定量PCR方法總結(jié)

1、實時熒光定量實時熒光定量PCR方法總結(jié)方法總結(jié) (Real time Quantitative PCR)內(nèi)容內(nèi)容實時熒光定量實時熒光定量PCR原理原理實時熒光定量實時熒光定量PCR大致步驟大致步驟注意事項注意事項實時熒光定量實時熒光定量PCR原理原理 實時熒光定量實時熒光定量PCR是在是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，反應(yīng)體系中加入熒光基團，熒光基團可與雙鏈熒光基團可與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出熒光而在游離時不發(fā)光，結(jié)合發(fā)出熒光而在游離時不發(fā)光，隨著隨著DNA擴增熒光信號逐漸增強，通過測定熒光信號強度擴增熒光信號逐漸增強，通過測定熒光信號強度實時監(jiān)測整個實時監(jiān)測整個PCR進程。進程。 SYBR Gre

2、en 熒光擴增曲線可以分成四個階段：基線期、指數(shù)增長期、熒光擴增曲線可以分成四個階段：基線期、指數(shù)增長期、線性增長期和平臺期。只有在指數(shù)增長期，線性增長期和平臺期。只有在指數(shù)增長期，PCR產(chǎn)物量的產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，所以選擇在這個對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，所以選擇在這個階段進行定量分析。階段進行定量分析。 基線期基線期指數(shù)增長期指數(shù)增長期線性增長期線性增長期平臺期平臺期一些術(shù)語一些術(shù)語術(shù)語術(shù)語作用作用基線基線PCR的最初幾次循環(huán)，在基線范圍內(nèi)熒光信號幾乎沒有變化，即擴增曲的最初幾次循環(huán)，在基線范圍內(nèi)熒光信號幾乎沒有變化，即擴增曲線的水平部分，默認值為線的水平部

3、分，默認值為3-15個循環(huán)個循環(huán)閾值閾值人為設(shè)定的一個值，一般是人為設(shè)定的一個值，一般是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。倍。閾值線與擴增曲線的交點就是閾值線與擴增曲線的交點就是CT值值CT值值從基線到指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)從基線到指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)陽性對照陽性對照監(jiān)控系統(tǒng)故障監(jiān)控系統(tǒng)故障陰性對照陰性對照NTC監(jiān)控污染監(jiān)控污染管家管家(內(nèi)參內(nèi)參)基因基因校準細胞數(shù)量、抽提效率、純化損失、反轉(zhuǎn)錄效率等生物學(xué)誤差，常用校準細胞數(shù)量、抽提效率、純化損失、反轉(zhuǎn)錄效率等生物學(xué)誤差，常用的有的有-actin、GAPDH參比熒光參比熒光(ROX)校準

4、移液槍、校準移液槍、PCR管質(zhì)量和儀器等物理誤差管質(zhì)量和儀器等物理誤差熔解曲線熔解曲線鑒定鑒定PCR有無雜帶、引物二聚體有無雜帶、引物二聚體實時熒光定量實時熒光定量PCR大致步驟大致步驟實時定量實時定量PCR提取總提取總RNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄電泳檢測電泳檢測（可?。墒。㏄CRPCR后電泳檢測引物后電泳檢測引物可行性、產(chǎn)物大小可行性、產(chǎn)物大小割膠純化，獲得標準割膠純化，獲得標準品，然后梯度稀釋品，然后梯度稀釋標準曲線標準曲線提取提取RNA： 用剪刀剪下用剪刀剪下50-100mg組織放入組織放入2ml離心管中，加入離心管中，加入1ml Trizol勻漿，一般勻漿，一般5-10s即可（即可（勻漿機使

5、用前須用勻漿機使用前須用0.1% DEPC溶液浸泡，檢查刀口是否有殘留組織溶液浸泡，檢查刀口是否有殘留組織）。然后加入）。然后加入氯仿離心，取上清（氯仿離心，取上清（勿吸入白色沉淀勿吸入白色沉淀）加入異丙醇離心，）加入異丙醇離心，棄上清用棄上清用75%乙醇洗滌沉淀，晾干后加入乙醇洗滌沉淀，晾干后加入DEPC水（由水（由0.1%DEPC溶液經(jīng)高壓制得）溶解，然后溶液經(jīng)高壓制得）溶解，然后盡快盡快反轉(zhuǎn)錄，如反轉(zhuǎn)錄，如要長期保存則放入液氮或超低溫冰箱。要長期保存則放入液氮或超低溫冰箱。 離心管不能用記號筆標號，可用鉛筆。離心管不能用記號筆標號，可用鉛筆。檢測及稀釋檢測及稀釋 用微量分光光度計測定用微

