原子力顯微鏡

1、原子力顯微鏡（AFM）1目錄AFM的成像原理AFM用于生命科學(xué)的優(yōu)勢與特點AFM在細胞生物學(xué)中的應(yīng)用AFM存在的問題AFM最近的研究進展總結(jié)與展望2一、AFM的成像原理原子力顯微鏡（Atomic Force Microscopy ，AFM），是掃描探針顯微鏡（Scanning Probe Microscopy）的一種。它將一個對微弱力非常敏感的微懸臂一端固定，另一端的微小針尖接近樣品并其相互作用，作用力將使得微懸臂發(fā)生形變或運動狀態(tài)發(fā)生變化。掃描樣品時，利用傳感器檢測這些變化，就可獲得作用力分布信息，從而以納米級分辨率獲得表面形貌結(jié)構(gòu)信息及表面粗糙度信息。3AFM的核心部分1.由針尖和微懸臂組

2、成的力傳感器 針尖和樣品之間的力F與微懸臂的形變d之間遵循胡克定律（Hooke Law）: F=-k d 其中，k為微懸臂的彈性系數(shù)，d為微懸臂的彎曲形變距離。 測定微懸臂形變量的大小，就可以獲得針尖與樣品之間作用力的大小。4AFM的核心部分2.監(jiān)測微懸臂彎曲變形的光電裝置5AFM的工作模式接觸模式（contact mode）非接觸模式（non-contact mode）輕敲模式（tapping mode）6AFM的工作模式幾種力同時作用于微懸臂7二、AFM用于生命科學(xué)的優(yōu)勢與特點樣品制備簡單，對樣品的破壞較其他技術(shù)（如電子顯微鏡）要小得多操作樣品時無須導(dǎo)電，無須低溫等真空條件能在多種環(huán)境中運

3、作，如空氣、液體等，可以對活細胞進行接近實時的觀察能提供生物分子的高分辨率三維圖像能以納米尺度的分辨率觀察局部電荷密度和物理特性，測量生物分子之間的作用力（如受體-配體）能對單細胞、單分子進行操作（如在細胞膜上打孔、切割染色體）可以與其他分析技術(shù)或顯微鏡互補8三、AFM在細胞生物學(xué)當(dāng)中的應(yīng)用AFM對細胞膜表面形態(tài)的研究AFM檢測細胞彈性以及力學(xué)性質(zhì)AFM檢測活細胞間相互作用AFM觀察動態(tài)生物過程AFM研究生物大分子之間相互作用AFM測定細胞電學(xué)性質(zhì)91、AFM對細胞膜表面形態(tài)的研究Braga PC;Ricci D Atomic force microscopy:Application to i

4、nvestigation of Escherichia coli morphology before and after exposure to cefodizime1998(01)Braga等在生理條件下觀察了大腸桿菌受抗生素作用后的形態(tài)變化。對大腸桿菌的外膜進行觀察，所獲得的AFM圖像清楚地顯示出在大腸桿菌的外膜上有突起，其中含有成百上千個脂多糖分子LPS，也許就是這些LPS斑有效地控制著革蘭氏陰性菌的外膜通透性。101、AFM對細胞膜表面形態(tài)的研究關(guān)維，紀曉龍，范麗娜，原子力顯微鏡對正常細胞、腫瘤細胞細胞膜表面形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察，中國實驗診斷學(xué)，2006,10（9）用2%的福爾馬林溶液和枸櫞

5、酸鹽緩沖液適制備AFM標本，觀察了人成纖維細胞（Fb cell），人宮頸癌細胞（Hela cell），人乳腺癌細胞（Mcf7 cell），人成纖細胞癌變細胞（Ma-Fb）。111、AFM對細胞膜表面形態(tài)的研究關(guān)維，紀曉龍，范麗娜，原子力顯微鏡對正常細胞、腫瘤細胞細胞膜表面形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察，中國實驗診斷學(xué)，2006,10（9）121、AFM對細胞膜表面形態(tài)的研究邢曉波，原子力顯微鏡研究不同刺激條件下T細胞的形態(tài)和生物力學(xué)特性，激光生物學(xué)報，2013,22(6)：496-504 （暨南大學(xué)）13靜息刺激處理后2、AFM檢測細胞彈性以及力學(xué)性質(zhì)細胞的納米機械性能結(jié)合其他生物物理特性(如形態(tài)學(xué)、表面圍觀

