藥學(xué)生物化學(xué)實驗指導(dǎo)

1、生物化學(xué)實驗一、實驗?zāi)康?培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)的思維方法和學(xué)習(xí)作風(fēng)，獨立工作能力。2學(xué)習(xí)基礎(chǔ)生物化學(xué)實驗方法，為今后的學(xué)習(xí)與研究準(zhǔn)備更好的條件。3培養(yǎng)學(xué)生愛護國家財物、愛護集體、團結(jié)互助的優(yōu)良道德品質(zhì)。4培養(yǎng)學(xué)生的書面及口頭表達能力。二、實驗的總要求1按教研室予先公布的實驗進度表，了解各次實驗的具體內(nèi)容，并認真做好預(yù)習(xí)。弄清各步驟的意義，避免教條或機械式做實驗。未預(yù)習(xí)者不得進實驗室。2進行實驗不僅要求結(jié)果良好，而且要求敏捷高效。一切步驟都按正規(guī)操作方法進行；樣品與試劑勿過量取用；注意力集中，避免差錯。3實驗中觀察要仔細，記錄要詳盡、及時與客觀。無論實驗成功與失敗，都應(yīng)直接記錄在實驗報告本中，不得于實驗

2、后追記。對于失敗的實驗，要分析其原因。4實驗室是集體學(xué)習(xí)與工作的場所，實驗時應(yīng)保持肅靜，不得大聲喧嘩，以免影響他人的工作與思考。5注意保持實驗室內(nèi)的整潔。實驗用器具、試劑等應(yīng)排列整齊有序。實驗時切勿將試劑、標(biāo)本濺灑于實驗臺面、地面及衣物上，如果有濺出應(yīng)及時處理。實驗后應(yīng)清洗用過的儀器及清理自己的實驗場所。實驗所用的器材、設(shè)備不得隨意亂動。實驗室內(nèi)的一切器材物品嚴(yán)禁攜出。6實驗時使用水、電、火、易燃易爆試劑、化學(xué)毒劑及傳染標(biāo)本等應(yīng)注意安全，防止燃燒或爆炸，防止中毒等事故之發(fā)生。7對師長尊敬，對同學(xué)要團結(jié)友愛。三、實驗報告實驗報告的書寫是培養(yǎng)學(xué)生書面表達能力和科學(xué)作風(fēng)的重要手段之一，實驗者應(yīng)該重視

3、。實驗報告的內(nèi)容包括下列各項：實驗名稱、實驗日期、實驗?zāi)康?、實驗原理、實驗步驟，實驗記錄、計算、討論或小結(jié)。實驗記錄應(yīng)包括隨做隨記的原始記錄。書寫實驗報告要字跡工整，語句通順。書寫工整的實驗報告，是尊師的重要表現(xiàn)之一。四、玻璃儀器的洗滌一般玻璃儀器用肥皂或去污粉以毛刷洗滌即足以滿足要求，洗后應(yīng)將肥皂或去污粉仔細沖掉，將水傾去后，器壁不掛水珠，視為合格。鉻酸洗液僅用于毛刷不能洗凈的儀器，切勿濫用普通玻璃儀器之洗滌。使用鉻酸洗液時，儀器應(yīng)干燥；過多的水份將使洗液迅速失效。用過之鉻酸洗液須加以保存以反復(fù)使用，直至為綠色后方可舍棄；其舍棄法與濃硫酸液相同。用洗液浸洗過的玻璃儀器，應(yīng)先用自來水沖洗，然后

4、再用蒸餾水或去離子水清洗，清洗時，宜采用“少量多次”原則以節(jié)約蒸餾水，同時清洗的效率也高。五、舍棄物的處理舍棄物必須依照其性質(zhì)作適當(dāng)?shù)奶幚怼Ｒ悦庠斐蓪嶒灢牧系睦速M，損壞水槽及下水管道，或污染實驗環(huán)境。1所有固體舍棄物（例如用過的濾紙、損壞的軟木塞及橡皮物、玻璃渣、火柴梗等）。必須放入廢物筒或簍中，切勿丟入水槽中。2廢硫酸或洗液，應(yīng)先傾入大量水中，再倒入水槽中，并以大量水沖走。3實驗完成后的沉淀或混合物，若含有可提取或收回的貴重物品者，不可隨意舍棄，應(yīng)放入教師指定的回收器中。分光光度計的使用原理：有色溶液顏色的深淺與其中呈色物質(zhì)的含量成正比關(guān)系。在定量分析中，利用比較有色物質(zhì)溶液的顏色深淺來測定

