Ni柱純化His-tag蛋白質(zhì)

1、Ni柱純化His-tag蛋白質(zhì)一非變性條件下抽提His-Tag蛋白質(zhì)下列方法適用于從細(xì)菌中抽提通常含有連續(xù)6個組氨酸尾（HisTagProtein）的具有天然結(jié)構(gòu)的可溶性重組蛋白質(zhì)（NativeProtein）。其他來源的蛋白質(zhì)樣品，如果目標(biāo)蛋白質(zhì)具有His-Tag結(jié)構(gòu)，提供的層析方法可供參考。1.樣品準(zhǔn)備1）準(zhǔn)備細(xì)胞，接種，誘導(dǎo)表達(dá)。對于實驗室用的pET載體表達(dá)系列，在細(xì)胞OD600=0.5-0.8時，用ImMIPTG誘導(dǎo)1-3小時，可以獲得理想的表達(dá)效率。收集細(xì)胞，置于-70度或立即進(jìn)行步驟2操作。2）加入1/20細(xì)胞生長體積的NTA-0BuffeK20mMTris-HClpH7.9,0.

2、5MNaCl,10%Glycerol）和PMSF。PMSF用無水乙醇配制成200mM儲存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作濃度位1mM；注意：PMSF見水分解，需要在使用前加入。該步驟冰上操作。3）將細(xì)胞懸浮起來，加入溶菌酶（工作濃度位0.2-0.4mg/ml,如果表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶），混勻，冰上放置30分鐘，超聲或勻漿破碎細(xì)胞。該步驟冰上操作。4）加入10%TritonX-100,使Triton的終濃度為0.05%，充分混勻，冰上放置15分鐘，間或混勻）；冰上超聲破碎細(xì)胞，同時降低粘稠度。5）加入1MMgCl2，使MgCl2的終濃度為1mM,混勻

3、。加入DNase,使DNase的終濃度為10mg/m1,混勻，室溫放置10分鐘。6）5000轉(zhuǎn)/分（20,000xg以上），4度離心15分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20度保存。2層析1）將NTA樹脂裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的NTA-0Buffer洗。2）將樣品（步驟2（6）加到NTA層析柱中，流速控制在15ml/小時左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。3）層析用5倍NTA體積的NTA-0Buffer洗，流速控制在30ml/小時左右。4）分別用5倍NTA體積的NTA-20,NTA-40,NTA-60,NTA-80,NTA-100,NTA-200,N

4、TA-1000Buffer洗脫，流速控制在15ml/小時左右，收集洗脫液，每管收集一個NTA體積。5）確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。最為有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用BBST的Bradford蛋白質(zhì)測定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的分布。6）目標(biāo)蛋白質(zhì)需要進(jìn)一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定。純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)的保存條件需要根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和用途確定。附溶液配方：NTA-0Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,NTA-20Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10

5、%Glycerol,20mMImidazole咪唑）NTA-40Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,40mMImidazole咪唑）NTA-60Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,60mMImidazole咪唑）NTA-80Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,80mMImidazole咪唑）NTA-100Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,100mMImidazole咪唑）

6、NTA-200Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,200mMImidazole咪唑）NTA-1000Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,1000mMImidazole（咪唑）二變性條件下從包涵體中純化His-Tag的蛋白質(zhì)有些蛋白質(zhì)細(xì)菌或其他細(xì)胞中表達(dá)效率很高，但溶解性很差，通常形成包涵體。這些蛋白質(zhì)的溶解通常需要用鹽酸胍或尿素。與MBP和GST的親和層析材料相比，NTA樹脂可以在6M的鹽酸胍存在的情況下與具有HisTag的蛋白質(zhì)結(jié)合。整個層析過程都是在有鹽酸胍的條件下進(jìn)行。純化后的

7、蛋白質(zhì)需要進(jìn)行復(fù)性，正確復(fù)性的蛋白質(zhì)才具有生物學(xué)活性。下列方法（步驟4-5）用于從細(xì)菌中抽提含His-Tag位于包涵體變性蛋白質(zhì)。1樣品準(zhǔn)備1）準(zhǔn)備細(xì)胞，接種，誘導(dǎo)表達(dá)。對于實驗室用的pET載體表達(dá)系列，在細(xì)胞OD600=0.5-0.8時，用1mMIPTG誘導(dǎo)1-3小時，可以獲得理想的表達(dá)效率。收集細(xì)胞，置于-70度或立即進(jìn)行步驟2操作。2）加入1/20細(xì)胞生長體積的GuNTA-0Buffer（20mMTris-HClpH7.9，0.5MNaCl，10%Glycerol,6MGuanidiumHCl）和PMSF。PMSF用無水乙醇配制成200mM儲存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作濃

8、度位1mM；注意：PMSF見水分解，需要在使用前加入。3）將細(xì)胞懸浮起來，冰上超聲破碎細(xì)胞，降低粘稠度。4）室溫放置30分鐘，間或混勻或用磁力攪拌。5）15000轉(zhuǎn)/分（20,000xg以上），4度離心15分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20度保存。2層析1）將NTA樹脂裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的GuNTA-0Buffer洗。2）將樣品（步驟2（5）加到NTA層析柱中，流速控制在15ml/小時左右，收集穿透部分,用于SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。3）層析用5倍NTA體積的GuNTA-0Buffer洗，流速控制在30ml/小時左右。4）分別用5倍NTA體積GuNTA-2

9、0,GuNTA-40,GuNTA-60,GuNTA-100,GuNTA-500洗脫，流速控制在15ml/小時左右，收集洗脫液，每管收集一個NTA體積。5）確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。最為有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用BBST的Bradford蛋白質(zhì)測定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的分布。6）目標(biāo)蛋白質(zhì)需要進(jìn)一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定。7）純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)需要復(fù)性，復(fù)性常用的手段可以參考有關(guān)手冊確定的原則，根據(jù)蛋白質(zhì)的特性來摸索具體的方案。附溶液配方：GuNTA-0Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10

10、%Glycerol,6MGuanidiumHClGuNTA-20Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,6MGuanidiumHCl,20mMImidazoleGuNTA-40Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,6MGuanidiumHCl,40mMImidazoleGuNTA-60Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,6MGuanidiumHCl,60mMImidazoleGuNTA-100Buffer:20mMTris-HClpH

11、7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,6MGuanidiumHCl,100mMImidazoleGuNTA-500Buffer:20mMTris-HClpH7.9,0.5MNaCl,10%Glycerol,6MGuanidiumHCl,500mMImidazole附：NTA樹脂的再生NTA樹脂在使用若干次數(shù)(3-5次)后，結(jié)合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高樹脂的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。注意：NTA樹脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶液，估計出NTA的樹脂體積，按下列次序?qū)⒃偕噭┘拥綄游鲋铮诘壬弦辉偕芤毫鞲珊?，再加下一再生溶解。用戶需要自行?zhǔn)備25%,50%,75%，100%(v/v)乙醇和去離子水。NTA再生步驟：(1) 從層析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA樹脂體積的0.2MAceticAcid/6MguanidineHC1洗。(2) 用2倍體積的去離子水洗。(3) 用3倍體積的2%SDS洗。(4) 用1倍體積的25%乙醇洗。(5) 用1倍體積的50%乙醇洗。(6) 用1倍體積的75%乙醇洗。(7) 用5倍體積的100%乙醇洗。(8) 用1倍體積的75%乙醇洗。(9) 用1倍體積的50%乙醇洗。(10) 用1倍體積的2