放射免疫技術(shù)

1、第六章第六章 放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)第一節(jié)放射免疫技術(shù)第一節(jié)放射免疫技術(shù) 一、原理及分類一、原理及分類 二、常用的放射性核素二、常用的放射性核素 三、標記物制備及鑒定三、標記物制備及鑒定 四、抗血清鑒定四、抗血清鑒定第二節(jié)放射免疫分析第二節(jié)放射免疫分析 一、基本原理一、基本原理 二、實驗方法及測定二、實驗方法及測定第三節(jié)第三節(jié) 免疫放射分析免疫放射分析 一、基本原理一、基本原理 二、二、IRMAIRMA與與RIARIA的比較的比較思考題思考題小結(jié)小結(jié)免疫技術(shù)：免疫技術(shù)：以抗原以抗原- -抗體反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，抗體反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，對樣品中相應(yīng)抗原或抗體進行檢測。對樣品中相應(yīng)抗原或抗體進行檢測。標

2、記技術(shù)：標記技術(shù)：將可被探測的示蹤物質(zhì)用化學(xué)方將可被探測的示蹤物質(zhì)用化學(xué)方法與化合物連接。法與化合物連接。標記免疫分析：標記免疫分析：用可微量或超微量檢測的用可微量或超微量檢測的示蹤劑標記抗原、抗體，檢測免疫反應(yīng)結(jié)果并確示蹤劑標記抗原、抗體，檢測免疫反應(yīng)結(jié)果并確定待檢物。定待檢物。標記免疫技術(shù)基本概念標記免疫技術(shù)基本概念常見標記免疫技術(shù)常見標記免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 第一節(jié)第一節(jié) 放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)早期的放射免疫技術(shù)是基于競爭性結(jié)合反應(yīng)原理的早期的放射免疫技術(shù)是基于競爭性結(jié)合反應(yīng)原理的放射免疫分析放射免疫分析(RIA)(RIA)，稍后

3、又發(fā)展了非競爭性結(jié)合的，稍后又發(fā)展了非競爭性結(jié)合的免疫放射分析免疫放射分析(IRMA)(IRMA)。該類技術(shù)具有靈敏度高、特。該類技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好、樣品及試劑用量少、操作簡便異性強、重復(fù)性好、樣品及試劑用量少、操作簡便且易于標準化等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和且易于標準化等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷領(lǐng)域中各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥臨床診斷領(lǐng)域中各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥物和腫瘤標志物的定量分析，對相關(guān)學(xué)科的發(fā)展起物和腫瘤標志物的定量分析，對相關(guān)學(xué)科的發(fā)展起到了極大地推動作用。到了極大地推動作用。 放射免疫放射免疫RIARIA以標記抗原與反以標記抗原與反

4、應(yīng)系統(tǒng)中未標記應(yīng)系統(tǒng)中未標記抗原競爭結(jié)合特抗原競爭結(jié)合特異性抗體來測定異性抗體來測定待檢樣品中抗原待檢樣品中抗原量。量。 免疫放射免疫放射IRMAIRMA以過量標記抗體以過量標記抗體與抗原非競爭結(jié)與抗原非競爭結(jié)合，采用固相免合，采用固相免疫吸附載體分離疫吸附載體分離游離和結(jié)合標記游離和結(jié)合標記抗體?？贵w。放射受體分析放射受體分析RRARRA放射配體結(jié)合放射配體結(jié)合分析分析RBARBA其它其它一、放射免疫技術(shù)原理及分類一、放射免疫技術(shù)原理及分類二、放射免疫技術(shù)常用的放射性核素二、放射免疫技術(shù)常用的放射性核素 放射性核素是指在自然條件下可發(fā)生自發(fā)性的轉(zhuǎn)化，由一種放射性核素轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N放射性核素，并