6、結(jié)構(gòu)和納米結(jié)構(gòu)等)，可對細胞健康與否進行定性甚至定量分析，如利用AFM測量出的細胞彈性性質(zhì)識別癌細胞，以及輔助診斷紅細胞相關(guān)的各種疾病。由于病變與細胞的形態(tài)和力學(xué)的性質(zhì)有關(guān)，利用原子力顯微鏡可以簡便迅速的獲取信息，從細胞層面上對各種疾病進行早期診斷和治療，因此AFM探究細胞彈性在病理學(xué)研究中起著非常重要的作用。142、AFM檢測細胞彈性以及力學(xué)性質(zhì)赫茲模型的理論公式15式中，F(xiàn)為記載在微懸臂上的力；E為楊氏模量；R為針尖的曲率半徑； 為泊松比，對于細胞類軟樣品取0.5；為下壓深度。2、AFM檢測細胞彈性以及力學(xué)性質(zhì)Yong-xia Ding, Yuan Cheng, Mechanical ch

7、aracterization of cervical squamous carcinoma cells by atomic force microscopy at nanoscale, Med Oncol, 2015, 32:71大量研究表明，腫瘤細胞與正常細胞的楊氏模量是不同的，這說明了楊氏模量可以作為一個新的腫瘤“標記”。高分辨率的成像技術(shù)如環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM）可以用來拍攝細胞表面的形態(tài)，來證明兩者的區(qū)別。162、AFM檢測細胞彈性以及力學(xué)性質(zhì)Cross SE, Jin YS, Rao J, Gimzewski JK. Nanomechanical analysis of cel

8、ls from cancer patients. Nat Nanotechnol. 2007;2:7803檢測了體外培養(yǎng)24小時的腫瘤細胞的模量，發(fā)現(xiàn)它們比正常細胞要柔軟70%。這些腫瘤細胞是從肺癌、乳腺癌和胰腺癌病人的胸膜積液中取的。Lekka M, Laidler P, Ignacak J, abedz M, Lekki J, Struszczyk H, Stachura Z, Hrynkiewicz AZ. The effect of chitosan on stiffness and glycolytic activity of human bladder cells. BBA-Mol

9、 Cell Res. 2001;1540:12736也發(fā)現(xiàn)人類膀胱上皮腫瘤細胞的硬度和可變形性比正常細胞有所下降。173、AFM檢測活細胞間相互作用將一種細胞連接在AFM掃描探針的尖端，使針尖功能化，對另一種單層排列的細胞進行掃描就可以進行細胞間相互作用的研究。Thie等利用AFM第一次界定了滋養(yǎng)細胞和子宮內(nèi)皮細胞間的相互作用。Thie M, Interactions between trophoblast and uterine epithelium:monitoring of adhesive forces, Hum.Reprod. (1998) 13 (11):3211-3219.183

10、、AFM檢測活細胞間相互作用Thie等利用AFM第一次界定了滋養(yǎng)細胞和子宮內(nèi)皮細胞間的相互作用。193、AFM檢測活細胞間相互作用Ramin Omidvar, Atomic force microscope-based single cell force spectroscopy of breast cancer cell lines: An approach for evaluating cellular invasion, Journal of Biomechanics 47(2014)33733379.檢測細胞間的局部剛度（local stiffness）20T47D細胞被附著在包被了伴

