第三章上DNA復(fù)制+++1

1、 第三章：遺傳信息的復(fù)制第三章：遺傳信息的復(fù)制The Central Dogma轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄錄翻翻 譯譯逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)復(fù) 制制有絲分裂有絲分裂 細(xì)胞周期細(xì)胞周期（cell cycle） G1期期 S期期 間期間期（interphase） 細(xì)胞周期細(xì)胞周期 G2期期 前期前期 (prophase) M 期 中期中期 (metaphase) 后期后期 (anaphase) 末期末期 (telophase) 為什么還要學(xué)習(xí)為什么還要學(xué)習(xí)DNADNA的復(fù)制的復(fù)制?1,詳細(xì)探究詳細(xì)探究DNA復(fù)制的分子機(jī)制對(duì)認(rèn)識(shí)復(fù)制的分子機(jī)制對(duì)認(rèn)識(shí) 生命現(xiàn)象有重要的意義生命現(xiàn)象有重要的意義 人類(lèi)的壽命人類(lèi)的壽命,疾病疾病.2

2、, 基于復(fù)制原理發(fā)展的生物技術(shù)在工農(nóng)基于復(fù)制原理發(fā)展的生物技術(shù)在工農(nóng) 業(yè)上均發(fā)揮著重要的作用業(yè)上均發(fā)揮著重要的作用. 內(nèi)容提要： DNA的半保留復(fù)制與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì) DNA的復(fù)制過(guò)程（大腸桿菌為例） DNA復(fù)制的其它方式真核生物中DNA的復(fù)制特點(diǎn)基于復(fù)制原理的PCR技術(shù)DNA復(fù)制 第一部分第一部分 DNA半保留復(fù)制半保留復(fù)制DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)奠定了分子生物學(xué)的基礎(chǔ)雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)奠定了分子生物學(xué)的基礎(chǔ) DNA的復(fù)制的復(fù)制 由由Watson-CrickWatson-Crick模型預(yù)言的模型預(yù)言的DNADNA復(fù)制是半保留復(fù)制是半保留式的。式的。半保留復(fù)制（半保留復(fù)制（semiconser

3、vative semiconservative ReplicationReplication）：每個(gè)子代）：每個(gè)子代DNADNA分子含有一條舊分子含有一條舊鏈和一條新鏈。鏈和一條新鏈。半保留復(fù)制半保留復(fù)制Semiconservative Replication每個(gè)子代每個(gè)子代DNADNA分子含有一分子含有一條舊鏈和一條新鏈。條舊鏈和一條新鏈。DNA的復(fù)制的復(fù)制 DNA是遺傳物質(zhì)，作為遺傳物質(zhì)的首要條件是必須能自我復(fù)制。 Watson和Crick闡明的DNA模型預(yù)示了DNA具有復(fù)制的能力，通過(guò)氫鍵配對(duì)的方式復(fù)制新鏈。 曾設(shè)想有三種復(fù)制方式：（1）半保留式；（2）保留式；（3）分散式。 (1)+(

4、2)+(3)+曾設(shè)想有三種復(fù)制方式：保留式 ，半保留式，分散式1、定義：由親代DNA生成子代DNA時(shí)，每個(gè)新形成的子代DNA中，一條鏈來(lái)自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式稱半保留復(fù)制。DNA的半保留復(fù)制2、實(shí)驗(yàn)證據(jù)（1958 Messelson 和Stahl）： Matthew Messelson Franklin Stahl 1930.05.24 1929.10.08 Photograph taken by F. L. Holmes of Matt Meselson and Frank Stahl in 1996, standing at the site where the

5、y met at Woods Hole 42 years earlier. Meselson-stahl實(shí)驗(yàn)1958年，年，Meselson等證明等證明DNA的復(fù)制是半保留式的。的復(fù)制是半保留式的。1氯化銫超離心技術(shù)的原理 DNA在CsCl溶液中經(jīng)超速離心后，最終停留在某一位置上，這時(shí)離心力的大小正好等于DNA分子在CsCl梯度中的浮力。DNA的浮力是由其密度決定的。根據(jù)離心后DNA在梯度中達(dá)到的平衡位置的不同可以將不同密度的DNA分子分開(kāi)，例如：15NDNA和14NDNA。2將E.coli培養(yǎng)在含有“重”同位素15N的培養(yǎng)基中，經(jīng)多個(gè)世代后，細(xì)胞中DNA就標(biāo)記上“重”同位素。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)到1