5、同時釋放射線，放射性核素的這一轉(zhuǎn)變過程稱為放射性衰變。依衰變方式不同分為、 、三類。二、放射免疫技術(shù)常用的放射性核素二、放射免疫技術(shù)常用的放射性核素 125125I I 3 3H H 射線射線 理化性理化性 活潑活潑 差差核素豐度核素豐度 90% 90% 半衰期半衰期 60.2d 12.3y60.2d 12.3y標記方法標記方法 簡單簡單 復(fù)雜復(fù)雜標記設(shè)備標記設(shè)備 低廉低廉 昂貴昂貴測量條件測量條件 簡單簡單 復(fù)雜復(fù)雜常用標記核素125125碘碘- -標記物的制備標記標記物的制備標記125125I I- -化學(xué)或酶促反應(yīng)，將化學(xué)或酶促反應(yīng)，將放射性負電碘離子氧放射性負電碘離子氧化成碘原子或正電

6、碘化成碘原子或正電碘離子，通過取代反應(yīng)離子，通過取代反應(yīng)置換被標記物分子中置換被標記物分子中酪氨酸或酪胺殘基以酪氨酸或酪胺殘基以及組胺殘基上的氫原及組胺殘基上的氫原子。子。 125125I I或或125125I I+ +125125I-I-標記物標記物（混合物）（混合物）Ch-TCh-T、LPOLPO氧化氧化取代反應(yīng)取代反應(yīng)直接標記法直接標記法三、放射免疫技術(shù)標記物制備及鑒定使用無還原劑的高使用無還原劑的高比放射性碘源比放射性碘源被標記物用量要少被標記物用量要少ch-Tch-T用量要低用量要低控制總反應(yīng)體積控制總反應(yīng)體積200l200l反應(yīng)時間反應(yīng)時間1-21-2分鐘分鐘弱堿性反應(yīng)條件弱堿性反

7、應(yīng)條件 （7.4-7.67.4-7.6）間接標記法間接標記法聯(lián)接標記聯(lián)接標記( ( bolton-Hunter ) )預(yù)先將預(yù)先將125125I I用用ch-T法標記琥珀酰胺酯，制法標記琥珀酰胺酯，制成的成的125125I I 化脂功能基團可化脂功能基團可與蛋白分子上的氨基酸殘與蛋白分子上的氨基酸殘基反應(yīng)，從而使待標記物基反應(yīng)，從而使待標記物被碘化。被碘化。 bolton-Hunter125125碘碘- -標記物的制備純化標記物的制備純化凝膠過濾法凝膠過濾法離子交換層析法離子交換層析法 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 高效液相色譜法高效液相色譜法 聚合、聚合、損傷物損傷物 標記蛋白標記蛋

8、白游離游離125125I I125125碘碘- -標記物的制備鑒定標記物的制備鑒定 標記物質(zhì)量標記物質(zhì)量高比放射性高比放射性高純度高純度完整免疫活性完整免疫活性 放射化學(xué)純度放射化學(xué)純度單位標記物中結(jié)合于被標記單位標記物中結(jié)合于被標記物上的放射性占總放射性的百物上的放射性占總放射性的百分率分率應(yīng)大于應(yīng)大于95%95% 免疫活性免疫活性標記物與抗原或抗體反應(yīng)的能力標記物與抗原或抗體反應(yīng)的能力標記物與過量抗體反應(yīng)百分比標記物與過量抗體反應(yīng)百分比該值越大該值越大, , 標記物免疫活性好標記物免疫活性好（應(yīng)大于（應(yīng)大于80%80%） 比放射活性比放射活性單位質(zhì)量標記物中所單位質(zhì)量標記物中所含的放射性強

9、度。含的放射性強度。每分子抗原平均所結(jié)合每分子抗原平均所結(jié)合放射性原子數(shù)目。放射性原子數(shù)目。單位：單位：Ci/g Ci/g mCi/mg mCi/mg Ci/mmol Ci/mmol 比放射性過高，將影比放射性過高，將影響標記物免疫活性響標記物免疫活性 計算法：計算法：依據(jù)標記反應(yīng)中依據(jù)標記反應(yīng)中放射性核素的利用率（標記放射性核素的利用率（標記率）來計算標記物的比放射率）來計算標記物的比放射性性. .自身置換法自身置換法 ：比較標記抗：比較標記抗原與標準抗原的免疫活性來原與標準抗原的免疫活性來測定標記物的比放射性測定標記物的比放射性 結(jié)果準，結(jié)果準，測定復(fù)雜測定復(fù)雜比放射性計算法比放射性計算法

