆?fàn)詈俗冃院虶6PD缺乏癥可以進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷的嚴(yán)重的先天代謝病，嚴(yán)重的精可以進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷的嚴(yán)重的先天代謝病，嚴(yán)重的精神疾患或惡性早期致死性疾?。荷窦不蓟驉盒栽缙谥滤佬约膊。喝缧詣e畸形和性發(fā)育異常而找不到染色體異常。可通過選擇性流產(chǎn)加以預(yù)防傳統(tǒng)方法不能診斷、診斷不確切的家族性疾?。簜鹘y(tǒng)方法不能診斷、診斷不確切的家族性疾?。憾嘁猿ｏ@、X連鎖和母系方式遺傳?？勺鲞B鎖分析332022-6-10例如例如: :家族性氨基甙類藥物耳聾家族性氨基甙類藥物耳聾對對氨基甙類如氨基甙類如卡那霉素、丁胺卡那、慶大霉卡那霉素、丁胺卡那、慶大霉素、新霉素以及鏈霉素等超級敏感素、新霉素以及鏈霉素等超級敏

21、感條件致病條件致病使用氨基甙類藥物使用氨基甙類藥物母系遺傳母系遺傳線粒體線粒體DNA上編碼上編碼12S rRNA的的基因存在致病突變基因存在致病突變A1555G一旦發(fā)現(xiàn)，可對全家進(jìn)行該突變的篩查一旦發(fā)現(xiàn)，可對全家進(jìn)行該突變的篩查發(fā)布用藥禁忌發(fā)布用藥禁忌342022-6-10 -1(先證者先證者) -2 -3 -4 AG: 線粒體線粒體mtDNA1555AG基因診斷基因診斷( ：有突變：有突變)II-1 -2 -3 -4氨基甙類耳毒家系的基因診斷示意圖氨基甙類耳毒家系的基因診斷示意圖I-1 I-2352022-6-10例例2 線粒體病的基因診斷線粒體病的基因診斷mitochondrion線粒體是

22、細(xì)胞的能量工廠線粒體是細(xì)胞的能量工廠362022-6-10Leigh病病- 亞急性壞死性腦脊髓病亞急性壞死性腦脊髓病嚴(yán)重性：在我院兒科臨床診斷的嚴(yán)重性：在我院兒科臨床診斷的3535例中，死亡例中，死亡2929例（例（83%83%）。目前生存僅僅）。目前生存僅僅6 6例。例。LeighLeigh病是一種線粒體病，但僅僅有病是一種線粒體病，但僅僅有20%20%由由mtDNAmtDNA突變突變所致，突變突變所致，80%80%由核基因突變所導(dǎo)致。由核基因突變所導(dǎo)致。基因檢查：基因檢查：mtDNAmtDNA突變檢出率極低突變檢出率極低229229臨床臨床診斷病例中僅僅檢出診斷病例中僅僅檢出3 3例：例：

23、T8993C 2T8993C 2例和例和T8993G1T8993G1例（死后尸解結(jié)果例（死后尸解結(jié)果mtDNA Mut%mtDNA Mut%：血：血=85%;=85%;肌肉肌肉=94%;=94%;腦腦=98%=98%；其母外周血；其母外周血=10%=10%）372022-6-10病例1、臨床表現(xiàn)男，男，4月，主因精神發(fā)育倒退、驚厥入院月，主因精神發(fā)育倒退、驚厥入院第一胎，孕第一胎，孕9月疑潛在性缺氧行剖宮產(chǎn)，生后無窒息；月疑潛在性缺氧行剖宮產(chǎn)，生后無窒息；2月內(nèi)發(fā)育如常，后出現(xiàn)倒退，表現(xiàn)為頸部發(fā)軟、四肢活月內(nèi)發(fā)育如常，后出現(xiàn)倒退，表現(xiàn)為頸部發(fā)軟、四肢活動差、吸吮能力減弱、低熱、陣發(fā)性呼吸暫停（

