免疫組織化學(xué)講義xin

1、組織學(xué)病理學(xué)技術(shù)與免疫組織化學(xué)課程 任課教師：張雷 學(xué)時(shí)數(shù)：20一 光鏡組織病理切片技術(shù)(6學(xué)時(shí))（1） 取材注意事項(xiàng)及組織固定法（2） 制片方法：石蠟切片、冰凍切片、鋪片、磨片（3） HE染色及特殊染色方法二 組織化學(xué)技術(shù)（4學(xué)時(shí)）（1） 固定與制片（2） 蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)及核酸組織化學(xué)反應(yīng)（3） 酶組織化學(xué)三 免疫組織化學(xué)技術(shù)（10學(xué)時(shí)）（1） 免疫學(xué)及免疫組織化學(xué)的原理和基本技術(shù)（2） 常用免疫組織化學(xué)方法（3） 免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（4） 免疫電鏡技術(shù)（5） 原位雜交組織化學(xué)（6） 細(xì)胞凋亡的過程及相關(guān)因素（7） 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定及圖象分析（8） 顯微照相第一章概論病理學(xué)經(jīng)歷了大體

2、器官病理學(xué)、細(xì)胞病理學(xué)、超微病理學(xué)、免疫病理學(xué)和分子病理學(xué)的發(fā)展階段，正在向21世紀(jì)的信息病理學(xué)前進(jìn)。國(guó)際著名病理學(xué)家Karl lennert教授有句名言：“技術(shù)是病理學(xué)之母”?；仡欉^去病理學(xué)的重大發(fā)展，無一不是新技術(shù)的發(fā)明與應(yīng)用的結(jié)果。正如程大民院士指出的那樣：“病理學(xué)的理論和技術(shù)被視為一輛車的兩個(gè)車輪，缺一不可，互為依存，互相促進(jìn)，兩者的結(jié)合決定著病理學(xué)的發(fā)展?！辈±韺W(xué)技術(shù)包括傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)和現(xiàn)代新技術(shù)，傳統(tǒng)的formalin固定，石蠟切片和HE染色技術(shù)仍然是病理學(xué)的基本技術(shù)，大量應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床病理學(xué)日常工作中，保證和提高常規(guī)技術(shù)質(zhì)量和現(xiàn)代設(shè)備水平十分重要。從傳統(tǒng)病理學(xué)發(fā)展的經(jīng)驗(yàn)看，器官

3、病理學(xué)、細(xì)胞病理學(xué)以及超微病理學(xué)基本都屬于形態(tài)學(xué)。免疫細(xì)胞化學(xué)雖然是形態(tài)、代謝及功能的三位一體的方法，也基本以形態(tài)為主，反映一定代謝及功能狀態(tài)。特別在方法上與傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)：包埋、制片、染色基本一致，所以免疫熒光技術(shù)雖由微生物學(xué)家開端，但很快就在病理學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用。分子生物學(xué)技術(shù)向分子病理學(xué)技術(shù)的發(fā)展是“直通車”。其中形態(tài)學(xué)部分，如分子雜文、原位來交、原位PCR、末端標(biāo)記、染色體的變化等，也是由于與傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)密切結(jié)合，不但在病理學(xué)研究中，而已在臨床病理診斷中迅速得到了應(yīng)用。此外，目前關(guān)于分子病理學(xué)工作，除了病理學(xué)家外，分子生物學(xué)家、生物學(xué)家、遺傳學(xué)家甚至臨床學(xué)家都在進(jìn)行研究。所以分子病

4、理學(xué)在醫(yī)學(xué)專業(yè)教學(xué)中應(yīng)該怎樣劃歸，在醫(yī)院工作中如何歸等，都將可能是面臨的實(shí)際問題。第一章 病理切片技術(shù)：大生物學(xué)標(biāo)本或醫(yī)學(xué)標(biāo)本在生活狀態(tài)下多為無色透明，而且組織一旦離開機(jī)體后很快就會(huì)死亡，其結(jié)構(gòu)就會(huì)失去正常狀態(tài)。所以必須對(duì)組織采取固定、切片、和染色措施，由于組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的不同，在嗜色性能上各有所異，光波通過時(shí)，又由于不同顏色再吸收程度上的不同，因此在顯微鏡下呈現(xiàn)不同的折射率，也就是說經(jīng)過固定和染色后，光波通過這些被檢組織成分時(shí)，波長(zhǎng)和振幅發(fā)生改變，所以在顯微鏡下才能清晰的觀察其組織結(jié)構(gòu)，我們稱之為組織制片技術(shù)。組織制片技術(shù)的應(yīng)用，從1665年HOOK發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始，以有300多年的歷史。最早應(yīng)用

5、冰凍切片；隨后又進(jìn)一步利用石蠟的硬度，以石蠟包埋組織，制成石蠟切片，后來又利用明膠、火棉膠、碳蠟和塑料等物質(zhì)的韌性，以其包埋組織而制成切片。 組織制片技術(shù)隨著生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展而發(fā)展。切片染色方法可用以顯示不用細(xì)胞和組織形態(tài)，以及細(xì)胞和組織中某些化學(xué)成分含量的變化。組織制片技術(shù)以成為生物學(xué)、動(dòng)物學(xué)、組織學(xué)、生理學(xué)、植物學(xué)及病理解剖學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科用以研究、觀察細(xì)胞、組織的生理、病理形態(tài)變化的主要方法，也是教學(xué)和科研中不可缺少的一個(gè)組成部分。第一節(jié) 制片的種類一、 組織切片法： 是研究組織學(xué)、病理學(xué)最為廣泛應(yīng)用的基本方法。任何組織切片都必須依靠切片機(jī)將組織切成薄片（厚度以µm計(jì)），再進(jìn)

6、行染色而得到結(jié)果。在切成薄片前必須設(shè)法使組織內(nèi)部滲入足夠的支持物質(zhì)，使組織保持一定的硬度，然后使用切片機(jī)進(jìn)行切片。根據(jù)所使用支持物質(zhì)的不同，切片方法分為：1 石蠟切片法2 火棉膠切片法3 冰凍切片法4 超薄切片法（電鏡技術(shù)） 二組織非切片法：不用切片機(jī)不經(jīng)切片手續(xù)而制成組織切片的方法。1 分離標(biāo)本：將整體或小塊組織浸入化學(xué)藥品配制的分離液內(nèi)一段時(shí)間，溶去間質(zhì)成分，然后充分振蕩，制成的標(biāo)本經(jīng)染色或不經(jīng)染色，即可觀察單個(gè)完整的細(xì)胞。2 涂片標(biāo)本：將骨髓、血液或脫落細(xì)胞涂于載玻片上，經(jīng)固定和染色制成的標(biāo)本，用以觀察細(xì)胞形態(tài)及微細(xì)結(jié)構(gòu)。3 壓片標(biāo)本：將整體或小塊組織經(jīng)藥物處理及染色、撕碎壓平于載玻片上

