生物技術基因工程

1、1第八章 基因工程2重組DNA技術34567基因工程的應用8 首字母： 大寫：細菌屬名2-3字母： 小寫：細菌種名 如 EcoR 1 4 : 大寫: 菌株 1，2: 分離到的次序第一節(jié)、工具酶一、限制酶（restriction enzyme）：限制性內切酶 1 類：限制和修飾作用 * * 2 類：識別DNA內部位點、切割雙鏈 3 類：同類根據酶結構、作用及DNA結合和裂解的特性1、分類2、命名910（2）產生平末端(blunt end):3.酶的識別和切割位點:通常4-6bp,具有回文結構(palindrom)（1）產生粘性末端(sticking end) 5-末端: EcoR 1: 5-GA

2、ATTC-3 3-CTTAAG-5 3-末端:Pst1 : 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 Sma1: 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5115.同尾酶(isoaudamers): 識別序列不同,但產生相同的粘性末端 BamH 1 :GGATCC Sau3A 1: NGATCN4.同功異源酶(isochizomers): 來源不同, 識別和切割位點相同 如:BamH 1 和 Bst 1121、DNA聚合酶 大腸桿菌中第一個發(fā)現，MW 109KD 方向：53 還具有53及35外切酶活性. 缺口平移法標記DNA時常用二 修飾酶對DNA 或RNA 末端進行剪切、補平、連接及化學修

3、飾的酶。13 兩類：禽類成骨細胞性白血病病毒逆轉錄酶（AMV） moloney小鼠白血病病毒逆轉錄酶（MMLV） 方向：53 作用：以RNA為模板合成DNA，構建cDNA文庫2、逆轉錄酶 （reverse transcriptase）將3-OH 與5-P 連接形成3, 5-磷酸二酯鍵3、T4 DNA連接酶（T4 DNA ligase）144、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）6、Taq DNA聚合酶 和其它耐熱DNA聚合酶去除DNA or RNA 5-P，制備載體時可防止載體自身連接， 提高重組效率。5、末端脫氧核苷酰轉移酶 ：末端轉移酶 作用：在DNA的3-OH上，加上

4、dNTPPCR時15內切酶、堿性磷酸酶、連接酶的作用16*分類： 克隆載體 質粒 入噬菌體 粘性質粒 M13噬菌體 表達載體 大腸桿菌表達載體 哺乳動物表達載體第二節(jié) 載體*本質：DNA 攜帶外源DNA進入受體細胞的運載工具。17質粒載體 大腸桿菌質粒載體 PBR322 枯草桿菌質粒載體 PNC3 酵母菌質粒載體 農桿菌Ti質粒載體 Ti噬菌體載體 噬菌體載體 Cos噬菌體載體病毒載體 SV40病毒載體 乳頭瘤病毒載體18 分子量相對較小，在細菌中穩(wěn)定存在， 拷貝指數高。 具有遺傳標記： 如抗生素性基因 半乳糖酶基因（LacZ） 具 有 多 個 酶 的 單 一 切 點 。 稱 多 克 隆 位

5、點 （ multiple cloning sites , MCS） 如 PBR322(人工合成)4.3Kb ：含 AmP(氨卞青霉素)、 Tet(四環(huán)素) 24個單一切點一 常用的克隆載體1.質粒（plasmid）：種類很多，但作為克隆載體須具備。19PBR32220質粒的構建21質粒攜帶外源基因22 溶菌性（Lytic）：在細菌中連續(xù)增殖直到細菌裂時， 釋放噬菌體。 溶原性（Lysogenic）：將其DNA整入細菌中。 *只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶原周期。2. 噬菌體：最大容量：923kb感染細菌的病毒根據生活周期分 特點雙鏈DNA分子（線性或環(huán)形） 兩端具有12個nt單鏈互補粘性末端

6、具非必需區(qū)（中間區(qū)約1/3長度） 可在E.Coli中大量繁殖 可克隆15Kb左右的外源基因23噬菌體的溶原周期和溶菌周期2425 插入型載體：外源DNA克隆到分子上，使噬菌體的某種生物 功能喪失效力，即插入失活效應。 如：半乳糖酶失活的插入型載體（藍白篩選） 編碼 載體類型 （兩種）A :載體中含一個LacZ基因 半乳糖苷酶 X-gal(無色) X(藍色)+gal(半乳糖) *其中X為有色基因：（4-溴-5-氯吲哚）與gal結合成無色的X-galB:在含X-gal的培養(yǎng)基中，在Lac操縱子誘導物IPTG（異丙硫半乳糖苷）作用下，細菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，此菌落為藍色。26C.若Lac

