NDDSChina2012生物制藥注射劑的開發(fā)與確證-方偉杰

1、生物制藥注射劑的開發(fā)與確證新型給藥系統(tǒng)中國峰會2012 2012.10.24方偉杰，博士海正藥業(yè)生物分析與制劑研究室主任Email: 主要內容生物制藥的特性生物制劑的開發(fā)的關鍵因素物理、化學、生物學性質物理、化學降解的作用機理及抑制制劑分析方法的開發(fā)制劑破壞條件的選擇輔料的選擇和優(yōu)化海正藥業(yè)生物制劑的開發(fā)實例：HS016總結生物制藥的特性由重組技術制備的生物制品如蛋白質、單抗、疫苗等結構，組分復雜蛋白質大分子（5 -160 KDa）1,2,3 和4結構復雜混合物，如翻譯后修飾等特異性：每個生物藥物有不同的性質，如分子量、溶解度、pI、親水性、高級結構、生物學性質等化學和物理降解化學降解：涉及共

2、價鍵的斷裂和生成，比如脫酰胺化（deamidation），水解 （hydrolysis），氧化（oxidation）物理降解：不涉及共價鍵的斷裂和生成，主要是高級結構的變化，包括吸附，變性 （去折疊），聚集和沉淀生物制藥的特性（二）免疫原性Immunogenicity所有生物制藥都有潛在的免疫原性！免疫反應的頻率很多因素有關：氨基酸序列、質量（如多聚體、糖基化）、病人狀況、給藥頻率、途徑產生的后果差異很大：安全性（如過敏反應），療效（如產生中和抗體neutralization antibody），代謝等影響生物制藥穩(wěn)定性的因素 生物分子的結構（氨基酸序列、翻譯后修飾，分子內與分子間作用力）制劑

3、，如蛋白濃度，pH，輔料等生產設施、工藝/過程原材料，如輔料、包材的質量等如何確定生物制劑？了解生物藥物的目標產品性質 （Target Product Profile， TPP）了解物理、化學、生物學性質及降解機理開發(fā)有效的分析及穩(wěn)定性檢測方法鑒別出主要的降解條件運用篩選（screening）和實驗設計（DOE）的原理來評估制劑因素及它們之間的相互作用鑒別出候選制劑進行全方位的研究并最終確定目標產品性質（TPP）給藥途徑（靜脈， 皮下，肌肉）劑型（水針、凍干）單次或者多次使用 (single-/multiple-dose)生物藥物的濃度治療指數(shù)、安全性大小給藥的頻率，是否需要在醫(yī)院使用市場競爭

4、的情況，新制劑的優(yōu)點生物藥物的物理、化學性質物理、化學性質可以通過軟件進行初步估算Mw、溶解度、 pI、EC280、hydrophobicity、高級結構等以往的經驗（如文獻、其他類似分子等）物理、化學性質需要通過分析進行確認確認上述基本信息熱穩(wěn)定性（Tm，Tagg等）多聚體翻譯后修飾（PTM）如糖基化，脫酰胺化等化學降解-脫酰胺化Deamidation天冬氨酸異天冬氨酸天冬酰胺琥珀酰亞胺化學降解-水解 Hydrolysis酸性裂解 Acidic cleavage (Asp-Pro)抗體Hinge部位裂解抑制脫酰胺化和水解反應的方法凍干優(yōu)化pH，緩沖液種類和濃度增加物理/構象穩(wěn)定性化學降解-氧

5、化 Oxidation主要在Met、Cys和芳香基氨基酸上，比如Tyr，Trp三大類型金屬離子催化氧化反應自由基氧化反應光催化氧化反應抑制氧化反應方法螯合劑（如EDTA）自由基清除劑/抗氧化劑 (如Met and Trp)避光保存排除氧氣增加物理穩(wěn)定性化學降解-其他類型N-端環(huán)化如pGlu和DKP反應消旋化和 消除反應（racimization，-elimination）還原性糖基化（glycation）二硫鍵錯配（disulfide scrambling）化學性質分析方法化學性質化學性質/ /降解降解途徑途徑分析方法分析方法分子量凝膠電泳（SDS-PAGE），質譜（MS）氨基酸序列Edman

6、降解,LC-MS純度凝膠電泳（SDS-PAGE），反相色譜（RPC），分子排阻色譜（SEC），離子交換色譜（IEC），毛細管電泳（CE）電性分布及變化等點聚焦（IEF），IEC,CE脫酰胺化反應IEC，RPC （多肽），LC-MS水裂解反應RPC，SDS-PAGE，LC-MS氧化反應RPC，肽圖，LC-MS共價鍵結合多聚體SDS-PAGE，MS物理降解：吸附在表面造成蛋白劑量的損失和構型的改變液-固表面：吸附到包材的容器壁、膠塞液相柱子、過濾器冰-水表面外來異物，包材的滲出物等液-氣表面容器的空氣（headspace），震蕩、攪拌時與空氣的接觸物理降解：變性/去折疊 二級等高級結構的變化維持天