6、4N培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)一個(gè)或兩個(gè)細(xì)胞分裂周期后，分離DNA，再進(jìn)行CsCl離心。3. 結(jié)果：經(jīng)一個(gè)世代后，DNA形成了一條中間密度帶。其位于“重”帶和“輕”帶之間。經(jīng)兩個(gè)世代培養(yǎng)后，DNA形成兩條帶，一條中間帶，一條輕帶。更直接的證據(jù)是將在14N中生長(zhǎng)一代的細(xì)胞DNA（15N14N）變性后離心，可以得到一條重帶和一條輕帶。說(shuō)明第一代雜種分子是半保留復(fù)制的產(chǎn)物。雙鏈中一條是親代15N，另一條是新合成14N，DNA為15N14N。Meselson-stahl實(shí)驗(yàn)T h e M e s e l s o n - S t a h l experiment Meselson-stahl實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋 將將H3

7、-胸苷標(biāo)記大腸桿菌胸苷標(biāo)記大腸桿菌DNA, 然后用溶菌酶把細(xì)胞臂消化掉然后用溶菌酶把細(xì)胞臂消化掉,使完使完整的整的DNA釋放出來(lái)釋放出來(lái),鋪在透析膜上鋪在透析膜上,通過(guò)放射自顯影的方法觀察通過(guò)放射自顯影的方法觀察DNA復(fù)制的狀態(tài)復(fù)制的狀態(tài),黑點(diǎn)的濃度和軌跡代表了黑點(diǎn)的濃度和軌跡代表了DNA分子的密度和形狀分子的密度和形狀.Cairns 復(fù)制復(fù)制-大腸桿菌復(fù)制的直接證據(jù)大腸桿菌復(fù)制的直接證據(jù)DNA復(fù)制的機(jī)制 其核心在于：DNA雙螺旋中的兩條鏈都攜帶相同的信息，其堿基對(duì)是互補(bǔ)的； 因此，在復(fù)制過(guò)程中兩條親代鏈分離，分別作為模板引導(dǎo)酶催化的新生互補(bǔ)子鏈的合成，并遵循標(biāo)準(zhǔn)的堿基配對(duì)原則，兩條新生雙鏈在

8、細(xì)胞分裂時(shí)分別進(jìn)入兩個(gè)子細(xì)胞； DNA復(fù)制的復(fù)雜性復(fù)制的復(fù)雜性1, DNA分子復(fù)制中的幾何學(xué)問(wèn)題分子復(fù)制中的幾何學(xué)問(wèn)題2, 雙螺旋鏈的解開(kāi)雙螺旋鏈的解開(kāi)?3, 一種酶僅能催化有限的化學(xué)反應(yīng)一種酶僅能催化有限的化學(xué)反應(yīng)4, 復(fù)制過(guò)程中的錯(cuò)誤的糾正復(fù)制過(guò)程中的錯(cuò)誤的糾正?5, 不同生物不同生物DNA復(fù)制的方式及過(guò)程復(fù)制的方式及過(guò)程? 第二部分第二部分與與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)(一一) 引子引子:DNA分子復(fù)制中的幾何學(xué)問(wèn)題分子復(fù)制中的幾何學(xué)問(wèn)題基因組超螺旋 電鏡結(jié)構(gòu)顯示，就整體而言，大腸桿菌的基因組是由大量超螺旋的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的原核生物基因組結(jié)構(gòu)原核生物基因組結(jié)構(gòu)6.8:140:1100

9、0:18000:1DNA double helixNucleosome (10 nm fiber)30 nm FiberLoops ILoops IIchromosomeDNA分子復(fù)制過(guò)程的幾何學(xué)分子復(fù)制過(guò)程的幾何學(xué)線狀DNA形成的超螺旋環(huán)狀DNA形成的超螺旋DNA扭曲與雙螺旋相同（擰緊）DNA扭曲與雙螺旋相反（松開(kāi)）負(fù)超螺旋松弛DNA正超螺旋 大多數(shù)天然大多數(shù)天然DNA 都具有負(fù)超螺旋都具有負(fù)超螺旋,在復(fù)制的開(kāi)始階段可在復(fù)制的開(kāi)始階段可以緩解由于以緩解由于DNA復(fù)制而造成的超纏現(xiàn)象復(fù)制而造成的超纏現(xiàn)象,當(dāng)原有的負(fù)超螺旋當(dāng)原有的負(fù)超螺旋用完時(shí)用完時(shí)(5%),就需要引入新的負(fù)超螺旋就需要引入新的