7、所制成的標(biāo)本。4 鋪片標(biāo)本：將膜片狀組織；如大網(wǎng)膜，腸系膜或皮下疏松結(jié)蹄組織鋪于載玻片上，經(jīng)固定及染色等過程制成的標(biāo)本。5 磨片標(biāo)本：將堅(jiān)硬的組織；如硬骨和牙，不經(jīng)脫鈣磨成薄片，經(jīng)染色或不經(jīng)染色制成的標(biāo)本。6 血管注射標(biāo)本：將染色液，如卡紅明膠、普魯士藍(lán)、墨以單色或雙色注如血管內(nèi)，以觀察臟器的血管分布及內(nèi)皮細(xì)胞的表面形態(tài)。7 組織印片：將未經(jīng)固定的新鮮組織小塊（如手術(shù)后或尸體解剖標(biāo)本）壓印玻璃片上，經(jīng)固定后再行染色。第二節(jié) 制片方法的程序 一組織切片制作過程的各種操作1取材與固定 取材是根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蠹安∽兂潭榷侠砣〉媒M織材料。固定是用化學(xué)藥品把組織原來的結(jié)構(gòu)保存下來以便觀察研究之用，固

8、定劑同時(shí)具有硬化組織的作用，使制片便于進(jìn)行。2. 脫水 洗滌是把滲入組織中的固定劑洗去，防止染色中的結(jié)晶產(chǎn)生。脫水是驅(qū)除組織中的水分以便透明和浸臘。3.透明與浸臘 脫水后的組織中水分以被透明劑所代替，而利于浸臘。浸蠟的目的是使組織有一定的硬度而利于切片和細(xì)胞組織保持一定的生活時(shí)狀態(tài)。4. 包埋與切片 用石蠟和其他包埋劑將組織包繞一定的形狀以便于切片。將包埋好的組織快用切片機(jī)切成一定厚度（以µm計(jì)）。5. 貼片（展片、撈片）和染色 將已切妥的切片在溫水中展平整后用玻璃片貼上，稍晾干后,烤片。染色可使組織和細(xì)胞被染上不同的顏色而產(chǎn)生一定的折射率，便于顯微鏡觀察。6. 封片 切片染色后用膠

9、類物質(zhì)將其封固，以利于長(zhǎng)期保存。二組織切片的主要程序 各種組織切片的目的各有不用，所以制作切片的方法程序也不同，根據(jù)實(shí)際情況可增加或減少某個(gè)步驟，但對(duì)于初學(xué)者必須了解基本程序過程。 標(biāo)本切開或取厚片 固定或不固定 組織固定 冰凍切片法組織塊染色 組織后固定 冰凍切片 干燥貼片或貼片 脫水 火棉膠切片法 明膠切片法透明 明膠浸入 已醇固定及脫水 乙醇 浸蠟 明膠包埋 包埋 乙醚 切 片 染色 切片 粘 片 粘 片 脫水 粘片 火棉膠包埋 染 色 甘油明膠 透明封固 脫蠟 脫水 （脂性物質(zhì)）樹膠封固 切片 塊染色 各級(jí)乙醇 透明 粘片 脫水 水洗 樹膠封固 染色 透明 透明 樹膠封固 常規(guī)染色 特

10、染 樹膠封固 （組化） 脫水 脫水 透明 透明 樹膠封固第二章組織的取材和固定方法第一節(jié) 組織取材一. 外科或人體組織取材：從大體標(biāo)本上按照病理檢查的目的和要求切取適當(dāng)大小的組織塊，供制片進(jìn)行顯微鏡檢查。為達(dá)到診斷的目的，取得適量的組織是關(guān)鍵。這不僅要求材料要盡可能新鮮，而且要有一定的數(shù)量和良好的質(zhì)量。取材時(shí)對(duì)送檢組織的要求送檢組織標(biāo)本在手術(shù)切下或活檢后應(yīng)立即放人10福爾馬林固定（電子顯微鏡標(biāo)本則用適當(dāng)?shù)墓潭úü潭?，后評(píng)述）。尸檢標(biāo)本應(yīng)爭(zhēng)取在死亡后盡可能短的時(shí)間內(nèi)取材。送檢組織需全部取材者應(yīng)在送檢單注明，有特殊要求（如細(xì)菌培養(yǎng)、結(jié)石的化學(xué)成分分析等）須事先聯(lián)系，在標(biāo)本未固定前進(jìn)行處理。取材在對(duì)

11、送檢組織標(biāo)本進(jìn)行詳細(xì)檢查的基礎(chǔ)上，根據(jù)診斷的需要，確定取材的部位和塊數(shù)。切取的組織要按不同部位分別給予不同編號(hào)或標(biāo)記，以便鏡檢時(shí)查對(duì)。有條件的單位，盡可能在取村前對(duì)有意義的大標(biāo)本進(jìn)行表面及剖面攝影，并編號(hào)存檔。用于教學(xué)的標(biāo)本，應(yīng)盡量保留原標(biāo)本的形態(tài)，取材后另行放置。臨床手術(shù)中，多用于腫瘤組織。取材時(shí)應(yīng)注意腫瘤的部位、形狀、大小、顏色、以及與四周的關(guān)系，有無完整或不完整的包膜。測(cè)量腫瘤的體積，包括長(zhǎng)度、寬度和高度，實(shí)質(zhì)瘤則稱其重量。石蠟包埋取材應(yīng)包括（1）腫瘤本身（2）與腫瘤組織連著的表面組織（3）與腫瘤組織連著的地層組織（4）腫瘤兩斷的組織。二.動(dòng)物取材：動(dòng)物致死法1. 麻醉法：乙醚或氯仿麻醉

12、；4戊巴比妥作靜脈注射1ml/或20氨基甲酸乙酯（尿烷或?yàn)趵梗┳龈骨蛔⑸?，劑量一?ml /。2. 空氣栓塞法 兔可用50ml注射器將空氣由耳靜脈推入。3. 斷頭法：4. 擊頭法：5. 股動(dòng)脈放血法：三. 組織取材注意事項(xiàng)1.材料新鮮： 最好是動(dòng)物的心臟還在跳動(dòng)時(shí)取材，立即投入固定液內(nèi)。臟器的上皮組織易變質(zhì)，應(yīng)爭(zhēng)取在死后半小時(shí)內(nèi)處理完畢。2. 組織塊力求小而?。好撍窠M織塊厚度不超過3mm.3. 勿使組織塊受擠壓： 切組織塊用的刀、剪要鋒利，切割時(shí)不要來回搓動(dòng)。夾取組織時(shí)，切勿猛壓，以免擠壓損傷組織。取材時(shí)，組織塊可稍大一點(diǎn)，以便在固定后，將組織塊的不平整部分修掉。4. 盡量保持組織的原有