5、物質(zhì)含量的分析方法稱比色法。被測物質(zhì)中，有的本身就是有色物質(zhì)，但多數(shù)被測物質(zhì)本身無色或顏色很淺，須加入某些化學(xué)試劑使測物質(zhì)與之發(fā)生反應(yīng)生成有色物質(zhì)。物質(zhì)的顏色是由于物質(zhì)吸收某種波長的光線以后，通過或反射出某種顏色的結(jié)果。當(dāng)一定波長的單色光通過該物質(zhì)的溶液時，該物質(zhì)都能有一定程度的吸光作用，單位體積內(nèi)的溶液中該物質(zhì)的質(zhì)點數(shù)越多，對光線吸收越多。利用物質(zhì)對一定波長光線吸收的程度來測定物質(zhì)含量的方法，稱為分光光度法。分光光度法依據(jù)Lambert-Beer定律。設(shè)一束單色光I0射入溶液，由于部分光線被溶液吸收，通過的光線為It，則It/I0之比為透光度，若透光度T（%）。則 T= It/I0×

6、;100% （1）透光度（T）的倒數(shù)（1/T）反映了物質(zhì)對光的吸收程度。在實際應(yīng)用時，取（1/T）的對數(shù)值，做為吸光度用A表示，即： A=Lg（1/T）=-LgT （2） 吸收度（A）又稱消光度（E）或光密度（OD）。 根據(jù)Lambert-Beer定律推導(dǎo)，當(dāng)一束平行單色光通過均勻、無散射現(xiàn)象的溶液時，在單色光強度、溶液溫度等條件不變條件下，溶液對光的吸收度（A）與溶液的濃度（C）及液層厚度（L）的乘積成正比。 即 ： A=KCL （3） 在實際比色時，標(biāo)準(zhǔn)溶液與被測溶液使用相同的比色杯，即液層厚度（L）相同。K為常數(shù)。測定同一種物質(zhì)時，K標(biāo)=K測。所以，將比簡化為僅是溶液對光吸收度（A）與其

7、濃度（C）之間的關(guān)系。即溶液的濃度越大，吸光度越大?？梢酝ㄟ^測定吸光度求知某一溶液的濃度。 設(shè)：測定管的吸光度和濃度分別為A測和C測，標(biāo)準(zhǔn)管吸光度和濃度分別為A標(biāo)和C標(biāo)，根據(jù)（3）式A=KCL得知： A測：A標(biāo)= C測：C標(biāo)則 C測= A測/ A標(biāo)×C標(biāo)上式中C標(biāo)為已知，A測與A標(biāo)可在比色時讀出數(shù)值，把這些數(shù)值代入公式，即可求出測定管濃度。操作方法：1接通電源，打開開關(guān)指示鈕，打開比色箱蓋，預(yù)熱20分鐘。2預(yù)熱后，選擇所需波長、轉(zhuǎn)動靈敏度旋鈕選擇適宜靈敏度。3轉(zhuǎn)動0旋鈕，使檢流針指針對準(zhǔn)T為0，將空白液、標(biāo)準(zhǔn)液、測定液分別倒入4個比色杯中，將比色杯放入比色盒，再將比色盒放入比色箱中，

8、使空白液對準(zhǔn)光路，合上比色箱蓋。4轉(zhuǎn)動100旋鈕，使T為100%（A為0），觀察指針是否穩(wěn)定。5反復(fù)幾次調(diào)節(jié)T=0、T=100%即開蓋調(diào)“0”，閉蓋調(diào)“100”。6輕輕拉動比色槽拉桿，先后將標(biāo)準(zhǔn)液、測定液對準(zhǔn)光路，紀(jì)錄A標(biāo)值和A測值。7比色完畢，恢復(fù)各旋鈕至原來位置，關(guān)閉電源拔下插頭，取出比色杯，合上比色箱蓋，套上布罩。將比色杯洗凈后倒置晾干。8計算 C測= A測/ A標(biāo)×C標(biāo) 根據(jù)公式算出C測數(shù)值?；A(chǔ)性實驗實驗一：總糖的測定-蒽酮比色法實驗?zāi)康恼莆蛰焱壬y糖的原理和方法實驗原理蒽酮比色法是一個快速而簡便的定糖方法。蒽酮可以與游離的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反應(yīng)，