10、負(fù)超螺旋,以緩解復(fù)制的阻力以緩解復(fù)制的阻力.拓?fù)洚悩?gòu)體及拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)體：給定連接數(shù)的DNA分子。拓?fù)洚悩?gòu)酶：I型和II型、DNA促旋酶（ATP）。 Action of a type I topoisomerase. Action of a type II topoisomerase. 每一次反應(yīng)可以引入兩個(gè)負(fù)超螺旋每一次反應(yīng)可以引入兩個(gè)負(fù)超螺旋（二）與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)1、原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、 dCTP、dTTP)2、模板：以DNA的兩條鏈為模板鏈，合成子代DNA3、引物：DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物4、引物合成酶（引發(fā)酶）：此酶以DNA為模板合成一段

11、RNA,這段RNA作為合成DNA的引物。實(shí)質(zhì)是以DNA為模板的RNA聚合酶。 5、DNA聚合酶:以DNA為模板的DNA合成酶以四種脫氧核苷酸三磷酸為底物反應(yīng)需要有模板的指導(dǎo)反應(yīng)需要有3-OH存在DNA鏈的合成方向?yàn)? 3DNADNA聚合酶的分類(lèi)聚合酶的分類(lèi)原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶：DNA-pol （1958，Arthur Kornberg）DNA-pol (1971, Thomas Kornberg）DNA-pol (1972, Thomas Kornberg）He was the first to identify the enzyme catalyzing the sy

12、nthesis of DNA, polymerase I. In recognition of their work elucidating the basic mechanisms of DNA replication, they were awarded the Nobel Prize in 1959. Arthur Kornberg (1918 - 2007) His father is Arthur Kornberg (1918-2007), winner of the 1959 Nobel Prize in Medicine, and his older brother is Rog

13、er D. Kornberg (born 1947), winner of the 2006 Nobel Prize in Chemistry.科恩伯格的長(zhǎng)子羅杰科恩伯格子承父業(yè)，也在基因研究領(lǐng)域取得卓越成績(jī)。2006年12月，羅杰科恩伯格憑借在“真核轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)”研究領(lǐng)域的貢獻(xiàn)，獨(dú)享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 Thomas Kornberg born 1948 對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。DNA-pol 323323個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段 / Klenow 片段片段

14、 604604個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸 DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA聚合酶的功能 1. 53聚合功能 2. 35外切活性 3. 53外切活性 (1)切口平移切口平移（nick translation）； (2)鏈的置換鏈的置換； (3)模板轉(zhuǎn)換模板轉(zhuǎn)換（template-switching） 4. 內(nèi)切酶活性 5 3 G T A A G T C G C T C A G C 5 3 35外切 核 酸酶水解部位圖11-20 DNA 聚合酶的35外切酶活性 (仿D.Freifelder: MOLECULAR BIOLOGY 1983,

15、Fig.8-16) 3 5 G G A C A A G A G A C G T T C T 5 3 內(nèi)切酸酶水解部位 圖11-22 DNA 聚合酶的內(nèi)切酸活性 (仿D.Freifelder: MOLECULAR BIOLOGY 1983,Fig.8-20) 5 5 3-OH 5-P -OH 5-P 3 5 5 3 3 5 5 缺口平移缺口平移 鏈的置換鏈的置換 模板轉(zhuǎn)換模板轉(zhuǎn)換 5 5 3 5 5 3 5 5 3 55 3 3 55 3 55 3 55 (a) (b) (c) (a) (b) (c) 圖 12-21 DNA 聚合酶53外切活性的功能核酸必須有核酸必須有5磷酸末端磷酸末端,且已經(jīng)