13、形態(tài)： 新鮮組織經(jīng)固定后，或多或少會(huì)產(chǎn)生收縮現(xiàn)象，有時(shí)甚至完全變心。為此可將組織展平。盡可能維持原形。對(duì)神經(jīng)肌肉皮膚組織等，則可將其兩短用線固定上。5. 選好組織塊的切面：應(yīng)熟悉器官組織的組成并椐此決定其切面的走向。縱切或橫切,根據(jù)觀察目的而定。6. 保持材料的清潔：組織塊上的血液污物粘液食物糞便等，先用生理鹽水沖洗，然后再入固定液。7. 切取不需要部分。第二節(jié) 組織固定方法一. 固定的意義和目的在制作組織切片的過程中，首先將組織充分固定后，才能進(jìn)行制片。尤其對(duì)石蠟切片，這是必不可少的重要部驟。無論是動(dòng)物殺死后，還是尸體解剖后，都必須在不影響保存整體器官標(biāo)本的同時(shí)，取小塊組織進(jìn)行固定。所謂固定

14、，就是要使觀察的組織構(gòu)造盡量接近于它生前的正常狀態(tài)。因?yàn)闄C(jī)體死后血液循環(huán)停止，如不立即處理，則細(xì)胞內(nèi)的酶（水解酶）會(huì)使蛋白質(zhì)分解為氨基酸滲出，使細(xì)胞溶解破壞，組織變形，再無冷藏的條件下，更可因病原微生物的迅速繁殖而腐敗，組織結(jié)構(gòu)破壞不利于形態(tài)學(xué)的診斷。組織固定的目的：（1）迅速防止組織、細(xì)胞的死后變化，防止自溶，以保持組織和細(xì)胞與正常生活時(shí)的形態(tài)相似（2）使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等各種成分轉(zhuǎn)變成不溶物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時(shí)相仿；（3）使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來而產(chǎn)生不同的折射率，造成光學(xué)上的差異，以便染色后易于觀察和鑒別。（4）固定劑兼有硬化作用，使組織硬化，便于制片；（5

15、）防止組織過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)；（6）經(jīng)過固定的組織，能對(duì)染色產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便于辨認(rèn)。二.固定的對(duì)象和方法構(gòu)成細(xì)胞的主要物質(zhì)是蛋白質(zhì)，它分散在細(xì)胞內(nèi)，所以固定的主要對(duì)象是蛋白質(zhì)。1.蒸汽固定法： 比較細(xì)小而薄的標(biāo)本，可用鋨酸或甲醛蒸汽固定。主要用于血液或細(xì)胞涂片以及某些薄膜組織等的固定，具體操作時(shí)應(yīng)先準(zhǔn)備有蓋培養(yǎng)皿 一個(gè)，滴入12餓酸水溶液3滴，將血涂片放于其中。固定30秒或1分鐘。立即水洗后染色。2.注射、灌流固定法： 某些組織塊由于體積過大或固定液難滲入內(nèi)部或需對(duì)整個(gè)臟器或整個(gè)動(dòng)物進(jìn)行固定。此時(shí)宜采用注射固定法，將固定液注入血管，經(jīng)血管分支到達(dá)整個(gè)組織和全身，從

16、而得到充分的固定。1).局部灌注固定2).全身灌注固定：較大動(dòng)物如兔、貓、狗、猴及整個(gè)人體，往往采用輸液方式，將固定液從一側(cè)頸總動(dòng)脈或股動(dòng)脈輸入，從另一側(cè)切開靜脈放血，既輸入固定液與放血同時(shí)進(jìn)行。、固定液的輸入量，因個(gè)體而異。兔、貓約500100毫升，猴、狗約10002000毫升。、某些小動(dòng)物，如大、小鼠，麻醉后打開胸腔，縱向切開心包膜，選用適當(dāng)?shù)尼橆^，從左心室向主動(dòng)脈方向刺入，右心房放血，一般先用生理鹽水洗滌，再灌注固定液，壓力，灌注量及觀察全身情況。三. 注意事項(xiàng)及影響固定的因素1.組織固定必須新鮮：無論取人體組織或動(dòng)物組織，都必須立即投入固定劑。否則易發(fā)生組織自溶，破壞。2.防止組織因固

17、定劑的作用而發(fā)生變形：如神經(jīng)，肌腱，腸系膜，橫膈膜等，可固定于固定板上。肺可系重物使其下沉。或用真空浸臘裝置吸取肺內(nèi)氣體，使其下沉。3.組織塊大??；一般厚度5毫米，長(zhǎng)寬不超過15×15毫米。4.固定液的量一般為組織塊的20倍。5:固定時(shí)間：根據(jù)組織的不同種類，大小，固定劑種類，性質(zhì)，滲透力的強(qiáng)弱而定。一般12小時(shí)，或過夜（24小時(shí)）。6:固定溫度：室溫或低溫：如47.選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?.促使固定：搖擺，震蕩等，有利于固定液的滲入。第三節(jié) 組織固定液用以固定組織的藥劑稱為固定液。一般固定液分為兩大類，1） 單純固定液；2）混合固定液:由兩種以上的試劑組成。作為較好的固定液，應(yīng)有下列特性

18、：有強(qiáng)的滲透力；不使組織過度收縮或膨脹；使組織內(nèi)觀察的成分凝固；使組織達(dá)到一定的硬度。一.單純固定劑1）甲醛(Formaldehyde)：甲醛為一種無色氣體，溶于水成為甲醛水溶液，極易揮發(fā)且具有強(qiáng)烈刺激氣味，它在水中的飽和量為3740（商品甲醛），甲醛水溶液即市售福爾馬林。常用的福爾馬林濃度為10商品甲醛，此液實(shí)際上為4甲醛。甲醛水溶液滲透力強(qiáng)，固定均勻，對(duì)組織收縮較小，多用于大塊組織固定，它能使組織硬化并增加組織的彈性。但經(jīng)乙醇脫水時(shí)收縮很大。經(jīng)它固定的組織，細(xì)胞核染色優(yōu)于細(xì)胞質(zhì)。用10甲醛液固定小塊組織（1.5×1.5×0.2）數(shù)小時(shí)即可時(shí)間稍長(zhǎng)也無關(guān)系。隨著溫度的增高

19、可縮短固定時(shí)間。但是，對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間固定的標(biāo)本，需經(jīng)2448小時(shí)的流水沖洗，否則會(huì)影響染色。甲醛水溶液放置日久能產(chǎn)生少量甲酸，使溶液變?yōu)樗嵝?，。?yán)重時(shí)影響細(xì)胞核內(nèi)嗜堿性物質(zhì)的染色。因此，在備用的甲醛液中宜放入少量的碳酸鎂或碳酸鈣作為中和劑。甲醛水溶液為無色透明，若逐漸變?yōu)闇啙?，表示以變性，不宜再用。甲醛單純固定液的幾個(gè)常用配方：（1）甲醛生理鹽水液3740甲醛液 100ml氯化鈉 8.5g蒸餾水 至1000ml （2）中性10甲醛液 3740甲醛液 100ml 蒸餾水 900ml 碳酸鈣或鎂足量 （3）中性緩沖甲醛液（ph7） 3740甲醛液 100ml 蒸餾水 900ml 碳酸二氫鈉 4g 碳酸

