實驗五 酶聯(lián)免疫吸附試驗

1、1微生物學實驗微生物學實驗實驗五實驗五酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗 ELISA 病原生物學免疫學實驗室病原生物學免疫學實驗室2 一、實驗目的一、實驗目的1 1、了解、了解ELISA-HBsAgELISA-HBsAg的檢測原理的檢測原理2 2、掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗的操作方法、掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗的操作方法3二、實驗標本及器材二、實驗標本及器材乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒4三、實驗原理三、實驗原理o乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒采用雙抗體夾心乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒采用雙抗體夾心法檢測法檢測HBsAg，采用抗，采用抗-HBs包被板條，用包被板條，用HRP標

2、記的抗標記的抗-HBs為酶標記物，以四甲基聯(lián)苯胺為酶標記物，以四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和過氧化物為底物。當標本中存在）和過氧化物為底物。當標本中存在HBsAg時，該時，該HBsAg與包被抗與包被抗-HBs結合并與抗結合并與抗-HBs-HRP結合形成抗結合形成抗-HBs- HBsAg-抗抗-HBs-HRP復合物，加入復合物，加入TMB底物產生顯色反應。底物產生顯色反應。在實驗結束時，有顏色變化的提示有在實驗結束時，有顏色變化的提示有HBsAg存在，存在，無顏色或顏色變化微弱的則提示不存在無顏色或顏色變化微弱的則提示不存在HBsAg。5三、實驗原理三、實驗原理6三、實驗原理三、實驗原理7四、實驗步驟

3、四、實驗步驟o1、實驗準備：從冷藏環(huán)境中取出試劑盒，、實驗準備：從冷藏環(huán)境中取出試劑盒，在室溫下平衡在室溫下平衡30分鐘，同時將濃縮洗滌液分鐘，同時將濃縮洗滌液做做1比比20稀釋。稀釋。o2、加待測標本：設陰性、陽性對照各一孔，、加待測標本：設陰性、陽性對照各一孔，分別加入陰性、陽性對照分別加入陰性、陽性對照0.1毫升，空白對毫升，空白對照一孔，其余各孔加入待測標本照一孔，其余各孔加入待測標本0.1毫升。毫升。o3、加酶結合物：每孔、加酶結合物：每孔0.1毫升，空白對照毫升，空白對照孔不加，充分混勻，孔不加，充分混勻，37攝氏度溫育攝氏度溫育30分鐘。分鐘。8四、實驗步驟四、實驗步驟o4、洗板

4、：棄去反應孔板內液體，在吸水紙、洗板：棄去反應孔板內液體，在吸水紙上拍干，用洗滌液注滿每孔，靜置上拍干，用洗滌液注滿每孔，靜置5至至10秒，秒，棄去孔內洗滌液，拍干，如此反復棄去孔內洗滌液，拍干，如此反復5次，拍次，拍干。干。o5、加顯色劑：先加顯色劑、加顯色劑：先加顯色劑A，每孔，每孔0.05毫毫升，再加顯色劑升，再加顯色劑B，每孔，每孔0.05毫升，充分毫升，充分混勻，置混勻，置37攝氏度溫育攝氏度溫育15分鐘。分鐘。o6、終止反應：每孔加入終止液、終止反應：每孔加入終止液0.05毫升，毫升，混勻?；靹?。9五、實驗結果五、實驗結果10六、注意事項六、注意事項o1、洗板至關重要，應避免洗滌液過量，又、洗板至關重要，應避免洗滌液過量，又能充滿反應微孔，洗板次數不應少于能充滿反應微孔，洗板次數不應少于5次。次。o2、如任何試劑接觸皮膚和眼睛，應用大量、如任何試劑接觸皮膚和眼睛，