瘧原蟲檢驗技術

1、 瘧原蟲檢驗技術瘧原蟲檢驗技術 - -血片制作、染色及瘧原蟲形態(tài)鑒別血片制作、染色及瘧原蟲形態(tài)鑒別黔東南州疾控中心黔東南州疾控中心檢驗科檢驗科潘雪雪 寄生人體的四種瘧原蟲寄生人體的四種瘧原蟲間日瘧原蟲間日瘧原蟲 P. vivaxP. vivax，P.vP.v 惡性瘧原蟲惡性瘧原蟲 P PFalciparum,P.fFalciparum,P.f 三日瘧原蟲三日瘧原蟲 P PMalariae,P.mMalariae,P.m 卵形瘧原蟲卵形瘧原蟲 P POvale,P.oOvale,P.o 我國主要是間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲；另我國主要是間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲；另二種少見，近年偶見國外輸入病例。二種少

2、見，近年偶見國外輸入病例。 其它瘧原蟲 諾氏瘧原蟲諾氏瘧原蟲(Plasmodium nowlesi)內(nèi)容提綱內(nèi)容提綱血片制作與染色血片制作與染色瘧原蟲計數(shù)瘧原蟲計數(shù)瘧原蟲的基本形態(tài)特征瘧原蟲的基本形態(tài)特征血片制作血片制作第一步：第一步：載玻片的清洗載玻片的清洗用加有洗潔精或洗衣粉的熱水洗滌，清水用加有洗潔精或洗衣粉的熱水洗滌，清水沖洗后涼干，浸于沖洗后涼干，浸于95% 95% 的乙醇中的乙醇中1 1小時以上小時以上用綢布擦干置干燥環(huán)境中保存。用綢布擦干置干燥環(huán)境中保存。第二步：患都信息的核實采集血樣涂片時，首先要核對患者的姓名和年齡并在玻片的右側編號第三步：采集血樣第三步：采集血樣 采血部位：

3、采血部位：耳垂耳垂或無名指，或無名指， 取血方法：取血方法：通常在耳垂取血，通常在耳垂取血，先用先用75%75%酒精棉球消毒取血部位酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和，待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方或無名指指食指緊捏耳垂上方或無名指指尖，右手持消毒針迅速刺入皮尖，右手持消毒針迅速刺入皮膚，不宜過深或過淺。然后用膚，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕擠壓出血。厚血右手中指輕輕擠壓出血。厚血膜血量約一粒米大小膜血量約一粒米大小, ,薄血膜血薄血膜血量為厚血膜的一半或量為厚血膜的一半或1/31/3。厚血膜厚血膜 用推片的一角，從取用推片的一角，從取血部位刮取約血部位刮取約4 4

4、微升血量微升血量（相當于火柴頭大?。?，（相當于火柴頭大?。?，使血滴與平置的載玻片接使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個方向觸，再由里向外一個方向旋轉，轉旋轉，轉2424圈，涂成直圈，涂成直徑徑0.810.81厘米大小圓形厚厘米大小圓形厚血膜血膜薄血膜薄血膜再取一小滴血再取一小滴血. .將血置將血置于第一張玻片離厚血膜適于第一張玻片離厚血膜適 當遠的地方當遠的地方. .將將 推片的邊推片的邊緣緊貼載玻片，輕輕上下緣緊貼載玻片，輕輕上下移動，使血液沿邊緣散開，移動，使血液沿邊緣散開，然后勻速地向前推進，形然后勻速地向前推進，形成薄而平鋪的薄血膜成薄而平鋪的薄血膜第四步：血片制作第四步：血片制作