9、反應(yīng)后溶液呈藍綠色，在620nm處有最大吸收。本法多用于測定糖原的含量，也可用于測定葡萄糖的含量。實驗器材及試劑1、馬鈴薯干粉 2、可調(diào)試移液器或移液管 3、可見分光光度計（723型）4、電子分析天平 5、水浴鍋 6、電爐7、蒽酮試劑：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，當(dāng)日配制使用。8、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸餾水中，定容到1000ml備用。操作：1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 取7支干燥潔凈的試管，按表1順序加入試劑，進行測定。以吸光度值為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1 蒽酮比色法定糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制

10、作 單位：ml  管號0123456標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液00.10.20.30.40.60.8蒸餾水1.00.90.80.70.60.40.2 置冰水浴中5min蒽酮試劑4.04.04.04.04.04.04.0 沸水浴中準(zhǔn)確煮沸10min，取出用流水冷卻，室溫放10min,于620nm處比色葡萄糖濃度（mg/ml）       A620nm       2.樣品含量的測定樣品液的制作： 精確稱取馬鈴薯干粉0.1g置于錐形

11、瓶中加入30ml沸水沸水浴30min（不時搖動）取出，3000rpm離心10min（或過濾）反復(fù)洗滌殘渣2次合并濾液冷卻至室溫定容到50ml的錐形瓶中再從中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中樣品液的測定：（1）取4支試管，按照表2加樣（加蒽酮時需要冰水浴5min冷卻）表2 蒽酮比色法定糖樣品的測定 單位：ml     試管號1234樣液01.01.01.0蒸餾水1.0000蒽酮4.04.04.04.0A620nm    （2）加樣冷卻完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷卻放置10min，620nm

12、處比色測量各管OD值。（3）以1號試管作為調(diào)零管，2、3、4號管的OD值取平均后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品液相應(yīng)的含糖量。3結(jié)果計算：                   C×V                    

13、;             w   = ×100%                                 &#

14、160;             m，式中w：糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）C：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出的糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/ml）V：樣品稀釋后的體積（ml）m：樣品的質(zhì)量（ml）實驗注意事項：1.加樣是實驗成功的關(guān)鍵，一定準(zhǔn)確。2.試管做好標(biāo)記。實驗報告：總糖的測定思考題：如何減少其他糖結(jié)構(gòu)類似物的影響？實驗二：血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實驗?zāi)康模?. 掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的方法及實驗原理。2. 了解血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的臨床意義及影響因素。實驗原理：帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電

15、泳。血清蛋白質(zhì)的等電點均低于pH7.4，因此，在pH比其等電點高的緩沖液中它們都電離成負離子，在電場中都會向正極移動。因各種血清蛋白質(zhì)等電點不同，在同一pH下所帶電荷數(shù)量不同，加上分子量的差別等因素，它們在電場中的運動速度就不同。蛋白質(zhì)分子小而帶電荷多的運動較快；分子大而帶電荷少的運動較慢。所以可利用電泳將血清蛋白質(zhì)按其在電場中運動的速度快慢分為白蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白及球蛋白等五條區(qū)帶?？捎梅止夤舛确ǘ繖z測出五種蛋白質(zhì)的含量和百分?jǐn)?shù)，也可將染色后的膜條直接用光密度計測定。實驗器材：【儀器】1試管、試管架、吸量管 2電泳儀：包括直流電源整流器和電泳槽兩個部分，電泳槽內(nèi)裝有兩個電極（

16、用白金絲制成）。3醋酸纖維薄膜（2.5×8）：【試劑】1pH8.6，離子強度0.075的巴比妥緩沖液：巴比妥鈉15.45g，巴比妥2.76g，蒸餾水700800 ml，加熱溶解，冷后補足蒸餾水至1000ml。2氨基黑10B染色液：氨基黑10B 0.5g，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸餾水40ml，混合使溶解。3漂洗液：甲醇45ml，冰醋酸5ml，蒸餾水50ml，混勻，分裝甲乙丙三瓶備用。4新鮮血清50.4mol/L氫氧化鈉溶液6透明液：冰醋酸25ml，無水乙醇75ml，混勻備用。實驗內(nèi)容與方法：1.電泳槽的準(zhǔn)備：將緩沖液加入電泳槽的兩槽內(nèi)，并使兩槽液面在同一水平。兩槽內(nèi)側(cè)邊各貼掛四