24、動差、吸吮能力減弱、低熱、陣發(fā)性呼吸暫停（28次次/日）日）檢查：間斷抽搐，四肢肌力、肌張力低下，病理征檢查：間斷抽搐，四肢肌力、肌張力低下，病理征(-)。血乳酸高、代謝性酸中毒。血乳酸高、代謝性酸中毒。EEG示左側(cè)為主的多灶尖波、示左側(cè)為主的多灶尖波、棘波、多棘波和棘慢波。棘波、多棘波和棘慢波。MRI 示缺血改變：雙側(cè)殼核、示缺血改變：雙側(cè)殼核、丘腦區(qū)異常信號；腦白質(zhì)發(fā)育落后。兩次眼底檢查未見丘腦區(qū)異常信號；腦白質(zhì)發(fā)育落后。兩次眼底檢查未見異常呼吸節(jié)律不整，死前突然出現(xiàn)嘆氣樣呼吸異常呼吸節(jié)律不整，死前突然出現(xiàn)嘆氣樣呼吸父父31歲、母歲、母30歲，均無遺傳病家族史歲，均無遺傳病家族史38202

25、2-6-10392022-6-10402022-6-10方法方法PCR擴(kuò)增擴(kuò)增mtDNA8791-9413片段片段(622bp)分別用限制性內(nèi)切分別用限制性內(nèi)切酶酶MspI和和SmaI酶酶解解PCR產(chǎn)物產(chǎn)物2.5%瓊脂糖凝膠電瓊脂糖凝膠電泳分離酶解片段泳分離酶解片段對對EB染色的片段進(jìn)染色的片段進(jìn)行密度掃描，突變行密度掃描，突變比例（比例（Mut%）=突突變新增片段密度變新增片段密度/原原有片段殘留密度有片段殘留密度+突變新增片段密度突變新增片段密度結(jié)果結(jié)果患兒體內(nèi)存在高患兒體內(nèi)存在高比例的比例的8993TG突變突變患兒患兒1親屬中母親屬中母親含較低比例的親含較低比例的同樣突變同樣突變患兒患兒

26、1肌和腦組肌和腦組織病理檢查符合織病理檢查符合嬰兒型嬰兒型Leigh綜綜合征診斷合征診斷患兒患兒1 MRI示腦示腦缺氧性改變?nèi)毖跣愿淖僊 患兒肌肉患兒肌肉 患兒血患兒血 母親母親 陰性對陰性對412022-6-10T8993GT8993C422022-6-10432022-6-10病理改變：灰質(zhì)為主的海綿樣改病理改變：灰質(zhì)為主的海綿樣改變，神經(jīng)細(xì)胞壞死和毛細(xì)血管增變，神經(jīng)細(xì)胞壞死和毛細(xì)血管增生。陳舊病變出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生生。陳舊病變出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生，新鮮病變存在格子細(xì)胞。，新鮮病變存在格子細(xì)胞。腦干腦干黑質(zhì)、舌下神經(jīng)核、面神經(jīng)核和黑質(zhì)、舌下神經(jīng)核、面神經(jīng)核和前庭神經(jīng)核在不同病人均受累前庭神經(jīng)核在

27、不同病人均受累。其他部位病變其他部位病變可以可以僅限于腦干，僅限于腦干，也也可以同時(shí)累及可以同時(shí)累及脊髓灰質(zhì)脊髓灰質(zhì)、基底基底節(jié)節(jié)、大腦和小腦皮層大腦和小腦皮層以及以及白質(zhì)白質(zhì)。442022-6-10“間接法”基因診斷連鎖分析 例：苯酮尿癥(PKU)的診斷致病基因：苯丙氨酸羥化酶PAH方法：細(xì)菌抑制實(shí)驗(yàn)(篩查) 苯丙酮酸和PAH定量基因診斷困難 70多種突變 基因大，突變很分散 檢測突變成本高，周期長直接檢測突變或連鎖分析?452022-6-10連鎖分析方法產(chǎn)前診斷PKU選擇幾對染色體標(biāo)記(marker) A B 連鎖分析示意連鎖分析示意圖圖需要多態(tài)性標(biāo)記（與需要多態(tài)性標(biāo)記（與PAH基因基因在