5、厚血膜薄血膜制片過程圖示標簽標準的瘧疾厚薄血膜片標準的瘧疾厚薄血膜片標簽厚血膜血量不宜過多或過少薄血膜平整,無皺折和空泡.顯微鏡下紅細胞單層排列血片的制作血片制作影響因素血片制作影響因素載玻片必須清潔無油污，理想的薄血膜是一層血細胞均勻載玻片必須清潔無油污，理想的薄血膜是一層血細胞均勻分布不重疊、無裂縫、無皺折和空泡，血膜末端呈舌狀；分布不重疊、無裂縫、無皺折和空泡，血膜末端呈舌狀；厚血膜厚度以一個油鏡視野內(nèi)可見厚血膜厚度以一個油鏡視野內(nèi)可見5-105-10個白細胞為宜；個白細胞為宜；血片制作場所要保持清潔，以免塵埃沾污血膜，防止蒼蠅血片制作場所要保持清潔，以免塵埃沾污血膜，防止蒼蠅等舔食血膜

6、；等舔食血膜；制成的血片在未干前不能傾斜放置，待其自然干燥，不要制成的血片在未干前不能傾斜放置，待其自然干燥，不要加熱，加熱會使原蟲變形，影響鏡檢結果加熱，加熱會使原蟲變形，影響鏡檢結果血片染色血片染色 兩種染色方法:吉氏染色法 1. 染色原液配制 2. 門診快染、慢染 3. 成批染色和溶血染色 瑞氏染色法 WHO推薦使用吉氏染色法吉氏染液吉氏染液( (原液原液) )的配置的配置 吉氏染粉吉氏染粉 (Azure B type) 5g 甘油甘油 ( (純純) ) 250ml 甲醇甲醇 ( (純純) ) 250ml吉氏粉放入研缽中，加少量甘油充分研磨吉氏粉放入研缽中，加少量甘油充分研磨, , 然后

7、邊加邊磨，然后邊加邊磨，直至甘油加完，將研磨的染液倒入棕色瓶中，在直至甘油加完，將研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研缽中加入研缽中加入少許甲醇清洗研缽，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，少許甲醇清洗研缽，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反復數(shù)次，直至甲醇用完。蓋好瓶蓋，將染液充分搖勻，置反復數(shù)次，直至甲醇用完。蓋好瓶蓋，將染液充分搖勻，置于室內(nèi)，每天晃動數(shù)分鐘，存放一周后于室內(nèi)，每天晃動數(shù)分鐘，存放一周后經(jīng)過濾經(jīng)過濾即可使用。保即可使用。保存時間越長染色效果越好。存時間越長染色效果越好。整個染色液配制時間不能少于整個染色液配制時間不能少于5 5個小時個小時血片的染色血片的染色染色用水和沖洗用水配

8、制u常用中性的蒸餾水或經(jīng)煮沸過濾的冷開水u用pH7.0pH7.2的緩沖液。血片染色薄血膜的固定薄血膜的固定u厚血膜充分干燥, 用甲醇固定薄血膜， 平放待干（要點：甲醇不能觸碰到厚血膜）u操作操作1 1 （快染）（快染） 量筒內(nèi)量筒內(nèi)量量2ml2ml緩沖液緩沖液(PBSPH7.0) (PBSPH7.0) 或凈水，直接滴加吉氏原或凈水，直接滴加吉氏原液液7 7滴，混勻，滴入待染標滴，混勻，滴入待染標本的厚薄血膜上，染色本的厚薄血膜上，染色10min10min，清水緩緩沖洗，晾，清水緩緩沖洗，晾干干（血膜朝內(nèi)面）（血膜朝內(nèi)面）鏡檢。鏡檢。u操作操作2 (2 (慢染慢染) ) 量筒量筒內(nèi)量內(nèi)量2ml2