7、 Z基因被外源DNA插入而破壞，則不能制造半乳糖苷酶，菌落為無色（白色）。27取代型載體（又叫替換型載體） 圖8-4基因工程原理P258在DNA分子的中央，插入一段DNA片段： 具有多克隆位點的反向重復序列 當外源DNA插入時其可被置換掉 作用：提高了克隆外源DNA的能力。28*由DNA的Cos區(qū)與質粒構建*環(huán)狀雙鏈DNA特點；含質粒的抗性標記如Amp，Tet 帶Cos區(qū)，可進行體外包裝 一個或多個酶切位點 分子量小，容量大 /篩選AP平板2、粘性質粒（Cosmid）：容量40-50kb293031（1）大腸桿菌噬菌體（2）基因組DNA全長6.5kb（單鏈）（3）感染后，可復制成雙鏈DNA（R

8、F，DNA）（4）當RF100200后，只有（+）鏈復制 4種常用載體的比較 P146 表82 篩選：藍白篩選3、M13噬菌體（M13 phage）3233在受體細胞中表達（轉錄和翻譯）外源基因的載體。二. 表達載體（expressing vector） 大腸桿菌表達載體 除克隆載體的特性外還含有：表達系統(tǒng)元件 啟動子 核糖體結合位點 克隆位點 轉錄終止信號啟動子：常用的有 trp-lac啟動子（or tac啟動子） 噬菌體Pc啟動子 T7噬菌體啟動子34除含有原核序列：在E-Coli中的復制起始點、便于篩選的抗性基因還包括真核表達元件 啟動子/增強子 克隆位點 終止信號和加poly（A）信號

9、哺乳動物表達載體原核受體 E-Coli受體系統(tǒng) 外源基因復制、擴增場所 鏈霉菌受體系統(tǒng) 外源基因表達場所 酵母菌受體系統(tǒng)真核受體 動物（哺乳）細胞受體系統(tǒng) 一般只作基因表 植物/ 昆蟲細胞受體系統(tǒng) 達場所基因工程的受體系統(tǒng)351. 特點：遺傳背景清楚利于研究 繁殖快易獲得大量基因產物（20一代） 含質粒利于基因轉移 表達非E-Coli基因，其潛力幾乎是無限的. E-Coli受體系統(tǒng)2. 缺點：高水平表達基因產物易沉淀、凝集、不易折疊 基因產物純化工藝復雜 基因產物易受污染（內毒素） 基因產物對受體菌有毒害作用 基因產物易被水解 從安全角度并不理想 缺乏基因產物表達后加工機制36特點：安全性大

10、遺傳信息和生理狀況更適合于真核基因表達 基因產物外分泌 遺傳背景較清楚 具基因表達后加工機制二. 酵母菌受體系統(tǒng)37目的基因的獲得載體的選擇與制備目的基因與載體的結合（DNA分子的體外連接）重組DNA導入受體重組體篩選和鑒定目的基因表達基因產物的分離純化第三節(jié) 重組DNA技術的基本過程七步：38. 目的基因的制備方法： 1. 內切酶法 2. 機械力降解 3. 化學合成 4. cDNA合成 5. PCR制備法 6. 從基因文庫中提取1.限制性內切酶法（鳥槍法或散彈法） 用酶降解染色體DNA（esp原核生物），將降解的DNA克隆到載體上，從而得到目的基因優(yōu)點：原理簡單，操作簡便，具有一定的應用范圍

11、。缺點：隨機性有限，盲目性大，篩選麻煩，應用范圍有限 （只適用于原核生物）392、機械降解法優(yōu)點：隨機性大缺點：所得基因片段不能直接連接，需加工修飾。用超聲波震蕩等機械法使DNA斷裂。3. cDNA合成cDNA文庫（Cdna library）：將一個細胞中，所有cDNA都與載體連接成重組DNA，并列入宿主細胞進行擴增，得到分子克隆的混合體，稱為cDNA文庫。cDNA的獲得： 圖85 七年制P149 不同細胞，不同細胞狀態(tài)，得到的cDNA文庫不同。404.PCR（polymerase chain reaction）3、化學合成法a.acodeDNA化學合成nt5.從基因文庫中提取基因文庫（gen