10、 結(jié)果結(jié)果欠欠準，準，計算計算簡便簡便 自身置換曲線自身置換曲線 反應(yīng)系統(tǒng)：限量Ab和遞增劑量(cpm)的標記抗原標記抗原的結(jié)合率(B/T%)隨標記抗原總量的增加而減少 標準曲線 反應(yīng)系統(tǒng):抗體（限量）、標記抗原（定量）和劑量遞增的標準品抗原組成 標記抗原與抗體的結(jié)合率(B/T%)隨標準抗原的增加而競爭抑制性減少 通過比較標記抗原與標準品抗原的免疫活性來測定標記物的比放射活性。比放射性自身置換法比放射性自身置換法 標準曲線與自身置換曲線平行標準曲線與自身置換曲線平行表明在相同的放射性結(jié)合水平上，二實驗中抗體上結(jié)合表明在相同的放射性結(jié)合水平上，二實驗中抗體上結(jié)合 的抗原物質(zhì)總量相同的抗原物質(zhì)總量

11、相同計算置換曲線平行段某結(jié)合率的放射性強度計算置換曲線平行段某結(jié)合率的放射性強度(cpm/ml(cpm/ml換算換算 為為nCi/ml) nCi/ml) 計算標準曲線平行段相應(yīng)結(jié)合率對應(yīng)的標準抗原化學(xué)量計算標準曲線平行段相應(yīng)結(jié)合率對應(yīng)的標準抗原化學(xué)量 (ng/ml)(ng/ml)以平行段多點結(jié)合率對應(yīng)的放射強度和標準抗原量進行直以平行段多點結(jié)合率對應(yīng)的放射強度和標準抗原量進行直 線回歸，其斜率即為比放射性線回歸，其斜率即為比放射性(nCi/ng)(nCi/ng)125125碘碘- -標記物的制備鑒定標記物的制備鑒定 標記物質(zhì)量標記物質(zhì)量高比放射性高比放射性高純度高純度完整免疫活性完整免疫活性

12、四、放射免疫技術(shù)抗血清鑒定四、放射免疫技術(shù)抗血清鑒定 抗體分子上一個抗原結(jié)合部抗體分子上一個抗原結(jié)合部位與相應(yīng)的抗原決定簇之間的位與相應(yīng)的抗原決定簇之間的結(jié)合強度結(jié)合強度用親和常數(shù)用親和常數(shù)KaKa表示。表示。單位為稀度單位（單位為稀度單位（LMLM-1-1）KaKa值高（值高（10109 91212L/molL/mol）有助）有助于提高靈敏度、精確度和準確于提高靈敏度、精確度和準確度度 親和性親和性親合力高親合力高親合力低親合力低放射免疫技術(shù)抗血清鑒定放射免疫技術(shù)抗血清鑒定特異性特異性: :指一種抗體識別相應(yīng)抗原決定簇的能力指一種抗體識別相應(yīng)抗原決定簇的能力交叉反應(yīng)率：交叉反應(yīng)率：將反應(yīng)的最

13、大結(jié)合率抑制下降將反應(yīng)的最大結(jié)合率抑制下降50%50% 時特異性抗原與類似物的劑量（時特異性抗原與類似物的劑量（ED50ED50）之比）之比抗體交叉反應(yīng)程度直接影響測定結(jié)果的準確性抗體交叉反應(yīng)程度直接影響測定結(jié)果的準確性 特異性特異性效價效價五、方法學(xué)評價五、方法學(xué)評價除了常規(guī)的靈敏度、精密度、準確性、除了常規(guī)的靈敏度、精密度、準確性、特異性和穩(wěn)定性之外，應(yīng)注意以下指標：特異性和穩(wěn)定性之外，應(yīng)注意以下指標：可靠性可靠性劑量劑量- -反應(yīng)曲線反應(yīng)曲線高劑量鉤狀效應(yīng)高劑量鉤狀效應(yīng)第第二節(jié)二節(jié) 放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析放射免疫分析RIARIA以標記抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標記抗原競爭以標記抗原