9、ml緩沖液或凈水，緩沖液或凈水， 再滴加吉氏原液再滴加吉氏原液4 4滴，混勻滴，混勻，滴入待染標本上，染色，滴入待染標本上，染色30min30min。清水緩緩沖洗，晾。清水緩緩沖洗，晾干鏡檢。干鏡檢。血片染色將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液（3毫升吉氏染色液加緩沖液或凈水97毫升，混勻）浸沒血片，染色30分鐘。（如染液稀釋液不合標準時，得酌情增減染色時間和濃度），然后用清水輕輕將染液漂洗干凈，將染色片插于晾干板上晾干，包裝，待鏡檢。 u成批血片染色厚血膜溶血染色放置多時未染色的血片（3天以上，薄片已用甲醇固定），染色之前，須在厚血膜上用清水進行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%

10、吉氏染色液染色30分鐘。然后用清水漂洗干凈,晾干。質(zhì)量好的染色質(zhì)量好的染色 顯微鏡下核呈紅色顯微鏡下核呈紅色, ,胞漿呈藍色，薄血膜平整，紅細胞單層排列胞漿呈藍色，薄血膜平整，紅細胞單層排列 如果血片偏紅如果血片偏紅, ,說明染液偏酸性說明染液偏酸性如果血片偏藍如果血片偏藍, ,說明染液偏鹼性說明染液偏鹼性外觀吉氏染色血片偏 酸偏 堿標 準配置完吉氏原液時必須過濾除去雜質(zhì)顆粒，有助配置完吉氏原液時必須過濾除去雜質(zhì)顆粒，有助于提高鏡檢質(zhì)量于提高鏡檢質(zhì)量；染液稀釋后使用時間：染液稀釋后使用時間：原液必須臨用時稀釋，隨原液必須臨用時稀釋，隨配隨用；配隨用；染液的稀釋濃度；染液的稀釋濃度；染色時間。染

11、色時間。染色質(zhì)量影響因素染色質(zhì)量影響因素l用水過酸，用水過酸，可致感可致感染的染的RBCRBC上的點彩上的點彩染不出來；染不出來；l用水過堿，用水過堿，則使薄則使薄血膜上的血膜上的RBCRBC染成染成灰藍色，致使灰藍色，致使R R的的胞漿難以辨論。胞漿難以辨論。染色染色稀釋稀釋用水用水: PH7.0-7.2清潔水清潔水。染色質(zhì)量影響因素染色質(zhì)量影響因素固定薄血膜時不要將甲醇觸碰到厚血膜；固定薄血膜時不要將甲醇觸碰到厚血膜；血膜在制備后應盡量能在當天染色，一般夏血膜在制備后應盡量能在當天染色，一般夏天不超過天不超過4848小時，冬天也不能超過小時，冬天也不能超過7272小時小時, ,放置放置時間

12、越久，厚血膜越不易脫血，染色效果也差。時間越久，厚血膜越不易脫血，染色效果也差。染色質(zhì)量影響因素染色質(zhì)量影響因素瘧原蟲鏡檢 瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點 瘧原蟲密度計數(shù)方法 人體四種瘧原蟲的形態(tài)特征當前分子生物學、血清學技術快速發(fā)展當前分子生物學、血清學技術快速發(fā)展, ,但是厚薄血片的檢查仍被認為是不可替但是厚薄血片的檢查仍被認為是不可替 代的確診瘧疾的代的確診瘧疾的 “金標準金標準” 顯微鏡檢查是唯一可查到原蟲實體并鑒顯微鏡檢查是唯一可查到原蟲實體并鑒別別4 4種人體瘧原蟲種人體瘧原蟲原蟲鏡檢-金標準瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點 厚血膜 薄血膜 優(yōu)點優(yōu)點血量多，面積小，血量多，面積小，原蟲原蟲檢