28、染色體上的距離越近越好）在染色體上的距離越近越好）對先證者對先證者(BB)及家系成員及家系成員(父父-AB;母母-BC;胎兒胎兒-AC)的標(biāo)記進(jìn)的標(biāo)記進(jìn)行分型行分型(genotyping)胎兒胎兒-AC：不受累?。翰皇芾?！連鎖診斷準(zhǔn)確度：連鎖診斷準(zhǔn)確度：marker與致與致病基因的連鎖程度病基因的連鎖程度有有1%的交換率，理論可信度為的交換率，理論可信度為99%C 462022-6-10產(chǎn)前基因診斷對象：胎兒的DNA、代謝產(chǎn)物或酶蛋白取材：絨毛(8周)、羊水(16周)、胎兒靜脈血手段： 針對代謝產(chǎn)物：HPLC、GC-MS(有組織特異性) 酶活性：特異性人工底物顯色(有組織特異性) 針對基因：R

29、FLP、PCR等 (無組織特異性)要求：雙取樣、雙方法、有資質(zhì)、有質(zhì)控準(zhǔn)入：目前北京7家，專家委員會審核和年審管理:北京市產(chǎn)前診斷與產(chǎn)前篩查工作規(guī)范 產(chǎn)前診斷技術(shù)管理辦法47體細(xì)胞嵌合的遺傳?。ㄉ臣?xì)胞嵌合異常比例過低也不行）組織器官異質(zhì)性過大（線粒體病）國家法律和行業(yè)規(guī)定不允許的范圍，如“天才基因”兒的選擇（遺傳不平衡）性別鑒定（除非性連鎖疾?。┏蕯?shù)量遺傳的多基因病或遺傳相關(guān)的復(fù)雜遺傳病以及沒有做好準(zhǔn)備的家庭2022-6-10哪些病不適合產(chǎn)前基因診斷48 非侵入性產(chǎn)前檢查NIPT血漿游離DNA突變檢測技術(shù) TTTTCTTTTC c.2383 CT c.2383 CT c.4005 delG

30、c.4005 delGG2671*2022-6-1049母體血漿中的胚胎DNALo YM et al. Fetal cf-DNA detected via Y chromosome, Lancet 1997胎兒游離DNA：cell-free fetal DNA(cff DNA)母體外周血含有cffDNA，幾乎全部來源于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞。懷孕4周可檢出，8周后含量上升并穩(wěn)定存在。（7周建立胎兒胎盤循環(huán)）。cffDNA片段比較小，長度在75bp和250bp之間。母體外周血中的cffDNA含量在5%到30%之間。孕周越大外周血中胚胎DNA的含量越高。與母親體重有關(guān)。產(chǎn)后2hr之內(nèi)消失。2022-6-10

31、5022條常染色體23條常染色體20% 胚胎 DNA380%2胎兒 80%母親染色體非整倍體導(dǎo)致劑量變化2022-6-1051技術(shù)和科學(xué)的目標(biāo)技術(shù)和科學(xué)的目標(biāo) that government of the people, by the people, for the people, shall not perish from the earth.by Abraham Lincoln2022-6-1052基因診斷的制高點(diǎn)多基因?。?能否靠基因芯片或微陣列解決？ 靶細(xì)胞靶細(xì)胞對照細(xì)胞對照細(xì)胞Cy5紅色靶雜交到MicroarrayCy3綠色靶逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記收獲收獲 RNA Random arr