20、氫二鈉 6.5g （4）蔗糖甲醛液 3740甲醛液 100ml 乙酸鈣（水） 20g 蔗糖 300g蒸餾水加至 1000ml 為防止細(xì)胞內(nèi)某些成分?jǐn)U散作用，在25，固定1824小時(shí)，然后流水洗去所含蔗糖。（5）配制4%多聚甲醛固定液 多聚甲醛 40g0.1M PB (PH 7.27.4) 1000mL2）乙醇（Ethyl alcohol）用于固定時(shí)以8095的濃度為好。它具有、硬化、脫水等作用。其滲透力較弱，能沉淀蛋白，但核蛋白仍能溶于水，固經(jīng)酒精固定的組織，核的著色不良。不利于染色體的固定。如用無水乙醇固定時(shí)，其穿透速度很快，易作糖原固定，但取材需薄。高濃度乙醇固定的組織硬化明顯，置留過久易

21、變脆，也使組織收縮明顯。用70的乙醇可較久的保存組織。50以上的乙醇可溶解脂肪類脂體及色素的存在，是不能用乙醇作固定劑的。3）醋酸（Acetic acid）: 醋酸為帶有刺激性氣味的無色液體，低溫時(shí)為冰醋酸。組織固定常用5的溶液。能沉淀核蛋白，固對(duì)染色質(zhì)或染色體的固定都很好。它即不能保存糖，又不能固定脂肪及類脂。一般都與其他藥劑配合使用醋酸，可以各種比例與水或酒精混合。一般使用濃度0.35。4）苦味酸: 為黃色結(jié)晶體，是一種強(qiáng)酸，易燃易爆。一般應(yīng)配成飽和溶液儲(chǔ)藏。常用其飽和浴液作為固定劑。能沉淀蛋白，對(duì)脂肪類脂無作用。它的滲透力較弱，一般很少單獨(dú)使用。用含苦味酸的固定液固定組織時(shí)，時(shí)間不宜超過

22、24h，固定后的組織應(yīng)盡快放人70酒精，并在酒精中滴加少量飽和碳酸鉀水溶液或濃氨水，有助于除去苦味酸固定產(chǎn)生的黃色。5）鋨酸：即四氧化鋨，為淡黃色結(jié)晶，為強(qiáng)氧化劑，不能與酒精甲醛等混合。常用其12的水溶液作為固定液。是電鏡研究的必需固定劑，常用于后固定。四氧化鋨（OsO4），售價(jià)昂貴，一般只用于特殊染色或電鏡切片染色或固定。鋨酸為劇毒品，在應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意防護(hù)，注意保護(hù)眼睛、呼吸器官和皮膚。俄酸主要為脂類（脂肪和類脂）固定劑，也可與肽類和蛋白質(zhì)作用形成肽-蛋白質(zhì)或肽-脂交聯(lián)，使蛋白質(zhì)固定均勻，不產(chǎn)生沉淀。6）丙酮：丙酮為易揮發(fā)易燃的無色液體，可與水、醇、等混合?？墒沟鞍踪|(zhì)沉淀，滲透力強(qiáng)，對(duì)核的固定

23、欠佳，且使組織收縮。廣泛應(yīng)用于組織化學(xué)中各種酶的固定（如磷酸酶，脂酶和氧化酶等）作用基本與酒精相同，但對(duì)糖原無固定作用。二. 混合固定液1）中性甲醛： 甲醛（40）120ml，蒸餾水880ml，磷酸二氫鈉4g磷酸氫二鈉13g 使ph值達(dá)到7。2) Karnoversys改良液的配制: 多聚甲醛 40g 0.1M PB (PH 7.27.4) 960mL 25 %戊二醛 40mLCaCL2 0.375g適用于光鏡及電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)等。3）Bouin：飽和苦味酸水溶液 75ml甲醛水溶液 25ml冰醋酸 5ml此液為實(shí)驗(yàn)室常用固定劑，其滲透力強(qiáng) ，對(duì)組織固定均勻且收縮較小，染色效果好。由于苦味酸難

24、于溶解，故實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)儲(chǔ)備一定量的苦味酸水溶液。Bouin液對(duì)絕大多數(shù)器官于組織固定良好，固定時(shí)間以1224小時(shí)為宜。固定后常以7080乙醇洗滌。4）Zenker液： 升汞 5.0g重鉻酸鉀 2.5g蒸餾水100ml 儲(chǔ)存液）冰醋酸5ml（用時(shí)加入）。Zenker液為組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)及病理學(xué)常用的固定劑。多用于一般組織，能使細(xì)胞核和細(xì)胞漿染色較為清晰。固定時(shí)間1236小時(shí)，固定后流水沖洗12小時(shí)。5）乙醇-甲醛液：95%或無水乙醇90ml，40%甲醛10ml。此液兼有脫水作用，固定后可直接入95%乙醇繼續(xù)脫水。適用于皮下組織中肥大細(xì)胞的固定。6) Carnoy液，苦味酸硫酸液。Helly液等等。7

25、）Zambonis液： 多聚甲醛 20g 飽和苦味酸 150ml 磷酸緩沖液 1000ml 適用于電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)，對(duì)超微結(jié)構(gòu)的保存較甲醛為好，也使用于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，為實(shí)驗(yàn)室常用固定劑之一。固定時(shí)間為618h。 8)PLP液： 即過碘酸鹽賴氨酸多聚甲醛固定液（Periodate-Lysing-paraformaldehyde fixative）:試劑：過碘酸鹽；多聚甲醛；賴氨酸鹽酸鹽；蒸餾水。適用于富含糖類組織的固定。對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和抗原性保存好。固定液中的過碘酸可氧化糖類成醛基，而后與賴氨酸的二價(jià)氨基結(jié)合形成交聯(lián)，從而使糖類固定。因?yàn)榭乖酁樘堑鞍?，固定了糖類，也使抗原得以原位固定。固?/p>

26、時(shí)間618h。固定液配方： 配制方法：A儲(chǔ)存液：（0.1/mol/L賴氨酸 0.5mol/L Na3PO4。 Ph7.4）：賴氨酸鹽酸鹽1.827溶于50ml蒸餾水，得0.2 mol/L得賴氨酸鹽酸鹽溶液，然后加入Na3PO4。，至0。1 mol/L，補(bǔ)足0。1 mol/L的PB至1000ml，4冰箱保存。最好兩周內(nèi)使用。B貯存液（8%多聚甲醛溶液）：多聚甲醛8g 加入100ml 蒸餾水中?；旌希号R用前以3A：1B混合，再加入結(jié)晶過碘酸鈉，使NaIO4終濃度為2%。由于AB液混合，PH從7。5降至6。2，不需再調(diào)整PH值。 此固定液較適用于富含糖類的組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。