13、出率高檢出率高經(jīng)甲醇固定，紅細胞完經(jīng)甲醇固定，紅細胞完整，原蟲形態(tài)改變不大，整，原蟲形態(tài)改變不大，原蟲易于辨認原蟲易于辨認 缺點缺點原蟲在干燥過程中皺縮，原蟲在干燥過程中皺縮，紅細胞消失，原蟲變形較紅細胞消失，原蟲變形較大，大，原蟲鑒定困難原蟲鑒定困難血量比厚血膜少許多，血量比厚血膜少許多，但面積是厚血膜的但面積是厚血膜的8-108-10倍。檢查費時，倍。檢查費時，原蟲檢原蟲檢出率較低出率較低用途用途用于瘧疾病人檢查用于瘧疾病人檢查原蟲蟲種、蟲期鑒定及原蟲蟲種、蟲期鑒定及初學者教學標本初學者教學標本瘧原蟲密度計算瘧原蟲密度計算計算瘧原蟲密度的三種方法：計算瘧原蟲密度的三種方法： 白細胞原蟲密度

14、計數(shù)法白細胞原蟲密度計數(shù)法( (厚血膜厚血膜 WHO)WHO) 優(yōu)點：可作為定性和定量分析優(yōu)點：可作為定性和定量分析 半定量計數(shù)法半定量計數(shù)法 ( (厚血膜厚血膜) ) 優(yōu)點：方法簡便優(yōu)點：方法簡便 缺點：只能定性，不宜作為定量分析缺點：只能定性，不宜作為定量分析 紅細胞感染密度計算法紅細胞感染密度計算法( (薄血膜薄血膜) )白細胞原蟲密度計數(shù)法白細胞原蟲密度計數(shù)法鏡檢厚血膜，按視野順序，記錄鏡檢厚血膜，按視野順序，記錄200200個白細胞中的個白細胞中的瘧原蟲數(shù)，如果原蟲密度較低（瘧原蟲數(shù)，如果原蟲密度較低（200200個白細胞中小個白細胞中小于于100100個瘧原蟲），可增加白細胞，計數(shù)

15、個瘧原蟲），可增加白細胞，計數(shù)500500個。個。密度單位密度單位: :原蟲數(shù)原蟲數(shù)/l/l計算公式：瘧原蟲數(shù)計算公式：瘧原蟲數(shù) 計數(shù)的白細胞數(shù)計數(shù)的白細胞數(shù) 患者患者每微升血白細胞數(shù)每微升血白細胞數(shù) = = 瘧原蟲數(shù)瘧原蟲數(shù)/l/l血。血。如果不知患者的白細胞數(shù)，則每微升血以如果不知患者的白細胞數(shù)，則每微升血以80008000個個白細胞計數(shù)白細胞計數(shù)( (國際標準國際標準) ) 。白細胞原蟲密度計數(shù)法白細胞原蟲密度計數(shù)法從血膜的左上角開始，橫向。從血膜的左上角開始，橫向。計數(shù)計數(shù)1 1個視野后，每次間隔個視野后，每次間隔5 5個視野個視野, ,再計數(shù)。再計數(shù)。厚血膜厚血膜 不需要計數(shù)的視野

16、需要進行白細胞、瘧原蟲計數(shù)的視野如果該視野無原蟲，則計數(shù)白細胞數(shù) 看到第一個原蟲開始計數(shù) 白細胞原蟲密度計數(shù)方法白細胞瘧原蟲計數(shù)法白細胞瘧原蟲計數(shù)法例如例如 計數(shù)計數(shù)200 WBC200 WBC中有中有135135個瘧原蟲，在不知患個瘧原蟲，在不知患 者白細胞數(shù)的情況下，以每微升血者白細胞數(shù)的情況下，以每微升血8 0008 000個白細個白細 胞計數(shù)胞計數(shù), , 由此計算出每微升血液瘧原蟲密度為由此計算出每微升血液瘧原蟲密度為：135（計數(shù)的瘧原蟲數(shù)）200（計數(shù)的白細胞）x 8000（每微升血白細胞數(shù)） =5400 / l答：該患者的瘧原蟲密度為5400 / l。用厚血膜每個視野中所觀察到瘧

