實(shí)驗(yàn)三血清紅細(xì)胞制備

1、實(shí)驗(yàn)三、實(shí)驗(yàn)動物的采血方法、實(shí)驗(yàn)三、實(shí)驗(yàn)動物的采血方法、動物血清及紅細(xì)胞的制備方法動物血清及紅細(xì)胞的制備方法指導(dǎo)老師：程指導(dǎo)老師：程 燕燕實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)動物不同部位的取無菌采、學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)動物不同部位的取無菌采血方法；血方法；2、學(xué)習(xí)動物血清、紅細(xì)胞的制備；、學(xué)習(xí)動物血清、紅細(xì)胞的制備；3、觀察兔、豚鼠的免疫器官、觀察兔、豚鼠的免疫器官。實(shí)驗(yàn)原理 免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫組織、免疫細(xì)胞和免疫分子組成。免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫組織、免疫細(xì)胞和免疫分子組成。 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞 1. 1.固有免疫的組成細(xì)胞：吞噬細(xì)胞、淋巴器官、樹突狀細(xì)胞、固有免疫的組成細(xì)胞：吞噬細(xì)胞、淋巴器官、樹突狀細(xì)胞、NKN

2、K細(xì)胞、細(xì)胞、NKTNKT細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞；細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞； 2. 2.適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞：適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞：T T細(xì)胞、細(xì)胞、B B細(xì)胞細(xì)胞 免疫分子免疫分子 1. 1.膜型分子：膜型分子：TCRTCR、BCRBCR、CDCD分子、粘附分子、分子、粘附分子、MHCMHC分子、細(xì)胞分子、細(xì)胞因子受體。因子受體。 2. 2.分泌型分子：免疫球蛋白、補(bǔ)體、細(xì)胞因子。分泌型分子：免疫球蛋白、補(bǔ)體、細(xì)胞因子。實(shí)驗(yàn)原理 血液是一種結(jié)締組織（細(xì)胞間質(zhì)）。血液系統(tǒng)是各種重要的血液是一種結(jié)締組織（細(xì)胞間質(zhì)）。血液系統(tǒng)是各種重要的免疫細(xì)胞、免疫分子的載體，也是各種免疫事件發(fā)生

3、的場所。免疫細(xì)胞、免疫分子的載體，也是各種免疫事件發(fā)生的場所。 組成：組成：1 1、血漿、血漿 血漿蛋白（白蛋白、球蛋白、纖維蛋白原）血漿蛋白（白蛋白、球蛋白、纖維蛋白原） 脂蛋白、無機(jī)鹽、氧等成分脂蛋白、無機(jī)鹽、氧等成分 激素、酶、抗體激素、酶、抗體 細(xì)胞代謝產(chǎn)物等。細(xì)胞代謝產(chǎn)物等。 2 2、血細(xì)胞、血細(xì)胞 紅血球、紅血球、 白血球（有粒白細(xì)胞：中性粒白血球（有粒白細(xì)胞：中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞和無粒白細(xì)胞：單核細(xì)胞和細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞和無粒白細(xì)胞：單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞) ) 血小板血小板實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)研究中，要采集實(shí)驗(yàn)動物的血液進(jìn)行檢查或?qū)嶒?yàn)研究中，要采集

4、實(shí)驗(yàn)動物的血液進(jìn)行檢查或分析，故必須掌握血液的正確采集、分離和保存分析，故必須掌握血液的正確采集、分離和保存的操作技術(shù)。的操作技術(shù)。 采血方法的選擇，主要決定于實(shí)驗(yàn)的目的所需血采血方法的選擇，主要決定于實(shí)驗(yàn)的目的所需血量以及動物種類。量以及動物種類。 用血量較少可刺破組織取毛細(xì)血管的血用血量較少可刺破組織取毛細(xì)血管的血 當(dāng)需血量較多時(shí)可作靜脈采血當(dāng)需血量較多時(shí)可作靜脈采血（原則：靜脈采血時(shí)，若需反復(fù)多次，應(yīng)自遠(yuǎn)離心（原則：靜脈采血時(shí)，若需反復(fù)多次，應(yīng)自遠(yuǎn)離心臟端開始，以免發(fā)生栓塞而影響整條靜脈臟端開始，以免發(fā)生栓塞而影響整條靜脈) )實(shí)驗(yàn)原理 現(xiàn)將采用血方法按動物和部位分別加以介紹?，F(xiàn)將采用血