6、量分光光度計測定RNA溶液的純度（溶液的純度（OD260/OD280要要在在1.82.0之間）和濃度，然后將各樣品之間）和濃度，然后將各樣品RNA稀釋至統(tǒng)一稀釋至統(tǒng)一濃度（如濃度（如1g/L）。）。 如果要電泳檢測如果要電泳檢測RNA完整性，最好采用甲醛變性凝膠電泳。完整性，最好采用甲醛變性凝膠電泳。 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄 按試劑盒說明書，將除模板按試劑盒說明書，將除模板RNA外的所有試劑加在一個外的所有試劑加在一個1.5ml離心管中，然后混勻后分加到各離心管中，然后混勻后分加到各0.2 ml離心管中，離心管中，并且大約每并且大約每10個樣需多制備一個樣的混合液。最好采用個樣需多制備一個樣的混合液。最

7、好采用20L體系。之后定量的混合液也需按此操作。反轉(zhuǎn)錄獲體系。之后定量的混合液也需按此操作。反轉(zhuǎn)錄獲得得cDNA之后可分裝后之后可分裝后-20長期保存。長期保存。mRNAcDNA引物設(shè)計引物設(shè)計 登錄登錄，搜索目的基因，搜索目的基因mRNA序列（可能不止一個），然后用序列（可能不止一個），然后用primer premier 5.0軟件設(shè)計引物軟件設(shè)計引物，根據(jù)各項參數(shù)可對設(shè)計的引物進行適根據(jù)各項參數(shù)可對設(shè)計的引物進行適當(dāng)調(diào)整。大連寶生物公司（當(dāng)調(diào)整。大連寶生物公司（Takara）免費提供引物設(shè)計服）免費提供引物設(shè)計服務(wù)，但不是絕對能設(shè)計出來。

8、務(wù)，但不是絕對能設(shè)計出來。 示例示例雞胰蛋白酶雞胰蛋白酶原原mRNAprimer premier 5.0軟件設(shè)計引物流程軟件設(shè)計引物流程將將mRNA序列粘貼到欄中，然后點擊序列粘貼到欄中，然后點擊Primer 打開軟件，點擊打開軟件，點擊FileNewDNA Sequence，彈出如下，彈出如下對話框。對話框。 點擊點擊Search，彈出右邊對話框，可設(shè)置引物搜索條件，彈出右邊對話框，可設(shè)置引物搜索條件，然后點擊然后點擊OK，又彈出一對話框，再點，又彈出一對話框，再點OK。 得到搜索結(jié)果，一般評分越高，左下無得到搜索結(jié)果，一般評分越高，左下無Found，引物對，引物對越好，然后根據(jù)各項參數(shù)決定

9、是否對引物對進行編輯調(diào)整。越好，然后根據(jù)各項參數(shù)決定是否對引物對進行編輯調(diào)整。PCR后電泳檢測后電泳檢測 可用普通可用普通PCR也可用實時熒光定量也可用實時熒光定量PCR（較貴）擴增（較貴）擴增cDNA，然后用，然后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。如要制作標瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。如要制作標準品則將產(chǎn)物條帶割下，然后用純化試劑盒對凝膠進行純準品則將產(chǎn)物條帶割下，然后用純化試劑盒對凝膠進行純化。如不立即做則將凝膠于化。如不立即做則將凝膠于-20保存。保存。實時熒光定量實時熒光定量PCR 按試劑盒說明書操作。采用按試劑盒說明書操作。采用ABI 7300定量定量PCR儀，用八儀，用八聯(lián)管跑定量較方便，

10、使用前注意檢查管壁是否完好。聯(lián)管跑定量較方便，使用前注意檢查管壁是否完好。ABI 7300定量定量PCR儀操作程序儀操作程序 添加引物名稱到右邊方框中，如已有引物中沒有所需引物添加引物名稱到右邊方框中，如已有引物中沒有所需引物名稱則新建一個。名稱則新建一個。選擇選擇ROX 設(shè)置反應(yīng)孔的名稱、類型（標準品、樣品、設(shè)置反應(yīng)孔的名稱、類型（標準品、樣品、NTC）、編號）、編號以及標準品的濃度以及標準品的濃度 。 設(shè)置反應(yīng)程序、反應(yīng)體積，點擊添加溶解曲線，然后設(shè)置反應(yīng)程序、反應(yīng)體積，點擊添加溶解曲線，然后File保存在文件夾中，最后點擊保存在文件夾中，最后點擊Start。 如果要去掉某個步驟則雙擊它，