17、原蟲的平均數(shù)粗略地估算出瘧原蟲密度。此方法將密度分為6級：1.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個以內(nèi)，記錄實際數(shù)字2.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個以上，但平均每個視野不到1個蟲，記錄“少”3.平均每個視野15個蟲，記錄“”4.平均每個視野6 10個蟲，記錄“+”5.平均每個視野11 100個蟲，記錄“+ ”6.平均每個視野100個蟲以上，記錄“+ ”。 如：Pv R+T+S5G少 這種方法簡便，缺點是計數(shù)的瘧原蟲數(shù)受血膜厚薄影響，只能定性，不宜作定量分析。半定量計數(shù)法如何確定瘧原蟲血片為陰性 檢查全部厚血膜視野未查見瘧原蟲 最少檢查100個厚血膜視野未查見 瘧原蟲（臨床病人）人體四種瘧原蟲的分布人體

18、四種瘧原蟲的分布瘧原蟲鏡檢感染人的瘧原蟲有四種感染人的瘧原蟲有四種: : 惡性瘧原蟲惡性瘧原蟲 P. falciparumP. falciparum間日瘧原蟲間日瘧原蟲 P. vivaxP. vivax三日瘧原蟲三日瘧原蟲 P. malariaeP. malariae 卵形瘧原蟲卵形瘧原蟲 P. ovaleP. ovale 惡性瘧惡性瘧 P.falciparumP.falciparum 分布熱帶、亞熱帶，是非洲的重要疾病分布熱帶、亞熱帶，是非洲的重要疾病 我國流行區(qū)域為云南省和海南省我國流行區(qū)域為云南省和海南省 四種瘧原蟲中致病力最強四種瘧原蟲中致病力最強，無免疫力者，無免疫力者 感染后出現(xiàn)急

19、性癥狀感染后出現(xiàn)急性癥狀, ,不及時治療可不及時治療可危及危及生命（腦型瘧）生命（腦型瘧）間日瘧間日瘧 P.vivaxP.vivax 間日瘧原蟲分布于我國大部分地區(qū)間日瘧原蟲分布于我國大部分地區(qū), ,主要是中部地區(qū)主要是中部地區(qū) 病程良性病程良性, , 有復發(fā)有復發(fā) 遍布全球溫帶地區(qū)及大片熱帶地區(qū)。在熱 帶非洲，特別是西非則很少見三日瘧三日瘧 P.malariaeP.malariae 遍及熱帶和亞熱帶地區(qū)，特別是東、西非洲，圭亞那及遍及熱帶和亞熱帶地區(qū)，特別是東、西非洲，圭亞那及印度部分地區(qū)，呈片狀、塊狀分布印度部分地區(qū)，呈片狀、塊狀分布三日瘧在我國非常少見，只在南方廣西有過散在報告三日瘧在我

20、國非常少見，只在南方廣西有過散在報告卵形瘧卵形瘧 （蛋形瘧）（蛋形瘧） P.ovaleP.ovale主要分布非洲。太平洋地區(qū)、緬甸、東南亞有散在報告主要分布非洲。太平洋地區(qū)、緬甸、東南亞有散在報告在我國已基本消滅在我國已基本消滅 原蟲鏡檢血細胞紅細胞血小板白細胞（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞）紅細胞紅細胞是雙面凹的圓餅狀邊緣較厚，而中間較薄血小板各種血細胞模式圖 1.紅細胞 2.嗜酸性粒細胞 3.嗜堿性粒細胞 4.中性粒細胞 5.淋巴細胞 6.單核細胞 7.血小板 1234567瘧原蟲的基本形態(tài)特征瘧原蟲的基本形態(tài)特征瘧原蟲基本構造為細胞質(zhì)瘧原蟲基本構造為細胞質(zhì)(