17、層濾紙或紗布，浸入緩沖液中構(gòu)成鹽橋。2薄膜的準(zhǔn)備與點樣：取2.5×8cm的膜條（1）薄膜有光澤面向下，放入培養(yǎng)皿中的巴比妥緩沖液中使膜條充分浸透下沉，約浸泡1020分鐘，即膜條無白斑時。（2）將充分浸透的膜條取出，用干凈濾紙吸去多余的緩沖液，于薄膜的無光澤面距一端1.5cm處作為點樣線。（3）用點樣器在盛有血清的表面血中蘸一下，點樣器下端粘上薄層血清，然后將點樣器豎直，使其沾有血清的頂端緊貼在薄膜點樣線上，待血清全部滲入膜內(nèi)后，移開點樣器，注意點樣的兩端不可到邊。2電泳：將點樣后的膜條置于電泳槽的鹽橋上，放置時膜條無光澤面（即點樣面）向下，以防薄膜干燥，點樣端置于負極，槽架上以四層濾

18、紙作橋墊，膜條與濾紙需貼緊。蓋好電泳槽的蓋，待平衡5分鐘后，即可通電。調(diào)節(jié)電泳儀，使兩極間距（指膜條與濾紙橋總長度）的電壓為810V/cm長，或電流0.40.6mA/cm寬，通電50分鐘左右關(guān)閉電源。3染色與漂洗：通電完畢后，用鑷子將薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染3分鐘取出，立即浸于漂洗液中，分別在漂洗液甲、乙、丙三瓶中各漂洗5'，直至背景漂凈為止。用濾紙吸干薄膜，即得五條蛋白區(qū)帶，從陽極至陰極端依次為白蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白及球蛋白，。實驗注意事項：1 點樣是實驗成功的關(guān)鍵，點樣不可太多或太少。2 電泳和漂洗時不要拿錯膜條。實驗報告：血清蛋白醋酸纖維薄膜電

19、泳思考題：血清蛋白質(zhì)在pH8.6的巴比妥緩沖液中帶什么電荷?它們泳動的先后順序如何?為什么？實驗五 血清總蛋白測定（雙縮脲法）實驗?zāi)康模?. 熟悉血清總蛋白測定的原理及基本操作。2. 掌握血清總蛋白測定的臨床意義。實驗原理：蛋白質(zhì)分子中的肽鍵（-CONH-）在堿性條件下能與Cu2+ 作用形成紫紅色絡(luò)合物。此呈色反應(yīng)與雙縮脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在堿性溶液中與Cu2+ 作用產(chǎn)生紫紅色的反應(yīng)相似，故稱為雙縮脲反應(yīng)。反應(yīng)中溶液顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，可用分光光度法定量檢測蛋白質(zhì)的含量。凡具有兩個以上肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物均有此反應(yīng)，因此雙縮脲反應(yīng)廣泛用于肽及蛋白質(zhì)定性、定量檢測。實驗

20、器材：【器材】恒溫水浴箱、分光光度計、刻度吸管、試管、試管架。【試劑】16molL （24%）NaOH溶液稱取NaOH（優(yōu)級純）240g，溶解于新鮮蒸餾水中并加至1000ml。置聚乙烯瓶內(nèi)蓋緊室溫保存。2. 雙縮脲試劑  精確稱取結(jié)晶硫酸銅(CuSO4·5H20)3.0g，酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6·4H2O)9.0g，碘化鉀(KI)5.0g，分別溶解于是25m1蒸餾水中。將酒石酸鉀鈉和碘化鉀溶液倒入1000ml容量瓶中，加入6molL氫氧化鈉溶液100ml，混勻，再加硫酸銅溶液，邊加邊搖，最后加蒸餾水稀釋至1000ml。置聚乙烯瓶內(nèi)蓋緊，室溫保存。310g/

