NDDSChina2012生物制藥注射劑的開(kāi)發(fā)與確證-方偉杰

1、生物制藥注射劑的開(kāi)發(fā)與確證新型給藥系統(tǒng)中國(guó)峰會(huì)2012 2012.10.24方偉杰，博士海正藥業(yè)生物分析與制劑研究室主任Email: 主要內(nèi)容生物制藥的特性生物制劑的開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵因素物理、化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)物理、化學(xué)降解的作用機(jī)理及抑制制劑分析方法的開(kāi)發(fā)制劑破壞條件的選擇輔料的選擇和優(yōu)化海正藥業(yè)生物制劑的開(kāi)發(fā)實(shí)例：HS016總結(jié)生物制藥的特性由重組技術(shù)制備的生物制品如蛋白質(zhì)、單抗、疫苗等結(jié)構(gòu)，組分復(fù)雜蛋白質(zhì)大分子（5 -160 KDa）1,2,3 和4結(jié)構(gòu)復(fù)雜混合物，如翻譯后修飾等特異性：每個(gè)生物藥物有不同的性質(zhì)，如分子量、溶解度、pI、親水性、高級(jí)結(jié)構(gòu)、生物學(xué)性質(zhì)等化學(xué)和物理降解化學(xué)降解：涉及共

2、價(jià)鍵的斷裂和生成，比如脫酰胺化（deamidation），水解 （hydrolysis），氧化（oxidation）物理降解：不涉及共價(jià)鍵的斷裂和生成，主要是高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，包括吸附，變性 （去折疊），聚集和沉淀生物制藥的特性（二）免疫原性Immunogenicity所有生物制藥都有潛在的免疫原性！免疫反應(yīng)的頻率很多因素有關(guān)：氨基酸序列、質(zhì)量（如多聚體、糖基化）、病人狀況、給藥頻率、途徑產(chǎn)生的后果差異很大：安全性（如過(guò)敏反應(yīng)），療效（如產(chǎn)生中和抗體neutralization antibody），代謝等影響生物制藥穩(wěn)定性的因素 生物分子的結(jié)構(gòu)（氨基酸序列、翻譯后修飾，分子內(nèi)與分子間作用力）制劑

3、，如蛋白濃度，pH，輔料等生產(chǎn)設(shè)施、工藝/過(guò)程原材料，如輔料、包材的質(zhì)量等如何確定生物制劑？了解生物藥物的目標(biāo)產(chǎn)品性質(zhì) （Target Product Profile， TPP）了解物理、化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)及降解機(jī)理開(kāi)發(fā)有效的分析及穩(wěn)定性檢測(cè)方法鑒別出主要的降解條件運(yùn)用篩選（screening）和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DOE）的原理來(lái)評(píng)估制劑因素及它們之間的相互作用鑒別出候選制劑進(jìn)行全方位的研究并最終確定目標(biāo)產(chǎn)品性質(zhì)（TPP）給藥途徑（靜脈， 皮下，肌肉）劑型（水針、凍干）單次或者多次使用 (single-/multiple-dose)生物藥物的濃度治療指數(shù)、安全性大小給藥的頻率，是否需要在醫(yī)院使用市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)

4、的情況，新制劑的優(yōu)點(diǎn)生物藥物的物理、化學(xué)性質(zhì)物理、化學(xué)性質(zhì)可以通過(guò)軟件進(jìn)行初步估算Mw、溶解度、 pI、EC280、hydrophobicity、高級(jí)結(jié)構(gòu)等以往的經(jīng)驗(yàn)（如文獻(xiàn)、其他類似分子等）物理、化學(xué)性質(zhì)需要通過(guò)分析進(jìn)行確認(rèn)確認(rèn)上述基本信息熱穩(wěn)定性（Tm，Tagg等）多聚體翻譯后修飾（PTM）如糖基化，脫酰胺化等化學(xué)降解-脫酰胺化Deamidation天冬氨酸異天冬氨酸天冬酰胺琥珀酰亞胺化學(xué)降解-水解 Hydrolysis酸性裂解 Acidic cleavage (Asp-Pro)抗體Hinge部位裂解抑制脫酰胺化和水解反應(yīng)的方法凍干優(yōu)化pH，緩沖液種類和濃度增加物理/構(gòu)象穩(wěn)定性化學(xué)降解-氧