7、然結構的重要性天然構象是保持生物學活性的基礎變性蛋白更容易造成毒副作用如免疫原性變性以后容易發(fā)生聚集等后續(xù)反應生物藥物構象不穩(wěn)定性的根源變性所需要的能量很低(30kcal/mol)物理降解：聚集Aggregation蛋白質分子通過相互作用聚集在一起蛋白變性（構象改變）相互吸附（膠體不穩(wěn)定性）分類可逆/不可逆聚集（reversible/irreversible）類似天然構象的聚集/完全變性的聚集（native-like？）共價結合/非共價結合聚集 covalent/non-covalent可溶性/不溶性聚集 soluble/insoluble (precipitation)可見與不可見微粒Vis

8、ible and sub-visible particles微粒的危害免疫反應！死亡，產生中和抗體堵塞血管，降低療效，毒性微粒的分類外源性/非蛋白微粒蛋白聚集微粒微粒無處不在，每一步微粒無處不在，每一步操作操作都會產生都會產生/帶入微粒！帶入微粒！微粒的檢測肉眼外觀檢測光阻法 (Light obscuration）Micro-Flow Imaging （MFI）， Coulter counter動態(tài)光散射（DLS），Nanosight， Affinity Biosensor， TEMCarpenter et al. J Pharm Sci, 2009, 27, 1201物理穩(wěn)定性影響因素加熱p

9、H, 鹽（疏水）表面震蕩, 剪切力光照凍融化學試劑 (金屬離子, 表面活性劑, 防腐劑, 有機溶劑等)物理穩(wěn)定性分析方法物理性質物理性質分析方法分析方法熱穩(wěn)定性Tm：DSC ，圓二色光譜（CD）/熒光Tagg：DLS構象改變二級：遠紫外圓二色光譜（Far-UV CD），紅外（IR） 三級：近紫外圓二色光譜（Near-UV CD），熒光（Fluorescence），2D-UV，NMR，X-ray可溶性聚集SEC，MALS-SEC，超高速離心儀（AUC）不溶性聚集（微粒）肉眼，光阻法，MFI，DLS增加物理穩(wěn)定性的方法增加蛋白質的天然構象穩(wěn)定性加入 “選擇性排除 （preferentially e

10、xcluded）”的輔料，如糖類，氨基酸，PEG等加入與天然構象結合的配體增加蛋白溶液的膠體穩(wěn)定性，如改變其表面的電性分布加入表面活性劑如吐溫20或80與蛋白競爭表面吸附抑制蛋白-蛋白疏水基團的相互作用生物制劑開發(fā)的降解條件加熱 （25-40C ，小于Tm 10C以上）凍融 （Freeze-Thaw）光照 （Photo-degradation）震蕩 （Agitation）輔料的篩選原則：每個輔料及使用的量都要有明確被證明的作用！緩沖液，如磷酸、檸檬酸、組氨酸緩沖液表面活性劑，如吐溫20或80結構保護劑，如糖類，氨基酸，PEG等等滲劑，如氯化鈉抗氧化劑，如EDTA，蛋氨酸配體，如金屬離子賦形劑，

11、如甘氨酸、甘露醇防腐劑，如苯甲醇海正生物制劑研發(fā)實例-HS016重組全人源化單克隆抗體治療人類自身免疫疾病原研藥在國際上的年銷售50億美元國內還未有仿制藥上市水劑、預灌封注射器制劑前研究（Preformulation）原液儲存方法：冷凍（-80C）VS 低溫（5C）原液凍（-80C）、融（室溫）6次不影響質量 低溫保存條件下有大量的多聚物產生pH和鹽濃度的影響最佳pH約為5.2-6.0左右鹽（NaCl）在原處方中只起到等滲劑的作用強氧化（H2O2）的影響強氧化劑不會對蛋白產生明顯的破壞：不需加入抗氧化劑或螯合劑制劑的優(yōu)化和確認根據(jù)原研制劑和處方前的研究數(shù)據(jù)為基礎常見保護劑的影響：多糖、氨基酸、

12、多元醇熱穩(wěn)定性：DSC、DLS強降解條件高溫、凍融、震蕩、光照降解產物分析純度：SEC，SDS-PAGE不溶性微粒：肉眼外觀、光阻法、MFI生物學活性原、新制劑熱穩(wěn)定性比較-TmDSC用于比較融化溫度（Tm）的差異處方處方T Tm1m1 （o oC C）T Tm2m2 （o oC C） T Tm3m3 （o oC C）原制劑74.2080.9686.14新制劑75.2381.7387.09融化溫度Tm是指50%分子發(fā)生變性的溫度，有三個數(shù)值說明有三個主要變化區(qū)域原、新制劑熱穩(wěn)定性比較-TaggDLS比較開始發(fā)生明顯聚集的溫度（Tagg）5.00 50.00 500.00 5000.00 500

13、00.00 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80粒徑大小粒徑大小(d.nm)(d.nm)溫溫 度度(oC )(oC )HS016制劑粒徑隨溫度變化結果HS016原制原制劑劑高溫加速穩(wěn)定性（40C, 2W） ：1、SEC新制劑要明顯好于原研制劑：單聚體和可溶性蛋白損失差別非常明顯SEC雜質峰面積變化情況min510152025mAU0255075100125150175 VWD1 A, Wavelength=280 nm (D:HUMIRADATA20111017-01 2011-10-17 14-11-21201110170000007.D) Area: 1.49409 10.932 Area: 76.6074 13.797 Area: 6668.65 16.065 Area: 47.4998 19.8272、還原型SDS-PAGE主要產生分子量為20KDa和40KDa的雜質新制劑的雜