21、L酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)液  酪蛋白要預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，再根據(jù)其純度稱量，用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配置，冰凍保存。4.人血清用蒸餾水稀釋10倍，使其蛋白質(zhì)濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線測試范圍內(nèi)。實驗內(nèi)容與方法：取3支試管，按表操作：加入物（ml）測定管 標(biāo)準(zhǔn)管 空白管血清稀釋液酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)液雙縮脲試劑 0.1 0.1 5.0 5.0 5.0充分混勻，置37水浴中10分鐘（或2530分鐘），在540nm波長處進行比色，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度?！居嬎恪俊九R床意義】1.血清總蛋白降低（1）合成障礙：肝功能嚴(yán)重受損時，蛋白質(zhì)合成減少，其中以清蛋白下降最為明顯。（2）丟失過多：見于嚴(yán)重?zé)齻?/p>

22、時大量血漿滲出，大失血，腎病綜合征時大量蛋白尿，潰瘍性結(jié)腸炎時腸道長期丟失一定量的蛋白質(zhì)等。（3）營養(yǎng)不良或消耗增加:長期低蛋白飲食、慢性胃腸道疾病所引起的消化道吸收不良，使體內(nèi)缺乏合成蛋白質(zhì)的原料，或長期患消耗性疾病，如結(jié)核病、惡性腫瘤、甲狀腺功能亢進等均可引起血清蛋白濃度降低。（4）血液稀釋：靜脈注射過多低滲溶液或各種原因引起的水鈉潴留。2.血清總蛋白增高（1）血液濃縮：急性失水（嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、高熱等），休克（毛細血管的通透性增加），慢性腎上腺皮質(zhì)功能減退, 急性失水尿鈉增多引起繼發(fā)性脫水。（2）合成增加:主要是球蛋白合成增加，如多發(fā)性骨髓瘤?！菊⒖挤秶?6080g/L實驗注意事項

23、：1由于各種蛋白質(zhì)的分子量不同，故其濃度不宜用mol/L表示，而用g/L表示。2.試管、吸管應(yīng)清潔，否則會有混濁現(xiàn)象出現(xiàn)。3.高脂、黃疸和溶血標(biāo)本應(yīng)作血清空白對照，以保證結(jié)果準(zhǔn)確。含脂類極多的血清，加入雙縮脲試劑后會出現(xiàn)混濁，可用乙醚3ml抽提后再進行比色。4.須于顯色30分鐘內(nèi)比色，否則可有霧狀沉淀產(chǎn)生，同時注意各管從顯色到比色的時間應(yīng)盡可能一致。5.避免硫酸銅過量，否則生成氫氧化銅，其藍色將掩蓋紫紅色，影響測定結(jié)果。實驗報告： 血清總蛋白測定（雙縮脲法）思考題：蛋白質(zhì)常見的呈色反應(yīng)有哪些？本實驗結(jié)果如何，請分析。實驗六 pH 與溫度對酶促反應(yīng)的影響實驗?zāi)康模?. 通過實驗觀察pH對酶促反應(yīng)

24、的影響。2. 提高分析問題和動手能力。實驗原理：淀粉在淀粉酶催化下水解，其最終產(chǎn)物是麥芽糖和葡萄糖。在水解反應(yīng)過程中淀粉的分子量逐漸變小，形成若干分子量不等的過渡性產(chǎn)物，稱為糊精。向反應(yīng)系統(tǒng)中加入碘液可檢查淀粉的水解程度，淀粉遇碘呈藍色，麥芽糖對碘不顯色。糊精中分子量較大者呈藍紫色，隨糊精的繼續(xù)水解，對碘呈橙紅色。根據(jù)顏色反應(yīng)，可以了解淀粉被水解的程度。在不同溫度、不同酸堿度下，唾液淀粉酶活性不同，淀粉水解程度也不一樣。進而了解溫度及pH對酶促反應(yīng)的影響。實驗器材：【器材】：10mm×100mm試管、試管架、恒溫水浴箱、沸水浴、記號筆、一次性杯子【試劑】：110gL淀粉溶液：配制方法