16、正確配對(duì)且已經(jīng)正確配對(duì),以一以一個(gè)接一個(gè)的方式去除個(gè)接一個(gè)的方式去除,可以是可以是DNA, 也可以是也可以是RNA.在復(fù)制延長(zhǎng)過(guò)程中在復(fù)制延長(zhǎng)過(guò)程中 真正催化真正催化新鏈核苷酸聚合的酶新鏈核苷酸聚合的酶DNA-pol 性質(zhì) 聚合酶聚合酶 聚合酶3 5外切活性+ + + +5 3外切活性+-5 3聚合活性+ 中+ 很低+ 很高新生鏈合成-+主要是對(duì)主要是對(duì)DNADNA損傷的修損傷的修復(fù)；以及在復(fù)；以及在DNADNA復(fù)制時(shí)復(fù)制時(shí)切除切除RNARNA引物并填補(bǔ)其引物并填補(bǔ)其留下的空隙。留下的空隙。修復(fù)紫外修復(fù)紫外光引起的光引起的DNADNA損傷損傷DNA DNA 復(fù)制的主要復(fù)制的主要聚合酶，還具有聚

17、合酶，還具有3-53-5外切酶的外切酶的校對(duì)功能，提高校對(duì)功能，提高DNADNA復(fù)制的保真性復(fù)制的保真性原核生物中的DNA聚合酶(大腸桿菌） 6、DNA連接酶（1967年發(fā)現(xiàn)）：若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。 但是它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來(lái) DNA連接酶連接酶在在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過(guò)程中起重要作用重組等過(guò)程中起重要作用3535OHOHP P7、DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNA Topisomerase)： 拓?fù)洚悩?gòu)酶：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負(fù)超螺旋。主要集中在活性

18、轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。例：大腸桿菌中的蛋白 拓?fù)洚悩?gòu)酶：該酶能暫時(shí)性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負(fù)超螺旋引入DNA分子。同復(fù)制有關(guān)。 例：大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶8、DNA 解螺旋酶/解鏈酶（DNA helicase) 通過(guò)水解ATP獲得能量來(lái)解開(kāi)雙鏈DNA。 E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。reprep蛋白沿蛋白沿3355移動(dòng)，而解螺旋酶移動(dòng)，而解螺旋酶I I、IIII、IIIIII沿沿5533移動(dòng)。移動(dòng)。9、單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白(SSBP-single-strand binding protein)：穩(wěn)定已被解開(kāi)的穩(wěn)定已被解開(kāi)的DNA單單鏈，

19、阻止復(fù)性和保護(hù)單鏈不被核酸酶降解。鏈，阻止復(fù)性和保護(hù)單鏈不被核酸酶降解。第三部分:DNA的復(fù)制過(guò)程（大腸桿菌為例） 雙鏈的解開(kāi)雙鏈的解開(kāi) RNARNA引物的合成引物的合成 DNADNA鏈的延伸鏈的延伸 切除切除RNARNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的 DNADNA片段片段 DNA的復(fù)制有特定的起始位點(diǎn)，常包含富含A、T的區(qū)段叫做復(fù)制原點(diǎn)。 復(fù)制原點(diǎn)常用ori(或o）表示。基本概念：復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）富含AT的3個(gè)13bp的串聯(lián)重復(fù)序列，這可能和雙鏈易于解開(kāi)起始復(fù)制有關(guān)；（2）具有4個(gè)9bp的反向重復(fù)順序，作為蛋白結(jié)合位點(diǎn)；1 1、復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)（E E.

20、coli-oriC:245bp.coli-oriC:245bp） GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATTACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245串聯(lián)重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列5 3 5 3 雙鏈解開(kāi)、復(fù)制起始 DnaADnaA蛋白辨認(rèn)起始點(diǎn)蛋白辨認(rèn)起始點(diǎn), , 形成起始復(fù)合物形成起始復(fù)合物, , HU HU蛋白促進(jìn)

21、起始蛋白促進(jìn)起始; ;b) DnaBb) DnaB蛋白解螺旋蛋白解螺旋, DnaC, DnaC蛋白協(xié)助蛋白協(xié)助DnaB;DnaB;1,1,雙鏈的解開(kāi)雙鏈的解開(kāi): : 在多種蛋白質(zhì)參與下，在多種蛋白質(zhì)參與下，DNADNA解開(kāi)成單鏈（包括解開(kāi)成單鏈（包括RNARNA聚合酶，協(xié)助聚合酶，協(xié)助DNADNA雙鏈的解開(kāi)）雙鏈的解開(kāi)）c) SSBc) SSB維持單鏈穩(wěn)定維持單鏈穩(wěn)定; ;大腸桿菌DNA的復(fù)制過(guò)程大約20個(gè)DnaA蛋白在ATP的作用下與oriC處的4個(gè)9bp保守序列相結(jié)合在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna復(fù)制起始復(fù)合物使3個(gè)13bp直接重復(fù)序列變性,形成開(kāi)鏈解鏈酶六體分別與單鏈DNA相結(jié)合