27、第三章 洗滌、脫水、透明、浸臘和包埋第一節(jié) 組織洗滌與修塊一修塊，洗滌的目的 組織快固定后，用水或乙醇稍加清洗后給以修切。將受擠壓的或不需要的部分修切或整形，同時(shí)將包埋面選擇好。組織在固定、修整后一定要把滲透到里面的固定液洗去。防止組織中較多的固定液而影響脫水劑。二.洗滌方法1） 固定劑以水配制者：用流水沖洗，可使組織中的固定液隨時(shí)淤出和隨時(shí)洗去。沖洗時(shí)間基本根據(jù)固定時(shí)間長(zhǎng)短而定，新鮮標(biāo)本固定時(shí)間短需及時(shí)脫水，沖洗時(shí)間短。對(duì)固定時(shí)間較長(zhǎng)的組織，就必須長(zhǎng)時(shí)間流水沖洗。尸檢組織、大動(dòng)物組織沖洗時(shí)間為24小時(shí)。小動(dòng)物組織沖洗時(shí)間為310小時(shí)。2） 固定劑含乙醇者： 一般不要求沖洗，如要沖洗必須采用與

28、固定劑中的乙醇濃度相近的乙醇沖洗。不可用水沖洗。3）固定劑為緩沖液者，用同緩沖液洗滌。 三.特殊固定液洗滌法1.重鉻酸鉀 流水沖洗1224小時(shí)2.鋨 酸 流水沖洗1224小時(shí)，組織必須沖干凈。第二節(jié) 組織脫水一脫水的目的和原則 組織經(jīng)固定和水洗后，會(huì)有大量水分，水與苯，石蠟根本不相融合，所以組織在透明、包埋前必須經(jīng)過脫水這一環(huán)節(jié)。就是說用某些溶劑逐步將組織塊吸收的水分置換出來，以利于透明劑和石臘的滲入。這一過程叫脫水。二脫水劑的種類和效果1 非石臘溶劑的脫水劑：如乙醇和丙酮，其組織在脫水后必須再經(jīng)二甲苯透明才可浸臘。2 脫水兼石臘溶劑的脫水劑：如正丁醇和二氧陸環(huán)等，組織在脫水后即可直接透臘，不

29、必經(jīng)過中間溶劑如二甲苯之類的試劑。日常在病理診斷和實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物研究中較多的采用乙醇脫水、二甲苯透明和石臘浸透組織。脫水時(shí)必須由低濃度脫水劑開始，逐步轉(zhuǎn)入高濃度脫水劑，經(jīng)過各級(jí)濃度的脫水劑使其所含的水分逐漸減少而代之以脫水劑。以防組織過度收縮而變形，或脫水不完全而影響制片效果。三 . 常用脫水劑的使用方法1. 乙醇（Alcohol,酒精）： 為最常用的脫水劑。脫水力強(qiáng)，并能使組織硬化，能較好的與二甲苯透明劑結(jié)合。其缺點(diǎn)是易使組織收縮、變脆。注意事項(xiàng)（1）勿直接用高濃度乙醇，一般從70%開始（2）脫水時(shí)間勿過長(zhǎng)。70%乙醇內(nèi)可長(zhǎng)時(shí)間保存組織。 脫水時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織塊大小、性質(zhì)和類型分別安排。一般脫水順

30、序是：75%、85%、90%、95%、100%、100%、100%。2. 丙酮（acetone）：脫水作用較乙醇強(qiáng)，但對(duì)組織的收縮較大，價(jià)格較高，故少用于一般的組織脫水。主要用于快速脫水或固定兼脫水。3. 其他：正丁醇，叔丁醇，環(huán)已酮等。第三節(jié)組織透明一透明的目的透明也稱媒浸。在石蠟切片法中，是脫水和浸臘的中間過度階段。石蠟塊脫水后，在理論上以不含水分，但如脫水劑不能與石蠟相溶，則石蠟仍不能進(jìn)入組織并包埋成供切片用的蠟塊。為此，還需要一種過度的溶劑，既能溶于脫水劑又能溶于包埋劑（石蠟），以便逐步將脫水劑置換成包埋劑。在這一過程中，因組織塊中的水分被溶劑（如二甲苯）取代，其折射指數(shù)接近于組織蛋白

31、的折光指數(shù)，組織塊變得透亮，因此稱之為透明。組織染色后，也要進(jìn)行透明。這種過度的溶劑有二甲苯、苯、香柏油等。同時(shí)組織塊則呈半透明狀。所以把這一過程稱為透明，其目的是為了浸蠟和包埋。二 . 常用透明劑的種類和使用方法 常用透明劑種類很多，但使用最多的是二甲苯。1 二甲苯 易揮發(fā)，無色透明液體，透明力強(qiáng)，易使組織塊收縮、變脆，故組織塊在二甲苯中不宜久留。小組織塊以30分鐘為宜。較大的組織塊可適當(dāng)延長(zhǎng)，最好不超過2小時(shí)。為減少組織塊收縮，可用過度液：乙醇1：二甲苯1。2甲苯 通明較慢，1224小時(shí)3 苯 對(duì)組織收縮較小，是較好的通明劑。但吸入苯能引起中毒。4. 香柏油5. 氯仿等 第四節(jié) 組織浸蠟與

32、包埋一. 浸蠟、包埋的目的和方法組織經(jīng)過脫水、透明后在熔化的石蠟內(nèi)侵債的過程稱侵蠟。用其他浸透劑（加入棉膠、碳蠟和明膠等）滲入組織內(nèi)部的過程可稱為浸透。是使其變硬并將組織包埋進(jìn)去以利于切片和觀察，這個(gè)過程稱為浸蠟或包埋。目的是去處組織中的透明劑而代之以石蠟，并浸入組織內(nèi)部，把軟組織變?yōu)檫m當(dāng)硬度的蠟塊，以便切成薄片。組織經(jīng)透明后， 二. 浸蠟的方法是將組織塊經(jīng)二甲苯透明后，經(jīng)數(shù)次石蠟（、），使組織中剩余的透明劑完全去盡。透蠟時(shí)間根據(jù)組織類型及其大小而定，基本上與組織固定時(shí)間正比。再通常的實(shí)驗(yàn)室常用的石蠟作為透蠟用。石蠟因熔點(diǎn)不同分為硬蠟、軟蠟兩種，50以下的石蠟稱軟臘50以上者稱為硬蠟。夏天用軟

33、蠟包埋，冬天用硬蠟包埋。軟的組織用軟蠟硬、硬的組織用硬蠟包埋。常用包埋蠟熔點(diǎn)為5258。浸蠟過程：一般厚度的實(shí)質(zhì)性器官，總的浸蠟時(shí)間23小時(shí)。苯：蠟約30分鐘；軟蠟30分；硬蠟30分。減壓浸蠟：可用減壓裝置從而大大縮短浸蠟時(shí)間。可能發(fā)生的問題：（1）脫水不夠徹底，因而有的部位特別是組織塊中心石蠟難于浸入；（2）蠟塊中出現(xiàn)蠟花?？赡苁怯捎谕该鲃┪茨鼙蝗芟炌耆脫Q，蠟質(zhì)本身有雜質(zhì)；（3）石蠟?zāi)Y(jié)過程要緩慢。三. 包埋法常規(guī)石蠟包埋法：在進(jìn)行石蠟包埋時(shí)，先將熔化的石蠟倒人包埋框，爾后用加溫的鑷子將的浸蠟組織塊放人。在石蠟中有雜物時(shí)應(yīng)進(jìn)行過濾后再使用。防止倒人的石蠟?zāi)?，在包埋時(shí)隨時(shí)熔化凝固的石蠟。包