11、刀豆球蛋白A的微懸臂上4、AFM觀察動態(tài)生物過程AFM也是觀察細胞生物過程的非常有效的工具。Haeberle等用AFM記錄了單個病毒顆粒從被感染細胞中釋放的過程。Ohnesorge以類似的方法研究了痘病毒和活細胞，得到了痘病毒感染活細胞全過程的AFM圖。通過活著的細胞觀察子代病毒顆粒-并用AFM在水溶液環(huán)境中在分子水平分辯出有規(guī)則重復(fù)的烙鐵狀結(jié)構(gòu)(寬7-11nm長60-90nm,和準有序的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(直徑5-10nm)觀察中發(fā)現(xiàn)在感染前后最初幾小時,細胞并無顯著變化;子代病毒粒子沿細胞骨架進入細胞內(nèi)部,還發(fā)現(xiàn)了胞吐、病毒顆粒聚集等現(xiàn)象。2122234、AFM觀察動態(tài)生物過程Yamashita H

12、, Taoka A, Uchihashi T, et al. Single-molecule imaging on living bacterial cell surface by high-speed AFM. J Mol Biol 2012;422:300-9發(fā)現(xiàn)了趨磁細菌細胞表面的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，動力學(xué)圖像揭示了在小孔邊緣的顆粒是如何進出這些結(jié)構(gòu)的。第一次用AFM觀察到了活細胞表面的分子動力學(xué)，直接展示了孔蛋白類結(jié)構(gòu)在磁性顆粒穿過細胞膜的過程。244、AFM觀察動態(tài)生物過程Yokokawa M, Takeyasu K. Motion of the Ca2+-pump captured. FEB

13、S J2011;278:3025-31Yokokawa and Takeyasu將兔子肌肉中的鈣離子泵提純出來，放在云母板上的脂質(zhì)環(huán)境中，用fastXY模式來檢測鈣離子泵運動的動力學(xué)過程。他們發(fā)現(xiàn)這一過程受到鈣離子和ATP的共同影響。而且在一種鈣離子泵抑制劑毒胡蘿卜素的存在下，動力學(xué)過程被抑制。255、AFM觀察生物大分子之間相互作用Protein-protein interactionsYokokawa M, Wada C, Ando T, et al. Fast-scanning atomic force microscopy reveals the ATP/ADP-dependent c

14、onformational changes of GroEL. EMBO J 2006;25:4567-76研究了細胞內(nèi)與蛋白質(zhì)折疊的調(diào)節(jié)相關(guān)的分子伴侶的行為。GroEL是大腸桿菌中的一種分子伴侶，而GroES被稱為輔分子伴侶265、AFM觀察生物大分子之間相互作用Protein-protein interactionsYokokawa M, Wada C, Ando T, et al. Fast-scanning atomic force microscopy reveals the ATP/ADP-dependent conformational changes of GroEL. EMB

15、O J 2006;25:4567-76當(dāng)GroES與GroEL結(jié)合后，它誘導(dǎo)近端GroEL的一個構(gòu)型變化，增加中心空洞的體積。當(dāng)中心孔洞可以與不成熟蛋白接觸時，在ATP的存在下，我們可以由AFM成像看到GroEL形成的由閉合變成開啟的形式。AFM記錄的數(shù)據(jù)也可以清晰顯示出開啟形態(tài)的GroEL比閉合的有更高(taller)的結(jié)構(gòu)。275、AFM觀察生物大分子之間相互作用DNA-protein interactionsGilmore JL, Suzuki Y, Tamulaitis G, et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII prote

16、in complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochemistry 2009;48:10492-8每500ms拍攝一次，可以看出蛋白質(zhì)在DNA上的結(jié)合情況286、AFM測定細胞電學(xué)性質(zhì)在原子力顯微鏡系統(tǒng)中增加導(dǎo)電模塊，在細胞樣品和探針之間加一個偏壓，在掃描的過程中，同時獲得樣品的表面形貌和電流信息，且在成像的同時檢測探針和細胞樣品之間的電流。296、AFM測定細胞電學(xué)性質(zhì)意義：30四、AFM存在的問題1、定位精度不夠高作為主流納米位移驅(qū)動器的壓電陶瓷，存在著遲滯、蠕變等非線性因素導(dǎo)致定位準確性較差，尤其在高速成

