DNA的酶切鑒定

1、實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 DNA限制性內(nèi)切酶 消化酶切實(shí)驗(yàn)原理l限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。限制性內(nèi)切限制性內(nèi)切酶酶酶分子酶分子識別位點(diǎn)識別位點(diǎn)切割位點(diǎn)切割位點(diǎn) 限制作用是限制作用是否需用否需用 ATP類類 三 亞 基 雙三 亞 基 雙功能酶功能酶 二分非對稱二分非對稱至少在識別至少在識別位點(diǎn)外位點(diǎn)外 1000bpYes類類內(nèi)切酶與甲內(nèi)切酶與甲基化酶分子基化酶分子不在一起不在一起4-6bp, 大多大多數(shù)為回文對數(shù)為回文對稱結(jié)構(gòu)稱結(jié)構(gòu)

2、在識別位點(diǎn)在識別位點(diǎn)中或靠近識中或靠近識別位點(diǎn)無特別位點(diǎn)無特異性異性No類類二亞基雙功二亞基雙功能酶能酶 5-7 bp 非對非對稱稱在識別位點(diǎn)在識別位點(diǎn)下 游下 游 2 4 -26bpYes限制性內(nèi)切酶可分為三類限制性內(nèi)切酶可分為三類類限制性內(nèi)切酶 類酶切割位點(diǎn)在識別序列中，有的在對稱軸處切類酶切割位點(diǎn)在識別序列中，有的在對稱軸處切割割, 產(chǎn)生平末端的產(chǎn)生平末端的DNA片段片段(如如Sma: 5-CCCGGG-3)；有的切割位點(diǎn)在對稱軸一側(cè)，有的切割位點(diǎn)在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端，如片段稱粘性末端，如EcoR切割識別序列后產(chǎn)生切割識別序列后產(chǎn)

3、生兩個互補(bǔ)的粘性末端。兩個互補(bǔ)的粘性末端。 5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5 實(shí)驗(yàn)材料和試劑實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料： 玉米基因組玉米基因組DNA實(shí)驗(yàn)試劑：實(shí)驗(yàn)試劑：BamH I 酶及其酶切緩沖液：購買成品。酶及其酶切緩沖液：購買成品。 SalI酶及其酶切緩沖液：購買成品。酶及其酶切緩沖液：購買成品。瓊脂糖瓊脂糖(Agarose)：進(jìn)口或國產(chǎn)的電泳用瓊脂：進(jìn)口或國產(chǎn)的電泳用瓊脂糖均可。糖均可。 實(shí)驗(yàn)儀器恒溫水浴鍋恒溫水浴鍋用手指輕彈管壁使溶液混勻，使溶液集中在管底用手指輕彈管壁使溶液混勻，使溶液集中在管底混勻反應(yīng)體系后，混勻反應(yīng)體系后，37水浴保溫水浴

4、保溫2-3h 電泳檢測電泳檢測EP管編號管編號實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟反應(yīng)體系反應(yīng)體系 20L酶液酶液 DNA 15L BamH 1L Sal 1L 10BufferT 3L對質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng) 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1g DNA加加1單位酶單位酶, 消化消化1-2h。但要完全酶解。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚倍，甚至更多，反應(yīng)時間也要適當(dāng)延長。至更多，反應(yīng)時間也要適當(dāng)延長。 電泳檢測示例實(shí)驗(yàn)注意事項限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1g DNA加加1單位酶，消化單位酶，消化1-2h。但要完全酶

5、解則必須增加酶的用量，一般增加但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，倍，甚至更多，反應(yīng)時間也要適當(dāng)延長。反應(yīng)時間也要適當(dāng)延長。 酶切時所加的酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分溶液中其他成分會干擾酶反應(yīng)。會干擾酶反應(yīng)。 許多實(shí)驗(yàn)制備的許多實(shí)驗(yàn)制備的DNA不易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)不易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)?？赡芨蓴_隨后的反應(yīng)。 市場銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時可事先用酶反應(yīng)市場銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時可事先用酶反應(yīng)緩沖液（緩沖液（1）進(jìn)行稀釋。另外，酶通常保存在）進(jìn)行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實(shí)的甘油中，實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在驗(yàn)中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則酶活性將受影之下，否則酶活性將受影響