34、埋時(shí)首先注意有無特殊的包埋面（如分層組織，皮膚和內(nèi)鏡活檢標(biāo)本等）。包埋面必須平整，破碎的組織應(yīng)采集平鋪包埋。不要混入雜物。包埋溫度不應(yīng)過高，否則易造成組織塊的燙傷，影響診斷。另外，包埋蠟的溫度與組織塊的溫度應(yīng)接近，不然會(huì)引起組織塊與周圍石蠟的脫裂。包埋一般用為56的石蠟，也應(yīng)根據(jù)氣溫條件作相應(yīng)調(diào)整，以組織塊具有合適的硬度，能切出高質(zhì)量的切片為標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)注意過硬的組織一般用較硬的石蠟包埋，而柔嫩的組織多應(yīng)選用硬度低的石蠟。在包埋完畢，蠟塊稍凝后，可移入冷水中加速凝固。包埋后要修塊。石蠟塊可保存1020年。第四章 組織制片（切片）法第一節(jié) 石蠟切片法一 切片前的準(zhǔn)備工作 1）修塊；2）載玻片的準(zhǔn)備

35、：蛋白甘油片或賴氨酸片；3）蓋玻片；4）展片臺(tái)；5）大、中號(hào)優(yōu)質(zhì)毛筆；眼科鑷子；紙片；5）冷水及溫水箱二 切片制作過程三 切片注意事項(xiàng)1) 凡是陳舊、腐敗或干枯的組織不易制成好的切片。2).固定失時(shí)或固定不當(dāng)?shù)慕M織。3) 組織脫水透明和浸蠟過度，會(huì)造成過硬、變脆等。4) 切片出現(xiàn)橫皺紋，常見于組織固定不牢。5) 切片刀不鋒利，有缺口等。6) 切片機(jī)各個(gè)部件應(yīng)擰緊。第二節(jié) 冰凍切片法冰凍切片在組織學(xué)技術(shù)中應(yīng)用很廣泛，對(duì)病理學(xué)中的臨床手術(shù)的快速診斷其意義很大。1.直接冰凍切片法：組織塊不經(jīng)任何包埋劑而直接放在制冷臺(tái)上冷卻后進(jìn)行切片。多用于新鮮組織甲醛固定組織和冰箱冷藏組織。1)恒冷箱切片2)甲醛制

36、冷器：作常規(guī)冰凍切片。3)半導(dǎo)體制冷冰凍切片機(jī)4)二氧化碳冰凍法2明膠冰凍切片法b) OCT混合物包埋法c) 冰凍切片粘片法1)蛋白甘油粘片法2)賴氨酸粘片法第五節(jié) 火棉膠切片法第五章 染 色第一節(jié) 概論一 染色的目的：將染色劑配制成溶液，將組織切片浸于染色劑內(nèi)，經(jīng)一定的時(shí)間，使組織或細(xì)胞及其他異常的成分被染上不同的顏色，產(chǎn)生不同的折射率，便于在光鏡下進(jìn)行觀察。二 染色的原理：就是染色劑和組織細(xì)胞結(jié)合的過程，一般認(rèn)為基本過程是化學(xué)反應(yīng)和物理反應(yīng)。三 染色術(shù)語1 普通染色：最廣泛應(yīng)用的是蘇木精和伊紅染色，又稱常規(guī)染色。2 特殊染色：為顯示特定的組織結(jié)構(gòu)或其他的特殊成分。3 單一染色：4 復(fù)染色5

37、 多種染色四 染色中的基本原則1 染色前處理： 脫蠟至水，除汞，去甲醛色2 染色后處理：脫水，透明3 染色封固：甘油明膠，天然樹脂。一、 蘇木精伊紅染色一 蘇木精：從蘇木精樹心提煉出來。是世界上唯一較好的常規(guī)細(xì)胞核染色劑。習(xí)慣上稱蘇木精是堿性染料。帶正電荷的蘇木精的蘭色色精和細(xì)胞核帶負(fù)電荷的脫氧核糖核酸吸者而完成染色，細(xì)胞核染色成蘭色。蘇木精液的配制方法：1 Harris蘇木精液：蘇木精2.5g，純乙醇25ml，鉀明礬50g，蒸餾水500ml，氧化汞1.25g，冰醋酸20ml。為一般實(shí)驗(yàn)室所用。2 Mayer蘇木精液：蘇木精0.5g，蒸餾水500ml，鉀明礬25g, 碘酸鈉0.1，水合氯醛25

38、g，枸櫞酸鈉0.5g。染色液需新配制，適用于復(fù)染。二.伊紅：是一種胞漿教理想的染色劑。酸性染料組織成分呈彌漫性染色。05%伊紅溶液 1）伊紅 0.5g95%乙醇 100mL2）曙紅2.5g 無水乙醇 50ml 蒸餾水 400ml 重鉻酸鉀 2.5g 飽和苦味酸 50ml 在組織學(xué)中所謂嗜酸性及嗜鹼性一詞，是說該物質(zhì)易被酸性或鹼性染料所染色，而細(xì)胞的酸性或鹼性正與其相反。三 染色程序：1常規(guī)石蠟切片2脫蠟至水：二甲苯10分×2；無水乙醇5分×3；95%乙醇、85%乙醇，75%乙醇各1分；水洗25分。3染色：（1）蘇木精5分鐘左右；（2）流水沖洗；（3）分化：75%鹽酸乙醇分化

39、或水洗分化。4 酸性伊紅13分鐘d) 脫水、透明和封固 結(jié)果為細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，胞漿呈淡紅色。四 注意事項(xiàng)1)脫蠟： （1）脫蠟染色，非脫蠟染色 （2）烘干： 立即染色，溫箱保存。2)染色： （1）蘇木精一般分鐘。 （2）分化： 鹽酸分化要掌握時(shí)間。3)脫水： 時(shí)間4)透明與封固 組織化學(xué)概念：組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)是在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上研究細(xì)胞或組織中物質(zhì)的化學(xué)組成、定位、定量及代謝狀態(tài)的學(xué)科,是組織學(xué)與生物學(xué)及生物化學(xué)的邊緣學(xué)科,其目的是聯(lián)系形態(tài)、化學(xué)成分和功能來了解組織和細(xì)胞的變化。即在組織或細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)（光鏡或電鏡）的原位上研究其化學(xué)組成和代謝狀態(tài)的學(xué)科，是形態(tài)，功能和生物化學(xué)的交界學(xué)科，其著重