21、 (胞漿胞漿) )、核和瘧色素；、核和瘧色素；原蟲：原蟲：經(jīng)吉氏或瑞氏染色：核呈紅色，胞質(zhì)呈經(jīng)吉氏或瑞氏染色：核呈紅色，胞質(zhì)呈蘭色，瘧色素為本色；蘭色，瘧色素為本色；細胞漿：細胞漿：藍色或深藍色，隨著蟲體發(fā)育長藍色或深藍色，隨著蟲體發(fā)育長大，細胞漿逐漸增多大，細胞漿逐漸增多；核：核：呈鮮紅色，呈圓形或橢圓形。核的結構致密，只有在個別發(fā)育階段較為疏松，例如間日瘧原蟲雄配子體的核。核核胞漿胞漿斑點斑點瘧色素：瘧色素：不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而異，瘧色素在蟲體內(nèi)散在分布或聚集成團塊。類而異，瘧色素在蟲體內(nèi)散在分布或聚集成團塊。間日瘧原蟲：呈短棒狀，黃

22、褐色；間日瘧原蟲：呈短棒狀，黃褐色；惡性瘧原蟲：呈細砂狀，黑褐色；惡性瘧原蟲：呈細砂狀，黑褐色；三日瘧原蟲：呈砂粒狀，深褐色；三日瘧原蟲：呈砂粒狀，深褐色；卵形瘧原蟲：與間日瘧原蟲相似。卵形瘧原蟲：與間日瘧原蟲相似。瘧原蟲的基本形態(tài)特征瘧原蟲的基本形態(tài)特征瘧色素瘧色素紅細胞不漲大紅細胞不漲大環(huán)狀體纖細環(huán)狀體纖細, , 常有多常有多重感染，環(huán)狀體內(nèi)重感染，環(huán)狀體內(nèi)可有可有2 2個核個核 環(huán)狀體可貼在紅細環(huán)狀體可貼在紅細胞邊緣胞邊緣 除環(huán)狀體，配子體除環(huán)狀體，配子體外沒有其他發(fā)育期外沒有其他發(fā)育期配子體呈新月形或配子體呈新月形或臘腸形臘腸形成熟裂殖體約含成熟裂殖體約含16-16-3232個裂殖子，

23、排列個裂殖子，排列不規(guī)則不規(guī)則可出現(xiàn)茂氏點可出現(xiàn)茂氏點惡性瘧（惡性瘧（P.falciparum） 鑒定要點鑒定要點21. A member of the UN forces in East Timor. Presented with high temperature. 1. 紅細胞明顯漲大 2. 薛氏點明顯 3. 成熟環(huán)狀體粗大4. 滋養(yǎng)體胞漿有阿米巴樣偽足5. 血片中可見各期的原蟲形態(tài)6. 成熟裂殖體約含12-24個裂殖子 間日瘧（P. vivax ） 鑒定要點2. Intermittent fever; arrived from India 2 months ago. 紅細胞不漲大或略小紅

24、細胞不漲大或略小環(huán)狀體中等大小，核較大環(huán)狀體中等大小，核較大，胞漿粗厚，胞漿粗厚胞漿不活躍呈帶狀形成熟胞漿不活躍呈帶狀形成熟滋養(yǎng)體呈滋養(yǎng)體呈菊花狀菊花狀, ,內(nèi)含內(nèi)含6-126-12個裂殖子個裂殖子雌雄配子體小于正常紅細雌雄配子體小于正常紅細胞，色素呈深褐色胞，色素呈深褐色?？刹橐姼麟A段的瘧原蟲?？刹橐姼麟A段的瘧原蟲三日瘧（三日瘧（P.malariae） 診斷要點診斷要點卵形瘧（P. ovale ） 鑒定要點1. 紅細胞正?；蚵詽q大 2. 常見慧星狀 (也稱齒輪狀)3. 環(huán)粗大 4. 薛氏點明顯 5. 成熟滋養(yǎng)體類似三日瘧原蟲但更粗大6. 成熟裂殖體約含6-12個裂殖子 18. Recent trip to Southern India- headaches and vaguely