17、像、掃描范圍較大時這些效應(yīng)更為明顯。31四、AFM存在的問題2、成像速度較慢由于逐點掃描成像的原理，AFM成像速度與傳統(tǒng)顯微鏡相比，大幅度下降。另一方面，AFM一般采用控制與成像算法尚未達到高速掃描的要求。因此，面對納米技術(shù)的蓬勃發(fā)展，如何提高成像速度，提升AFM的操作效率，就變成亟待解決的一個問題。32四、AFM存在的問題3、微懸臂漂移由于微懸臂本身在幾何結(jié)構(gòu)上的不對稱，以及bimorphic construction，在長時間持續(xù)掃描的情況下，會產(chǎn)生漂移。4、針尖尺寸針尖尺寸越小，表面形貌越不失真，但是尺寸約小，技術(shù)難度越大。越粗糙的樣品，受針尖尺寸的影響越大。33四、AFM存在的問題5、

18、分子固定技術(shù)研究動力學(xué)功能的時候，固定化就可能阻止了正常的生物活動。此外，這些過程的三維結(jié)構(gòu)很難被拍攝到。因此在動力學(xué)AFM研究中，固定分子的技術(shù)有著很大的講究，必須保證分子依然可以在空間上自由，保持接近生理學(xué)狀態(tài)。34五、AFM近年來的研究進展1、AFM與超分辨率顯微鏡結(jié)合Jenu Varghese Chacko, Benjamin Harke, Claudio Canale, and Alberto Diaspro. Cellular level nanomanipulation using atomic force microscope aided with superresolutio

19、n imaging. Journal of Biomedical Optics 19(10), 105003 (October 2014)SR超分辨率熒光顯微鏡已經(jīng)超越了傳統(tǒng)的熒光顯微鏡，它的橫向分辨率已經(jīng)可以達到納米級別。比如雙色受激發(fā)射損耗（STED）顯微鏡。把STED與AFM結(jié)合，STED共聚焦圖像相當(dāng)于用作AFM移動的地圖，讓AFM找到目標分子或者細胞。目前，也有”隨機光學(xué)重建顯微鏡”（STORM）與AFM配合的，可以達到單分子水平的圖像。35Suzuki, Y， High-speed atomic force microscopy combined with inverted opt

20、ical microscopy for studying cellular events，Scientific Reports, 3 : 2131 | DOI: 10.1038 JUL 4 2013最大的區(qū)別就是該課題組用的是固定在微懸臂上的探針探針在XY方向掃描 ,而不是樣品在XY方向掃描。這就意味著，樣品可以被放到透明的基底上，用熒光或者可見光去研究，用倒置的光學(xué)顯微鏡去看。36五、AFM近年來的研究進展2、高速AFM近年來采用響應(yīng)速度更快的壓電驅(qū)動器，來提升AFM的掃描速度。Georg Schitter通過重新設(shè)計掃描器結(jié)構(gòu)，從機械機構(gòu)上降低水平方向振動對豎直方向的耦合影響，進而提高了高

21、速掃描時的成像精度。日本金澤大學(xué)則使用三塊壓電陶瓷分別控制樣品臺三個方向上的運動，取代了運動耦合誤差較大的管式掃描器，實現(xiàn)了對活性蛋白的連續(xù)成像。37五、AFM近年來的研究進展3、解決微懸臂漂移問題紐約州立大學(xué)Chiara Spagnoli, Arthur Beyder, Stephen R. Besch, and Frederick Sachs，Drift-free atomic force microscopy measurements of cell height and mechanical properties. REVIEW OF SCIENTIFIC INSTRUMENTS 78

22、我們開發(fā)了一種軟件路徑，來消除微懸臂在持續(xù)掃描樣品獲得力對距離曲線的過程中產(chǎn)生的漂移。Stick-and-Move(SaM) Routine 首先掃描細胞表面的興趣位置，再掃描基底上的位置信號代表了兩個峰，一個是接觸基底，一個是接觸細胞。用Python語言進行數(shù)據(jù)分析之后，可以在細胞位置的峰上減去基底的峰。384、Long-Tip AFMShibata M, Long-tip high-speed atomic force microscopy for nanometer-scale imaging in live cells, Scientifc Reports, DOI: 10.1038 2015 Mar