32、ay of clusters 100um2022-6-10532022-6-10劃時(shí)代的新技術(shù)大規(guī)模二代測序NGS(Next Generation Sequencing) 人類基因組計(jì)劃長達(dá)10年、耗資千億、6國數(shù)萬科學(xué)家投入，僅完成4個人的基因2007年：1人，3天內(nèi)，3000美元，費(fèi)用和時(shí)間在以每年遞減一半的速度下降取代所有一切，40種常見病發(fā)表。多基因病時(shí)代來了？SOLEXA_illumina 1G Genome Analyzer542022-6-10Instrument without CoversFluidics & electronicsFlow cell & de

33、tectionLaser optics552022-6-10Flowcell in Imaging Location562022-6-10基因診斷和產(chǎn)前基因診斷中的知情同意和倫理學(xué)問題知情同意和倫理學(xué)問題實(shí)驗(yàn)室有認(rèn)證、國家標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室有認(rèn)證、國家標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)人員有許可證實(shí)驗(yàn)人員有許可證有標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程有標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程MOPS、質(zhì)控、質(zhì)控/質(zhì)評質(zhì)評簽發(fā)臨檢報(bào)告要慎重、留余地簽發(fā)臨檢報(bào)告要慎重、留余地可靠性和及時(shí)性兼?zhèn)淇煽啃院图皶r(shí)性兼?zhèn)?7樣品的采集與保存對象對象 保存環(huán)境保存環(huán)境 保存期限保存期限白細(xì)胞/皮膚細(xì)胞* 低溫 20C 1年EBV轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞系* 凍存液氮 無限組織 冰凍80

34、C 3年毛發(fā)(帶毛囊) 低溫 20C 1年口腔脫落細(xì)胞 低溫 20C 1年DNA 高鹽冷藏4C 10年RNA全血(抗凍劑) 低溫20/80C 1年/3年蛋白粗提物 低溫 70C 半年*白細(xì)胞可經(jīng)白細(xì)胞可經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化建立永生細(xì)胞株，皮膚成纖維細(xì)胞可培養(yǎng)永久保存無限擴(kuò)增轉(zhuǎn)化建立永生細(xì)胞株，皮膚成纖維細(xì)胞可培養(yǎng)永久保存無限擴(kuò)增2022-6-1058還有很重要的，樣本庫2022-6-10完整有用的樣本一定要有專業(yè)的數(shù)據(jù)庫：臨床和背景資料齊全臨床和背景資料齊全有編號、易檢索（條形碼有編號、易檢索（條形碼管理）管理）納入合適的樣本庫納入合適的樣本庫保存條件合格保存條件合格無降解無降解無污染無污染數(shù)據(jù)庫要素

35、：數(shù)據(jù)庫要素：病人一般資料病人一般資料 臨床特點(diǎn)臨床特點(diǎn)家族資料家族資料樣品管理樣品管理家系調(diào)查網(wǎng)絡(luò)組家系調(diào)查網(wǎng)絡(luò)組59構(gòu)成小型樣本庫的硬件和軟件構(gòu)成小型樣本庫的硬件和軟件每臺立式冰箱：1620個耐酸鋁架;20個蠟紙or塑料盒/架;99凍存管/盒=2592032400管標(biāo)本(3.5ml)條形碼打印機(jī)條形碼打印機(jī)耐低溫標(biāo)簽?zāi)偷蜏貥?biāo)簽掃碼槍掃碼槍2022-6-1060大型標(biāo)本庫的構(gòu)成與核心區(qū)域規(guī)劃：緩沖區(qū)核心：庫區(qū)監(jiān)控室樣本接收區(qū)樣本處理區(qū)輔助功能區(qū)：用品庫、辦公室、更衣室2022-6-106162是多功能的大型實(shí)驗(yàn)室：是多功能的大型實(shí)驗(yàn)室：研究研究教學(xué)教學(xué)臨床基因診斷標(biāo)本庫標(biāo)本庫實(shí)驗(yàn)中心大樓位于北大醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心大樓位于北大醫(yī)院門診南側(cè)門診南側(cè),7 層層, 面積面積7000m2Central laboratoryRese