5、方法按動物和部位分別加以介紹。 小鼠和大鼠采血方法：割尾采血法、尾靜脈穿刺采血、小鼠和大鼠采血方法：割尾采血法、尾靜脈穿刺采血、眼眶后靜脈叢采血、摘眼球法、斷頭采血、頸（股）動眼眶后靜脈叢采血、摘眼球法、斷頭采血、頸（股）動靜脈采血靜脈采血 豚鼠采血法：耳緣剪口采血豚鼠采血法：耳緣剪口采血 、心臟采血、心臟采血 、股動脈采、股動脈采血血 、背中足靜脈取血、背中足靜脈取血 兔采血法：耳靜脈采血兔采血法：耳靜脈采血 、耳中央動脈采血、耳中央動脈采血 、心臟取、心臟取血血 、后肢脛部皮下靜脈取血、后肢脛部皮下靜脈取血 、股動靜脈、頸動靜脈取、股動靜脈、頸動靜脈取血血 、 雞采血法雞采血法 ：翼根靜脈

6、采血、心臟采血、頸靜脈采血：翼根靜脈采血、心臟采血、頸靜脈采血實(shí)驗(yàn)原理家兔采血方法家兔采血方法 （1 1）耳緣靜脈采血：）耳緣靜脈采血： 家兔固定，將耳緣靜脈皮膚上的毛拔去或剪去，家兔固定，將耳緣靜脈皮膚上的毛拔去或剪去，75%75%酒精消毒，酒精消毒，用左手食指和中指夾住靜脈近心端，以使其血管怒張拇指和小指用左手食指和中指夾住靜脈近心端，以使其血管怒張拇指和小指夾住耳緣部分，以左手無名指和小指放在耳下作墊，待靜脈充盈夾住耳緣部分，以左手無名指和小指放在耳下作墊，待靜脈充盈后，右手持注射器使針頭由靜脈末端刺入，順血管方向向心端刺后，右手持注射器使針頭由靜脈末端刺入，順血管方向向心端刺約約1-1

7、.5cm1-1.5cm，放松左手拇指和食指對血管的壓迫，右手緩慢抽吸，放松左手拇指和食指對血管的壓迫，右手緩慢抽吸注射器，若注射阻力較大，說明針頭沒有刺入靜脈，應(yīng)調(diào)整針頭注射器，若注射阻力較大，說明針頭沒有刺入靜脈，應(yīng)調(diào)整針頭或重新穿刺；也可以刀片在血管上切一小口，讓血自然流出，滴或重新穿刺；也可以刀片在血管上切一小口，讓血自然流出，滴入盛器內(nèi)，采血完畢，用干棉球按壓止血。入盛器內(nèi)，采血完畢，用干棉球按壓止血。（2 2）兔心臟穿刺取血：）兔心臟穿刺取血： 家兔背位固定，在左胸第家兔背位固定，在左胸第2 24 4肋間剪毛一塊，用肋間剪毛一塊，用75%75%酒精和碘伏消毒。然后用酒精和碘伏消毒。然

8、后用5 510ml10ml注射器，在胸骨左緣注射器，在胸骨左緣3-43-4肋間心尖搏動最明顯處作垂直穿刺。肋間心尖搏動最明顯處作垂直穿刺。 注意事項(xiàng)有：注意事項(xiàng)有：動作宜迅速，以縮短在心臟內(nèi)的留針時(shí)間和防止血液凝動作宜迅速，以縮短在心臟內(nèi)的留針時(shí)間和防止血液凝固；固；如針頭已進(jìn)入心臟但抽不出血時(shí)，應(yīng)將針頭稍微后退一如針頭已進(jìn)入心臟但抽不出血時(shí)，應(yīng)將針頭稍微后退一點(diǎn)。點(diǎn)。在胸腔內(nèi)針頭不應(yīng)左右擺動以防止傷及心，肺、在胸腔內(nèi)針頭不應(yīng)左右擺動以防止傷及心，肺、實(shí)驗(yàn)原理豚鼠采血方法豚鼠采血方法 （1 1）背中足靜脈取血）背中足靜脈取血 固定動物，將動物腳背面用酒精消毒，找出背中固定動物，將動物腳背面用酒

9、精消毒，找出背中足靜脈后，以左手的拇指和食指拉住豚鼠的趾端，右足靜脈后，以左手的拇指和食指拉住豚鼠的趾端，右手拿的注射針刺入靜脈。采血后，用紗布或脫脂棉壓手拿的注射針刺入靜脈。采血后，用紗布或脫脂棉壓迫止血。反復(fù)采血時(shí)，兩后肢交替使用。迫止血。反復(fù)采血時(shí)，兩后肢交替使用。 （2 2）心臟采血）心臟采血 通常在胸骨左緣的正中，選心跳最強(qiáng)的部位作穿刺。通常在胸骨左緣的正中，選心跳最強(qiáng)的部位作穿刺。針頭宜稍細(xì)長些，以免發(fā)生手術(shù)后穿刺孔出血，其操針頭宜稍細(xì)長些，以免發(fā)生手術(shù)后穿刺孔出血，其操作手法詳見兔心臟采血。作手法詳見兔心臟采血。實(shí)驗(yàn)動物的采血量動物種類 最大安全采血量（ml） 最大致死采血量（m