5、化 Oxidation主要在Met、Cys和芳香基氨基酸上，比如Tyr，Trp三大類型金屬離子催化氧化反應(yīng)自由基氧化反應(yīng)光催化氧化反應(yīng)抑制氧化反應(yīng)方法螯合劑（如EDTA）自由基清除劑/抗氧化劑 (如Met and Trp)避光保存排除氧氣增加物理穩(wěn)定性化學(xué)降解-其他類型N-端環(huán)化如pGlu和DKP反應(yīng)消旋化和 消除反應(yīng)（racimization，-elimination）還原性糖基化（glycation）二硫鍵錯(cuò)配（disulfide scrambling）化學(xué)性質(zhì)分析方法化學(xué)性質(zhì)化學(xué)性質(zhì)/ /降解降解途徑途徑分析方法分析方法分子量凝膠電泳（SDS-PAGE），質(zhì)譜（MS）氨基酸序列Edman

6、降解,LC-MS純度凝膠電泳（SDS-PAGE），反相色譜（RPC），分子排阻色譜（SEC），離子交換色譜（IEC），毛細(xì)管電泳（CE）電性分布及變化等點(diǎn)聚焦（IEF），IEC,CE脫酰胺化反應(yīng)IEC，RPC （多肽），LC-MS水裂解反應(yīng)RPC，SDS-PAGE，LC-MS氧化反應(yīng)RPC，肽圖，LC-MS共價(jià)鍵結(jié)合多聚體SDS-PAGE，MS物理降解：吸附在表面造成蛋白劑量的損失和構(gòu)型的改變液-固表面：吸附到包材的容器壁、膠塞液相柱子、過(guò)濾器冰-水表面外來(lái)異物，包材的滲出物等液-氣表面容器的空氣（headspace），震蕩、攪拌時(shí)與空氣的接觸物理降解：變性/去折疊 二級(jí)等高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化維持天

7、然結(jié)構(gòu)的重要性天然構(gòu)象是保持生物學(xué)活性的基礎(chǔ)變性蛋白更容易造成毒副作用如免疫原性變性以后容易發(fā)生聚集等后續(xù)反應(yīng)生物藥物構(gòu)象不穩(wěn)定性的根源變性所需要的能量很低(30kcal/mol)物理降解：聚集Aggregation蛋白質(zhì)分子通過(guò)相互作用聚集在一起蛋白變性（構(gòu)象改變）相互吸附（膠體不穩(wěn)定性）分類可逆/不可逆聚集（reversible/irreversible）類似天然構(gòu)象的聚集/完全變性的聚集（native-like？）共價(jià)結(jié)合/非共價(jià)結(jié)合聚集 covalent/non-covalent可溶性/不溶性聚集 soluble/insoluble (precipitation)可見(jiàn)與不可見(jiàn)微粒Vis

8、ible and sub-visible particles微粒的危害免疫反應(yīng)！死亡，產(chǎn)生中和抗體堵塞血管，降低療效，毒性微粒的分類外源性/非蛋白微粒蛋白聚集微粒微粒無(wú)處不在，每一步微粒無(wú)處不在，每一步操作操作都會(huì)產(chǎn)生都會(huì)產(chǎn)生/帶入微粒！帶入微粒！微粒的檢測(cè)肉眼外觀檢測(cè)光阻法 (Light obscuration）Micro-Flow Imaging （MFI）， Coulter counter動(dòng)態(tài)光散射（DLS），Nanosight， Affinity Biosensor， TEMCarpenter et al. J Pharm Sci, 2009, 27, 1201物理穩(wěn)定性影響因素加熱p

9、H, 鹽（疏水）表面震蕩, 剪切力光照凍融化學(xué)試劑 (金屬離子, 表面活性劑, 防腐劑, 有機(jī)溶劑等)物理穩(wěn)定性分析方法物理性質(zhì)物理性質(zhì)分析方法分析方法熱穩(wěn)定性Tm：DSC ，圓二色光譜（CD）/熒光Tagg：DLS構(gòu)象改變二級(jí)：遠(yuǎn)紫外圓二色光譜（Far-UV CD），紅外（IR） 三級(jí)：近紫外圓二色光譜（Near-UV CD），熒光（Fluorescence），2D-UV，NMR，X-ray可溶性聚集SEC，MALS-SEC，超高速離心儀（AUC）不溶性聚集（微粒）肉眼，光阻法，MFI，DLS增加物理穩(wěn)定性的方法增加蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象穩(wěn)定性加入 “選擇性排除 （preferentially e