22、(需DnaC幫助),進(jìn)一步解開(kāi)DNA雙鏈2 2、RNARNA引物的合成引物的合成DnaB蛋白活化引物合成酶DnaG ，引發(fā)RNA引物的合成。引物長(zhǎng)度約為幾個(gè)至10個(gè)核苷酸。引物合成引物合成Dna ADna B、 Dna CDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶引物酶OHSSB3 5 3 5 DNA的半不連續(xù)復(fù)制DNA:復(fù)制時(shí)其中一條子鏈的合成是連續(xù)的，而另一條子鏈的合成是不連續(xù)的，故稱半不連續(xù)復(fù)制。在DNA復(fù)制時(shí)，合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向一致并連續(xù)合成的鏈為前導(dǎo)鏈；合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相反，形成許多不連續(xù)的片段，最后再連成一條完整的DNA鏈為滯后鏈。3 3、DNADNA鏈的延伸鏈的延伸 在D

23、NA復(fù)制過(guò)程中，前導(dǎo)鏈能連續(xù)合成，而滯后鏈只能是斷續(xù)的合成53 的多個(gè)短片段，這些不連續(xù)的小片段稱為岡崎片段。 由于DNA兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，DNA聚合酶只能夠沿5-3的方向合成子代DNA鏈，在一個(gè)復(fù)制體中，會(huì)出現(xiàn)前導(dǎo)鏈和滯后鏈背道而馳的情況。 在上世紀(jì)60年代，是否有3 -5的方向的DNA聚合酶？ 沒(méi)有找到！ 其他合成機(jī)制？分子生物學(xué)家的困惑： 1968年，岡崎（Okazaki）及其同事進(jìn)行了兩組實(shí)驗(yàn)第一組實(shí)驗(yàn)是脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌（T4噬菌體）為材料，在培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基中加入同位素3H標(biāo)記的dTTP，經(jīng)30秒后，DNA開(kāi)始復(fù)制，分離DNA，然后在堿中沉淀，變性，讓新合成的單鏈和

24、模板鏈分開(kāi)，再用蔗糖密度梯度離心，以沉降的快慢來(lái)確定片段的大小，再檢測(cè)放射性標(biāo)記，結(jié)果表明被3H標(biāo)記的片段，也就是新合成的片段，沉淀系數(shù)為20S左右，即都是長(zhǎng)1000-2000bp的DNA片段；第二組實(shí)驗(yàn)是脈沖追逐實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菣z測(cè)早期合成的DNA片段是依然如原來(lái)的短片段，還是連接成了長(zhǎng)片段。 這個(gè)實(shí)驗(yàn)是先進(jìn)行標(biāo)記培養(yǎng)30秒，以后除去同位素繼續(xù)培養(yǎng)幾分鐘，再分離DNA在堿中沉淀，檢測(cè)結(jié)果。先合成的（帶標(biāo)記）的DNA不再是短片段，而和總DNA的情況相似，沉淀系數(shù)為70-120S較長(zhǎng)的片段，這意味著剛開(kāi)始合成的片段都是短片段，以后再連接成長(zhǎng)片段，人們就把最初合成的短片段稱為岡崎片段。 1968年，岡崎提出了半不連續(xù)（semidiscontinuous）復(fù)制模型，也就是說(shuō)前導(dǎo)鏈上的合成是連續(xù)的，只有后滯鏈上的合成才是半連續(xù)的。岡崎實(shí)驗(yàn)示意圖 DNA DNA聚合酶催化游離的脫氧核苷酸結(jié)合聚合酶催化游離的脫氧核苷酸結(jié)合到新鏈到新鏈33末端，使其不斷延長(zhǎng)。末端，使其不斷延長(zhǎng)。 5 5 3 35 5DNA-polDNA-pol DNA-polDNA-pol復(fù)制延長(zhǎng)的過(guò)程復(fù)制延長(zhǎng)的過(guò)程dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTP前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈 (leading strandleading strand) 順著解鏈方向生成的子鏈，其復(fù)制是連續(xù)順著解鏈方向生