10、l）小白鼠0.10.3大白鼠12豚鼠510家兔1040狗50300猴1560血清的制備血清的制備：不加抗凝劑血清的制備：不加抗凝劑 無菌靜脈采血無菌靜脈采血2ml2ml，3737自然凝固，待血清開始出現(xiàn)后，自然凝固，待血清開始出現(xiàn)后，放冰箱內(nèi)放冰箱內(nèi)1212小時(shí)或小時(shí)或2424小時(shí)，離心分離血清（小時(shí)，離心分離血清（3000rpm3000rpm，5-10min5-10min），得到的上清液即為血清，小心將上清吸出），得到的上清液即為血清，小心將上清吸出（注意切勿吸出細(xì)胞成分）。（注意切勿吸出細(xì)胞成分）。血漿的制備：需加抗凝劑（抗凝劑：血液血漿的制備：需加抗凝劑（抗凝劑：血液 = 1= 1：9

11、9） 無菌靜脈采血無菌靜脈采血2ml2ml（注射器用抗凝劑潤洗），（注射器用抗凝劑潤洗），將血液將血液加加入到有抗凝劑的離心管中顛倒混勻，離心（入到有抗凝劑的離心管中顛倒混勻，離心（3000rpm3000rpm，5-10min5-10min）后所得的上清液即為血漿。）后所得的上清液即為血漿。注意：血清的保存可以在每注意：血清的保存可以在每50ml50ml血清中加血清中加1 1硫柳汞水溶硫柳汞水溶液液1ml1ml防腐。防腐。紅細(xì)胞及懸液制備標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞的制備：標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞的制備： 取全血取全血1ml1ml，加等滲鹽水，加等滲鹽水2 23ml3ml，充分搖勻離心沉淀，充分搖勻離心沉淀，棄去上清液，然后

12、再加生理鹽水棄去上清液，然后再加生理鹽水2 23ml 3ml 按上述方法洗按上述方法洗滌，共三次，離心去上清，余下的為壓積紅細(xì)胞。滌，共三次，離心去上清，余下的為壓積紅細(xì)胞。紅細(xì)胞懸液的制備：紅細(xì)胞懸液的制備： 2 2紅細(xì)胞懸液：壓積紅細(xì)胞紅細(xì)胞懸液：壓積紅細(xì)胞2 2滴滴+ +新鮮等滲鹽水新鮮等滲鹽水4ml 4ml 5 5紅細(xì)胞懸液：壓積紅細(xì)胞紅細(xì)胞懸液：壓積紅細(xì)胞5 5滴滴+ +新鮮等滲鹽水新鮮等滲鹽水4ml4ml 10 10紅細(xì)胞懸液：壓積紅細(xì)胞紅細(xì)胞懸液：壓積紅細(xì)胞5 5滴滴+ +新鮮等滲鹽水新鮮等滲鹽水2ml2ml注意：注意： 標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞鹽水懸液臨用前制備，最多存放標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞鹽水懸液臨

13、用前制備，最多存放3 3天，天，用用檸檬酸葡萄糖溶液（檸檬酸葡萄糖溶液（ACDACD）溶液保存最長可保存溶液保存最長可保存1 1周周實(shí)驗(yàn)器材 實(shí)驗(yàn)動物：豚鼠、兔實(shí)驗(yàn)動物：豚鼠、兔 實(shí)驗(yàn)試劑：血液抗凝劑（實(shí)驗(yàn)試劑：血液抗凝劑（1:500u肝素鈉注射液）肝素鈉注射液） 生理鹽水生理鹽水 實(shí)驗(yàn)器材：實(shí)驗(yàn)器材：5ml注射器、注射器、 一次性離心管（一次性離心管（5、10、15ml規(guī)格）、規(guī)格）、 普通吸管、尖吸管、普通吸管、尖吸管、1ml刻度吸管刻度吸管 75%酒精棉球酒精棉球 水平離心機(jī)水平離心機(jī)實(shí)驗(yàn)步驟1.1.用用7575酒精棉球消毒采血部位皮膚酒精棉球消毒采血部位皮膚2.2.用用5ml5ml注射器分別抽取豚鼠或兔靜脈血注射器分別抽取豚鼠或兔靜脈血2 2mlml 豚鼠采血法豚鼠采血法 ：背中足靜脈取血：背中足靜脈取血 心臟采血、心臟采血、 兔采血法：耳緣靜脈采血兔采血法：耳緣靜脈采血 心臟采血心臟采血 3.3.制備血清、紅細(xì)胞（如上述流程）制備血清、紅細(xì)胞（如上述流程）注意事項(xiàng)：1 1、采血部位需要進(jìn)行消毒、采血部位需要進(jìn)行消毒2 2、采血用的注射器和試管必須保持清潔干燥；、采血用的注射器和試管必須保持清潔干燥；3 3、注意血清與血漿制備的區(qū)別：抗凝劑