10、xcluded）”的輔料，如糖類，氨基酸，PEG等加入與天然構(gòu)象結(jié)合的配體增加蛋白溶液的膠體穩(wěn)定性，如改變其表面的電性分布加入表面活性劑如吐溫20或80與蛋白競(jìng)爭(zhēng)表面吸附抑制蛋白-蛋白疏水基團(tuán)的相互作用生物制劑開(kāi)發(fā)的降解條件加熱 （25-40C ，小于Tm 10C以上）凍融 （Freeze-Thaw）光照 （Photo-degradation）震蕩 （Agitation）輔料的篩選原則：每個(gè)輔料及使用的量都要有明確被證明的作用！緩沖液，如磷酸、檸檬酸、組氨酸緩沖液表面活性劑，如吐溫20或80結(jié)構(gòu)保護(hù)劑，如糖類，氨基酸，PEG等等滲劑，如氯化鈉抗氧化劑，如EDTA，蛋氨酸配體，如金屬離子賦形劑，

11、如甘氨酸、甘露醇防腐劑，如苯甲醇海正生物制劑研發(fā)實(shí)例-HS016重組全人源化單克隆抗體治療人類自身免疫疾病原研藥在國(guó)際上的年銷售50億美元國(guó)內(nèi)還未有仿制藥上市水劑、預(yù)灌封注射器制劑前研究（Preformulation）原液儲(chǔ)存方法：冷凍（-80C）VS 低溫（5C）原液凍（-80C）、融（室溫）6次不影響質(zhì)量 低溫保存條件下有大量的多聚物產(chǎn)生pH和鹽濃度的影響最佳pH約為5.2-6.0左右鹽（NaCl）在原處方中只起到等滲劑的作用強(qiáng)氧化（H2O2）的影響強(qiáng)氧化劑不會(huì)對(duì)蛋白產(chǎn)生明顯的破壞：不需加入抗氧化劑或螯合劑制劑的優(yōu)化和確認(rèn)根據(jù)原研制劑和處方前的研究數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)常見(jiàn)保護(hù)劑的影響：多糖、氨基酸、

12、多元醇熱穩(wěn)定性：DSC、DLS強(qiáng)降解條件高溫、凍融、震蕩、光照降解產(chǎn)物分析純度：SEC，SDS-PAGE不溶性微粒：肉眼外觀、光阻法、MFI生物學(xué)活性原、新制劑熱穩(wěn)定性比較-TmDSC用于比較融化溫度（Tm）的差異處方處方T Tm1m1 （o oC C）T Tm2m2 （o oC C） T Tm3m3 （o oC C）原制劑74.2080.9686.14新制劑75.2381.7387.09融化溫度Tm是指50%分子發(fā)生變性的溫度，有三個(gè)數(shù)值說(shuō)明有三個(gè)主要變化區(qū)域原、新制劑熱穩(wěn)定性比較-TaggDLS比較開(kāi)始發(fā)生明顯聚集的溫度（Tagg）5.00 50.00 500.00 5000.00 500

13、00.00 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80粒徑大小粒徑大小(d.nm)(d.nm)溫溫 度度(oC )(oC )HS016制劑粒徑隨溫度變化結(jié)果HS016原制原制劑劑高溫加速穩(wěn)定性（40C, 2W） ：1、SEC新制劑要明顯好于原研制劑：?jiǎn)尉垠w和可溶性蛋白損失差別非常明顯SEC雜質(zhì)峰面積變化情況min510152025mAU0255075100125150175 VWD1 A, Wavelength=280 nm (D:HUMIRADATA20111017-01 2011-10-17 14-11-21201110170000007.D) Area: 1.49409 10.932 Area: 76.6074 13.797 Area: 6668.65 16.065 Area: 47.4998 19.8272、還原型SDS-PAGE主要產(chǎn)生分子量為20KDa和40KDa的雜質(zhì)新制劑的雜