12、omic library）：因限制性內切酶將基因組 DNA切成片段，每一段與一個載體連接成重組DNA，并引入宿主細胞進行擴增，得到分子克隆的混合體，稱基因文庫。411.粘性末端連接 5末端連接（易） 3末端連接（難） 二.載體的選擇和制備分離純化三.DNA分子的體外連接（外源DNA與載體連接） P與OH形成二酯鍵T4連接酶：載體經酶切后，易自身環(huán)化，形成自身載體。 處理方法之一：堿性磷酸酶處理5P422、利用人工接頭（linker）連接帶有限制性內切酶切點的一段人工DNA片段433、加入同聚體尾連接：TdT末端加尾的原理44454.平端連接 所用ATP及T4DNA連接酶的濃度比，粘性末端連接要

13、高些（大于2.5倍）46轉化程序： 感受態(tài)細胞+質粒DNA 42、90sec 不含抗生素的培養(yǎng)基熱休克37 涂布選擇性平板 37 得到細胞的克隆 30-60min （合適抗生素） 10hr （使質粒擴增）四、將重組DNA導入宿主細胞1.轉化（transformayion）將質?；蚱渌庠碊NA導入宿主細胞的過程。宿主：大腸桿菌感受態(tài)細胞（Competent Cell）：E-coli經Cacl2處理（0-5），使細胞膜通透性增加，從而具有攝取外源DNA的能力。47DNA E-coli 轉染動、植物病毒DNA 動植物細胞 （transfection） 噬菌體顆粒 E-coli 感染病毒顆粒 動、植

14、物細胞 2.感染（infection）：也稱轉導（transduction）由噬菌體或病毒介導外源DNA進入宿主細胞的過程有一個：體外包裝過程48（1）遺傳學方法 （2） 免疫學方法 （3）核酸雜交法 （4）PCR技術 （5）酶切鑒定1.遺傳學方法 篩選轉化菌： 含抗性基因的質粒，轉化后，細菌在含這種抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，未被轉化的細菌即被殺死，能生長的，就是一轉化的。五、重組體的篩選495051A：當M13感染空載宿主后，產生完整的LacZ產物。 -半乳糖苷酶 Xgal X（蘭色）+gal（無外源DNA） B：當M13插入了外源DNA后，其LacZ基因被破壞，不能與宿主細胞中LacZ的互補，

15、產生LacZ產物。 Xgal X （蘭色） （含外源DNA 重組克隆）C：藍白篩選： 篩選帶有重組體的克隆插入失活法（insertion inactivation）鑒別：質粒重組體和非重組體適用于： 具有兩個或兩個以上抗生素性標記的質粒。 -互補 （-complementation）M13噬菌體（插入了一段LacZ基因）宿主（刪除了一段LacZ基因 Lac-522免疫學方法 原理：以目的基因在受體細胞中的表達產物作為Ag，免疫動物制備Ab，通過Ag、Ab反應，將帶目的基因的克隆篩選出來。方法：放免、化學方法、顯色反應等。533. 核酸雜交法 從基因文庫、cDNA文庫或重組反應質粒中篩選目的基因

16、。 將含有外源DNA的細菌生長在瓊脂板上 將NC膜或尼龍膜覆蓋平板表面 NaOH處理膜 32P-DNA雜交或RNA X線曝光 放射自顯影 陽性斑點544. PCR技術5、酶切鑒定55第四節(jié)真核細胞轉染一. 基本方法和原理1.磷酸鈣共沉淀法（Calcium phosphate co-pecipitation）外源DNA或重組質粒DNA與磷酸鈣混合，形成微小顆粒，沉積在細胞表面，被宿主細胞攝取。2.電穿孔法（electroporation）外源DNA與宿主細胞混合于電穿孔杯中，在高頻電流作用下，細胞膜出現許多小孔，外源DNA進入宿主細胞。563、DEAE葡聚糖（DEAEDextran）法（帶正點荷）經細胞內吞作用吸入細胞短暫表達外源DNA（帶負電荷）4、脂質體(liposome)介導基因導入陽離子脂質體（膜成分） DNA負電荷與細胞膜溶合外源DNA被釋放到胞漿 短暫表達575、顯微注射法（microinjection）將外源基因通過毛細玻璃管，再顯微鏡下注釋到受精卵的細胞核內的方法。58 tk tk 轉入