14、與反應(yīng)系統(tǒng)中未標記抗原競爭結(jié)合特異性抗體來測定待檢樣品中抗原量。結(jié)合特異性抗體來測定待檢樣品中抗原量。 一、放射免疫分析基本原理一、放射免疫分析基本原理競爭性結(jié)合反應(yīng)的經(jīng)競爭性結(jié)合反應(yīng)的經(jīng)典標記抗原（典標記抗原（AgAg* *）和）和非標記抗原（非標記抗原（AgAg）與限）與限量抗體量抗體(Ab)(Ab)競爭性結(jié)合競爭性結(jié)合AgAg* *和和AgAg具有等同的具有等同的與與AbAb結(jié)合能力結(jié)合能力AbAb限量，限量，AgAg* *定量定量, ,AgAg* *和和AgAg的量大于的量大于AbAb結(jié)合位點，二者結(jié)合位點，二者通過競爭方式與通過競爭方式與AbAb結(jié)合；隨著結(jié)合；隨著AgAg增加，增加

15、，AgAg* *與與AbAb結(jié)合形成結(jié)合形成AgAg* *AbAb復(fù)合物的放復(fù)合物的放射量降低射量降低, ,二者變化二者變化成函數(shù)關(guān)系。成函數(shù)關(guān)系。 以未結(jié)合的以未結(jié)合的AgAg* *為為F F，AgAg* *AbAb復(fù)合物復(fù)合物為為B B，則，則B/FB/F或或B/(BB/(BF)F)與與AgAg的的量變存在著函數(shù)量變存在著函數(shù)關(guān)系劑量反應(yīng)關(guān)系劑量反應(yīng)曲線曲線 注：注：T即是即是B與與F的總和的總和二、放射免疫分析實驗方法及測定二、放射免疫分析實驗方法及測定抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)AgAg* *AgAg反應(yīng)條件反應(yīng)條件體積體積溫度溫度時間時間pHpHAbAb( (標準標準Ag/Ag/樣品樣品

16、Ag)Ag)平衡平衡非平衡非平衡一步法一步法二步法二步法 實驗過程包括：抗原抗體反應(yīng)、分離結(jié)合標記物、放射性測定和數(shù)據(jù)處理等。分離結(jié)合、游離標記物分離結(jié)合、游離標記物二抗體沉淀法二抗體沉淀法 PEG PEG 沉淀法沉淀法 PR PR 試劑法試劑法 活性炭吸附法活性炭吸附法 分離徹底，迅速分離徹底，迅速分離試劑和過程不影分離試劑和過程不影響反應(yīng)平衡響反應(yīng)平衡效果不受反應(yīng)介質(zhì)影效果不受反應(yīng)介質(zhì)影響響 操作應(yīng)簡單、重復(fù)性操作應(yīng)簡單、重復(fù)性好好經(jīng)濟經(jīng)濟 只有將B和F分離，并測定其中一個組分（一般測量結(jié)合標記物），才能得到劑量反應(yīng)曲線。測量、數(shù)據(jù)處理測量、數(shù)據(jù)處理晶體閃爍計數(shù)器晶體閃爍計數(shù)器 包括了包括

17、了NaINaI閃爍晶閃爍晶 體、光電倍增管體、光電倍增管 以及計數(shù)器以及計數(shù)器測量的放射性信測量的放射性信 號是儀器輸出的號是儀器輸出的 電脈沖數(shù)：每分電脈沖數(shù)：每分 鐘計數(shù)鐘計數(shù)(cpm)(cpm) 計算計算 參數(shù)參數(shù)cpmcpmB/T (%)B/T (%)F/T (%)F/T (%)B/F (%)B/F (%)B/BB/B0 0 (%)(%)擬合擬合注：注：T T即是即是B B與與F F的總和的總和 定量的依據(jù)是用已知濃度的標準品抗原與測量的結(jié)合標記物的放射強度之間的函數(shù)關(guān)系。第第三節(jié)三節(jié) 免疫放射分析免疫放射分析一、免疫放射分析基本原理一、免疫放射分析基本原理以過量以過量125125I