40、研究和觀察化學(xué)物質(zhì)的類別和數(shù)量在組織或細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的定位。最早期的組織化學(xué)技術(shù)是在組織學(xué)技術(shù)的特殊染色的基礎(chǔ)上依靠某些物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)成色反應(yīng)親和性等顯示一些化學(xué)成分。以后依靠某些酶的活性，使酶活動(dòng)過程中的產(chǎn)物在原位沉淀而發(fā)展了酶組織化學(xué)。近十年來組織化學(xué)隨著生物學(xué)物理學(xué)化學(xué)等學(xué)科與技術(shù)進(jìn)展，發(fā)展很快，以進(jìn)入分子水平。以細(xì)胞為研究對(duì)象的叫細(xì)胞化學(xué)。以組織為對(duì)象的叫組織化學(xué)。也有叫組織細(xì)胞化學(xué)的。以顯微形態(tài)學(xué)研究為主體的稱為顯微鏡組織化學(xué)（狹義組織化學(xué)）；和以化學(xué)方法為主題的叫分析組織化學(xué)。一 組織化學(xué)的種類：1化學(xué)方法：根據(jù)其化學(xué)反應(yīng)的原理，在組織切片上生成沉淀，顯示定位。如：過碘酸雪夫酸（PAS

41、）反應(yīng)顯示糖類物質(zhì)；Feulgen反應(yīng)顯示核酸（DNA）等。2生物活性反應(yīng)：利用組織細(xì)胞內(nèi)的生物活性顯示出該物質(zhì)。如；酶活性檢查法。3物理學(xué)反應(yīng)：應(yīng)用物質(zhì)的物理學(xué)反應(yīng)，如蘇丹、油紅染料溶于脂類而使脂類顯色。如:熒光物質(zhì)的熒光檢查法；二 組織化學(xué)技術(shù)的基本要求：1組織化學(xué)技術(shù)必須：（1）組織材料及時(shí)切片與染色，良好地保存組織或細(xì)胞的結(jié)構(gòu)；（2）保存組織或細(xì)胞內(nèi)的檢測(cè)目的物；（3）能在組織結(jié)構(gòu)上（光鏡或電鏡下）顯示出突出而易于觀察的標(biāo)志，如成色、沉淀、熒光、同位素、高電子密度等標(biāo)記物；（4）檢測(cè)手段要有高度的敏感性、特異性和可重復(fù)性，可借助陰性及陽性對(duì)照，正確的分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。；（5）生成物的反應(yīng)產(chǎn)

42、物必須在原位沉淀，著色深，且不容為細(xì)小沉淀或小結(jié)晶，保證定位的精確性及穩(wěn)定性，以便與反復(fù)觀察。同時(shí)，反應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)志不僅只是定性，還要考慮定量。2 組織化學(xué)的反應(yīng)條件：溫度；光；濕度；壓力；PH；滲透壓；媒介；催化劑；時(shí)間；等三 糖類組織化學(xué)過去也叫碳水化合物；現(xiàn)在包括了脫氧核糖和鼠禮堂；統(tǒng)稱糖類。單糖；多糖；粘多糖；躺蛋白；糖脂；糖類組織化學(xué)長(zhǎng)期以來主要依靠PAS（Periodic acid schiff）技術(shù)。過碘酸Schiff 反應(yīng) PAS（Periodic acid schiff）1試劑配制：（1） 過碘酸氧化液：高碘酸0.5g 蒸餾水100 ml冰箱保存。（2） Shiffc液：鹼性復(fù)

43、紅1g ；1N 鹽酸20ml; 偏重亞硫酸鈉1g；重蒸餾水200ml。（3） 先將200ml重蒸餾水煮沸，加入1g鹼性復(fù)紅，煮沸1分；冷卻至50加入20ml 1N 鹽酸。待35 時(shí)加入2g偏重亞硫酸鈉。室溫中2小時(shí)后見稍帶紅色，5小時(shí)后變?yōu)闊o色液體。棕色瓶?jī)?nèi)裝好，封口，冰箱保存。 2.染色方法：1） 組織切片，脫蠟至水。2） 蒸餾水洗。3） 入過碘酸氧化液1020分。4） 充分蒸餾水洗。5） Shiffc液染色10分，（如果室溫在5以下時(shí)可稍加溫以加快反應(yīng)）。6） 流水沖洗10分（對(duì)著色較深的切片可縮短時(shí)間）。7） 可用明礬蘇木精液染核3分鐘。8） 0。5%鹽酸分化。9） 無水乙醇脫水，二甲苯

44、透明，中性樹膠封固。第六節(jié) 蛋白類組織化學(xué)Bielschowsky改良法：1固定： 甲醛液2試劑配制： 氨銀溶液：20%硝酸銀水溶液30ml，無水乙醇： 20ml氨水氫氧化鈉3染色方法：1)石蠟切片815um ，脫蠟至水。2)蒸餾水洗12分。3)溫箱內(nèi)氨銀水溶液避光孵育2035分。4)蒸餾水洗30秒1分5)10%甲醛液還原30秒，呈棕色。6)水洗。7)0.2%氯化金水溶液調(diào)色35分。8)水洗。9)5%硫代硫酸納水溶液固定35分。10)水洗后脫水，透明、封固。結(jié)果： 膠原纖維呈黑色。四 酶組織化學(xué)酶是一類蛋白質(zhì), 催化發(fā)生在生物系統(tǒng)中必須的化學(xué)反應(yīng)。用組織化學(xué)方法顯示酶在組織或細(xì)胞內(nèi)的定位的技術(shù)

45、。而酶必須顯示其活性，看不見酶本身，只見對(duì)底物的作用，所以最終產(chǎn)物來自底物。國(guó)際酶學(xué)會(huì)儀提出分類法；1 氧化還原酶：脫氫酶2 水解酶：鹼磷酶、酸磷酶3 轉(zhuǎn)換酶：轉(zhuǎn)肽酶，磷酸化酶4 裂合酶5 異構(gòu)酶6 合成酶：三磷酸腺苷酶方法：1試劑配制：2%巴比妥鈉10，3%甘油磷酸鈉10，2%無水綠化鈣10，2%硫酸鎂，蒸餾水5， 9。42步驟： 1）冰切2）用液撫育3）沖洗4）2%硝酸鈷液5分5）水洗6） 水封固五 核酸組織化學(xué)六 脂類組織化學(xué) 免疫組織化學(xué)講義近十年來組織化學(xué)隨著生物學(xué)物理學(xué)化學(xué)等學(xué)科與技術(shù)進(jìn)展，發(fā)展很快，以進(jìn)入分子水平。免疫組織化學(xué)特別是單克隆抗體的問世，使組織化學(xué)技術(shù)發(fā)展到能顯示某一

46、種特殊蛋白細(xì)胞結(jié)構(gòu)或某一基因的產(chǎn)物。一概論： 免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)：是依據(jù)抗原抗免疫反應(yīng)原理，用標(biāo)記的抗體（或）抗原對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)，經(jīng)過組織化學(xué)的呈色反應(yīng)之后，用顯微鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡觀察。凡是能作抗原、半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、核酸酶、激素、磷脂、多糖、受體及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體在組織、細(xì)胞內(nèi)將其用免疫組織化學(xué)手段檢出和研究。按標(biāo)記物標(biāo)記的是抗體還是抗原，可將免疫組織化學(xué)分為標(biāo)記抗體法與標(biāo)記抗原法兩種。我們一般所用多為標(biāo)記抗體法。以抗原和抗體的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)，大分子物質(zhì)固不必論，象肽類和類固醇等小分子物質(zhì)，只要與有抗