11、點擊如果要去掉某個步驟則雙擊它，點擊Delete。查看結(jié)果查看結(jié)果 較好的線性圖譜呈較好的線性圖譜呈S形，下面的對數(shù)圖譜曲線斷開是由于形，下面的對數(shù)圖譜曲線斷開是由于基線設(shè)置的基線設(shè)置的3-15，所以從接近，所以從接近15處斷開。處斷開。對數(shù)圖譜對數(shù)圖譜線性圖譜線性圖譜 標準曲線斜率應(yīng)在標準曲線斜率應(yīng)在-3.9-2.9間，盡量接近間，盡量接近-3.32，R20.98，盡量接近盡量接近1。 溶解曲線應(yīng)只有一個單峰。如果出現(xiàn)兩個以上的峰說明有溶解曲線應(yīng)只有一個單峰。如果出現(xiàn)兩個以上的峰說明有非特異性產(chǎn)物或引物二聚體產(chǎn)生，需要調(diào)整反應(yīng)程序或更非特異性產(chǎn)物或引物二聚體產(chǎn)生，需要調(diào)整反應(yīng)程序或更換引物。

12、換引物。 樣品樣品CT值一般控制在值一般控制在1535之間。如果之間。如果CT值太大則說明模板值太大則說明模板濃度太低，需加大模板量；如果濃度太低，需加大模板量；如果CT值太小則可稀釋模板。值太小則可稀釋模板。 原則上每個樣品需要做原則上每個樣品需要做2-3個平行孔，平行孔間個平行孔，平行孔間CT值差值不值差值不能大于能大于1。 定量方法定量方法 分為絕對定量和相對定量。絕對定量測定模板的分為絕對定量和相對定量。絕對定量測定模板的精確拷貝精確拷貝數(shù)數(shù)，通常需要用一系列已知拷貝數(shù)的標準品制作標準曲線，通常需要用一系列已知拷貝數(shù)的標準品制作標準曲線，標準品主要是純化的質(zhì)粒標準品主要是純化的質(zhì)粒DN

13、A，制備復(fù)雜；而相對定量只，制備復(fù)雜；而相對定量只測定模板的測定模板的相對量相對量而不測定其具體拷貝數(shù)，比較不同樣本而不測定其具體拷貝數(shù)，比較不同樣本間的倍數(shù)關(guān)系。間的倍數(shù)關(guān)系。 相對定量測定方法包括兩種：雙標準曲線法和比較相對定量測定方法包括兩種：雙標準曲線法和比較CT法法（2-CT）。其中雙標準曲線法類似于絕對定量，只是所）。其中雙標準曲線法類似于絕對定量，只是所用的標準品可用用的標準品可用cDNA或或PCR產(chǎn)物等，不需要知道其具體產(chǎn)物等，不需要知道其具體拷貝數(shù)，只要知道其稀釋梯度即可?？截悢?shù)，只要知道其稀釋梯度即可。兩種相對定量方法的比較兩種相對定量方法的比較雙標準曲線法雙標準曲線法比較

14、比較C CT T法（法（ 2-CT ）對擴增效率要求不高對擴增效率要求不高要求目標基因和內(nèi)參基因的擴要求目標基因和內(nèi)參基因的擴增效率基本一致且接近增效率基本一致且接近100%100%每次反應(yīng)都要作標準曲線每次反應(yīng)都要作標準曲線不需要做標準曲線不需要做標準曲線結(jié)果較精確結(jié)果較精確結(jié)果有一定誤差結(jié)果有一定誤差注意事項注意事項試驗前詳細了解試驗步驟，試驗材料準備齊全并適當(dāng)處試驗前詳細了解試驗步驟，試驗材料準備齊全并適當(dāng)處理，如理，如DEPC浸泡、高壓、干烤、酒精棉球擦拭等。浸泡、高壓、干烤、酒精棉球擦拭等。試驗過程中一定要試驗過程中一定要戴手套戴手套，最好戴，最好戴2層，并注意更換。層，并注意更換。

15、大部分試劑都是有毒物質(zhì)，如焦炭酸二乙酯大部分試劑都是有毒物質(zhì)，如焦炭酸二乙酯DEPC、溴、溴化乙錠化乙錠EB可能具有致癌作用?？赡芫哂兄掳┳饔?。大部分步驟需要在冰上操作。大部分步驟需要在冰上操作。分裝樣品和引物，避免反復(fù)凍融。分裝樣品和引物，避免反復(fù)凍融。加入試劑之前，把它混勻一下，以免放置時間長了濃度加入試劑之前，把它混勻一下，以免放置時間長了濃度不均。不均。加好各反應(yīng)液后加好各反應(yīng)液后“離心、振蕩、離心離心、振蕩、離心”再分裝到各管或再分裝到各管或上機。上機。定量時八聯(lián)管管蓋和管壁盡量不用手碰，定量時八聯(lián)管管蓋和管壁盡量不用手碰，不能不能用記號筆用記號筆標號，可按順序加樣并在標號，可按順序加樣并在管蓋邊緣標記正反管蓋邊緣標記正反，因為機器，因為機器是透過管蓋測定管底