18、I標記抗體與待測抗原進行非競爭標記抗體與待測抗原進行非競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)性免疫結(jié)合反應(yīng), , 用固相免疫吸附劑對用固相免疫吸附劑對B B或或F F進行分離，其靈敏度和可測范圍均優(yōu)于進行分離，其靈敏度和可測范圍均優(yōu)于RIARIA操作也較操作也較RIARIA簡單。簡單。 單位點單位點 IRMAIRMA先用先用與與待測抗原進行反應(yīng)，形成待測抗原進行反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物；用抗原抗體復(fù)合物；用結(jié)合未結(jié)合標記抗體結(jié)合未結(jié)合標記抗體并將其分離并將其分離, , 測定測定的放射量的放射量 雙位點雙位點 IRMAIRMA先用先用與抗原結(jié)與抗原結(jié)合，再用合，再用與抗原的另一決定與抗原的另一決定簇結(jié)合，形成簇結(jié)合

19、，形成復(fù)合物，復(fù)合物，洗棄剩余標記抗體，測洗棄剩余標記抗體，測固相上放射性。固相上放射性。 與放射免疫分析不同，免疫放射分析采用固相吸附分離方法。免疫放射技術(shù)一般以塑料（聚苯乙烯）試管作為反應(yīng)容器和固相吸附材料。聚苯乙烯能夠吸附蛋白質(zhì)（抗原或抗體）并保留原有結(jié)合抗原特性。當吸附特異性抗體與抗原發(fā)生反應(yīng)時于固相材料表面形成復(fù)合物，未結(jié)合物質(zhì)存在于液相中，將反應(yīng)液棄掉并洗滌即可達到分離目的。具有操作簡便、省時、無需離心步驟等優(yōu)點。分離結(jié)合、游離標記物分離結(jié)合、游離標記物對于雙抗體夾心法，用已知濃度系列標準品抗原進行反應(yīng)，以標準品抗原濃度為橫坐標，結(jié)合部分（B）放射性計數(shù)為縱坐標，獲得正向劑量反應(yīng)曲

20、線。測量、數(shù)據(jù)處理測量、數(shù)據(jù)處理二、IRMA與RIA比較RIAIRMA標記物標記物抗原抗原抗體抗體抗體用量抗體用量限量限量過量過量原理原理競爭性結(jié)合競爭性結(jié)合非競爭結(jié)合非競爭結(jié)合反應(yīng)體系反應(yīng)體系A(chǔ)g*Ag*、AgAg、AbAb固相固相 AbAb、Ab*Ab*、AgAg反 應(yīng)動 力 學(xué)反 應(yīng)動 力 學(xué)慢慢快快靈敏度靈敏度相對低相對低高高檢測范圍檢測范圍窄窄寬寬 1212 數(shù)量級數(shù)量級特異性特異性差（差（PcAbPcAb）優(yōu)（優(yōu)（McAbMcAb）標準曲線標準曲線結(jié)合率與測值成結(jié)合率與測值成反反比比結(jié)合率與測值成結(jié)合率與測值成正正比比應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍常用于常用于小分子小分子半抗原半抗原常用于大分子

21、蛋白質(zhì)或常用于大分子蛋白質(zhì)或多肽多肽放射免疫分析技術(shù)的靈敏度高、特異性強、放射免疫分析技術(shù)的靈敏度高、特異性強、精密度好精密度好, , 常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標志物和藥物等微量物質(zhì)的測定。腫瘤標志物和藥物等微量物質(zhì)的測定。但但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，試劑盒穩(wěn)定期不長等諸多不足試劑盒穩(wěn)定期不長等諸多不足, RIA, RIA將逐將逐漸被取代漸被取代。放射免疫分析技術(shù)的應(yīng)用放射免疫分析技術(shù)的應(yīng)用1.1.放射免疫技術(shù)的核心是什么？放射免疫技術(shù)的核心是什么？2.2.制備放射性制備放射性125125I I標記物的基本原理是什么？有哪些方法？標記物的基本原理是什么？有哪些方法？3.3.評價評價125125I I標記物質(zhì)量的指標有哪些？標記物質(zhì)量的指標有哪些？4.4.用于放射免疫技術(shù)的抗體應(yīng)滿足哪些質(zhì)量標準？用于放射免疫技術(shù)的抗體應(yīng)滿足哪些質(zhì)量標準？5.5.放免分析中標記放免分析中標記/ /未標記抗原、抗體的用量特點及與免疫復(fù)合物未標記抗原、抗