47、原性的某種物質(zhì)結(jié)合，也同樣能促使機(jī)體產(chǎn)生抗體，引起抗原抗體反應(yīng)，并借某種特定的標(biāo)記物顯示出來。由于免疫組織化學(xué)技術(shù)所鑒定的物質(zhì)非常廣泛，其應(yīng)用范圍顯著擴(kuò)大，而且它能在細(xì)胞、染色體或亞細(xì)胞水平原位檢測(cè)抗原分子，在細(xì)胞、基因和分子水平同時(shí)顯示基因及其表達(dá)產(chǎn)物，為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和各領(lǐng)域分子水平的研究與診斷開拓了廣闊的前景。二免疫組織化學(xué)的突出優(yōu)點(diǎn)：1 高度的特異性：抗原抗體反應(yīng)是特異性最強(qiáng)的反應(yīng)之一，免疫組織化學(xué)所用的抗體必須是特異性強(qiáng)的多價(jià)或單價(jià)抗體，具有高度的識(shí)別能力，再抗原識(shí)別上可達(dá)到單個(gè)氨基酸的水平這是其他組織化學(xué)達(dá)不到的。2 敏感性高：現(xiàn)代免疫組織化學(xué)采用各種有效方法最大限度保存細(xì)胞和組織內(nèi)

48、待檢物質(zhì)的抗原性，或采用各種增敏方法，使用高度敏感的和高親和力的抗體，保證可檢出細(xì)胞內(nèi)超微量的抗原成分，用顯微鏡或電子顯微鏡觀察結(jié)果，因此，它是在細(xì)胞、分子水平或基因水平的檢測(cè)技術(shù)。3 方法步驟統(tǒng)一：若掌握一種技術(shù)操作方法步驟，則一通百通。4 形態(tài)、技能和代謝密切結(jié)合：是一種綜合性定性定位和定量密切結(jié)合；形態(tài)技能和代謝密切結(jié)合為一體的研究和檢測(cè)技術(shù)。 免疫組織化學(xué)技術(shù)日新月以驚人的速度發(fā)展，尤其是分子生物學(xué)理論和技術(shù)日益結(jié)合密切基因核酸分子雜交技術(shù)，原位PCR技術(shù)核酸雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)技術(shù)電鏡雜交技術(shù)等成為免疫組織化學(xué)技術(shù)的新發(fā)展成員，標(biāo)志著免疫組織化學(xué)又進(jìn)入了一個(gè)新的發(fā)展階段。核酸分子探

49、針-雜交-免疫細(xì)胞化學(xué)放大和顯示雜交信號(hào)，可以稱為雜交免疫細(xì)胞化學(xué)。（所以核酸分子探針的研制已成為免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中必需的試劑生產(chǎn)技術(shù)。）三免疫細(xì)胞化學(xué)的全過程包括：（1）抗原提取和純化；（2）免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合（單克隆抗體）；（3）抗體效價(jià)檢測(cè)和提?。唬?）標(biāo)記抗體；（5）細(xì)胞和組織切片標(biāo)本的制備；（6）免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)顯色；（7）觀察和記錄結(jié)果。由于國(guó)際國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上標(biāo)記或未標(biāo)記的單價(jià)或多價(jià)抗體種類日益增多，許多實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用現(xiàn)成的抗體從染色起步，可以收到事半功倍的效果。但要定位一種新的物質(zhì)，發(fā)展我國(guó)自己的試劑生產(chǎn)，則需要更多人掌握免疫細(xì)胞化學(xué)的全部過程。免疫細(xì)胞化學(xué)的基本理論是抗原抗體反應(yīng)，標(biāo)

50、記化學(xué)反應(yīng)和呈色化學(xué)反應(yīng)。由于免疫細(xì)胞化學(xué)是在細(xì)胞和組織上進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，所以必須熟練掌握顯微標(biāo)本制備的全過程，要求待檢標(biāo)本形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗原性保存良好，抗原不從原位擴(kuò)散或丟失。所以，從事免疫細(xì)胞化學(xué)的工作者必須了免疫學(xué)理論及掌細(xì)胞組織學(xué)技術(shù)。四有關(guān)的免疫學(xué)理論一）、抗原、抗體的概念及抗原抗體的關(guān)系（1） 抗原：具有免疫原性和特異反應(yīng)性凡是能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并能與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)稱為抗原，物質(zhì)具有的這種特性稱為抗原性。在病理學(xué)診學(xué)及研究工作中，被檢的目的物往往是抗原。（2） 抗體：是機(jī)體受抗原刺激后，在體液內(nèi)出現(xiàn)的一種能與相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng)的球蛋白，稱免疫球蛋白。含免疫球蛋白的血清稱免疫

51、血清?？贵w能特異性的與引起抗體的抗原在體內(nèi)或體外結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。 （3） 抗原與抗體的關(guān)系抗原是引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要外因，決定免疫反應(yīng)的特異性，機(jī)體與抗原物質(zhì)的斗爭(zhēng)過程中為加速循環(huán)和排除抗原而產(chǎn)生的抗體、致敏淋巴細(xì)胞等物質(zhì)，是機(jī)體排除異體物質(zhì)的保護(hù)性反應(yīng)，沒有抗原的刺激，機(jī)體不能產(chǎn)生抗體，沒有抗原物質(zhì)，也無法檢測(cè)抗體的存在；利用抗體可以檢測(cè)抗原物質(zhì)的存在。二）、抗原的性質(zhì)及種類（1） 抗原的性質(zhì)1） 異種、異體物質(zhì)：機(jī)體能對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的異種、異體的大分子物質(zhì)產(chǎn)生抗體，該物質(zhì)與機(jī)體的種系關(guān)系愈遠(yuǎn)，其抗原性愈強(qiáng)，機(jī)體的免疫反應(yīng)也更強(qiáng)。例如：鴨血清白蛋白對(duì)雞的免疫原性較弱，而對(duì)家兔則能引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。同種異體物質(zhì)也具有抗原性：如血ABO血型抗原及Rh型抗原。人類白細(xì)胞和其他組織細(xì)胞膜上也具有組織相容性復(fù)合物的抗原物質(zhì)（MHC）。自身抗原：機(jī)體對(duì)本身所具有的物質(zhì)不產(chǎn)生免疫反應(yīng)。但在某些條件下，使機(jī)體某種物質(zhì)、細(xì)胞或組織成分具有抗原性時(shí)，也可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。此忽悠抗原性的自身物質(zhì)稱為自身抗原，所產(chǎn)生的抗體稱為自身抗體。2） 大分子膠體：凡具有抗原性的物質(zhì)，分子愈大，抗原性愈強(qiáng)（如細(xì)、菌蛋白質(zhì)）。一般認(rèn)為抗原分子愈大，其表面積相應(yīng)教大，接觸免疫細(xì)胞機(jī)會(huì)增多，在機(jī)體內(nèi)停留時(shí)間較長(zhǎng)，不易排除，因而對(duì)機(jī)體刺激作用也強(qiáng)。