25、：取可溶性淀粉1克，加5毫升蒸餾水，調(diào)成糊狀，再加蒸餾水約80毫升，加熱，使其溶解，最后用蒸餾水稀釋至100毫升，冰箱保存。2稀釋唾液：將痰咳盡，用水漱口(洗滌口腔)，再含蒸餾水30毫升，作咀嚼動作，2分鐘后吐入燒杯中待用。3緩沖溶液：PH6.8磷酸鹽緩沖液：取磷酸氫二鈉477mg，磷酸二氫鈉397 mg，蒸餾水溶解至100ml。P3.0緩沖液：取0.2mol/L磷酸二氫鉀（KH2PO4 2.722克加蒸餾水溶解至100ml）50 ml ，加0.2 mol/L鹽酸溶液20.3 ml,混合后即成。 P9.0緩沖液：取0.2mol/L Na2HPO4溶液（磷酸氫二鈉2.840克加蒸餾水溶解至100

26、ml ）60ml,0.2 mol/L氫氧化鈉溶液20 ml,混合后即成。4碘溶液 取碘化鉀4g溶于少量蒸餾水中，再取碘2g，完全溶解后加蒸餾水至300ml，貯于棕色瓶中。實驗內(nèi)容與方法：一、PH對酶促反應(yīng)的影響 取三支試管按下表操作：表 PH對酶促反應(yīng)的影響 加入物1 2 310gL淀粉溶液P3.0緩沖液 PH6.8緩沖液PH9.0緩沖液10滴 10滴 10滴10滴 10滴 10滴搖勻后37恒溫水浴中保溫5分鐘稀唾液5滴 5滴 5滴將上面各管搖勻后放入37恒溫水浴中保溫。放置10分鐘后取出，分別向各管加入稀碘液1滴，觀察3管中顏色的區(qū)別，說明PH對酶促反應(yīng)的影響。二、溫度對酶促反應(yīng)的影響：取三

27、支試管按下表操作：表 溫度對酶促反應(yīng)的影響加入物1 2 310gL 淀粉溶液10滴 10滴 10滴 PH6.8緩沖液10滴 10滴 10滴 搖勻后分別于37、沸水、冰浴5分鐘稀唾液5滴 5滴 5滴搖勻后分別于37、沸水、冰浴10分鐘取出后，分別向各管加入稀碘液1滴，觀察3管中顏色的區(qū)別，說明溫度對酶促反應(yīng)的影響。實驗注意事項：稀釋唾液的制備是實驗成功與否的關(guān)鍵。制備稀釋唾液時,口含的時間不能太長或太短，約12分鐘。實驗報告：pH 、T對酶促反應(yīng)的影響思考題：利用所學(xué)知識，說明T與pH對酶促反應(yīng)的影響機制，分析結(jié)果。實驗七 激活劑與抑制劑對酶促反應(yīng)的影響實驗?zāi)康模?. 通過實驗觀察激活劑與抑制劑

28、對酶促反應(yīng)的影響。2. 提高分析問題和動手能力。實驗原理：在激活劑或抑制劑存在時，唾液淀粉酶活性不同，淀粉水解程度也不一樣，通過與碘反應(yīng)的顏色可判斷淀粉被水解的程度，進而了解激活劑與抑制劑對酶促反應(yīng)的影響。實驗器材：【器材】：10mm×100mm試管、試管架、恒溫水浴箱、沸水浴箱、記號筆、一次性杯子【試劑】 110gL淀粉溶液： 2稀釋唾液：（同實驗六） 3P6.8緩沖液 4碘液 取碘2g，碘化鉀4g，溶于300ml蒸餾水中，貯于棕色瓶中。 5170mol/L氯化鈉溶液：取氯化鈉1克溶于蒸餾水至100ml。663mol/L硫酸銅溶液：取硫酸銅1克溶于蒸餾水至100ml。實驗內(nèi)容與方法

29、：1稀唾液和煮沸稀釋唾液的制備：2取三支試管編號，按下表操作： 表 激活劑與抑制劑對酶促反應(yīng)的影響加 入 物1 2 310gL淀粉溶液PH6.8緩沖液Nacl溶液CuSO4溶液蒸餾水（DH2O）10滴 10滴 10滴 10滴 10滴 10滴 10滴 10滴 10滴 分別于37水浴10分鐘稀唾液5滴 5滴 5滴3分別于37水浴中放置10分鐘后取出，向各管加入稀碘液1滴，觀察3管中顏色的區(qū)別，說明激活劑與抑制劑對酶促反應(yīng)的影響。實驗注意事項：稀釋唾液的制備是實驗成功與否的關(guān)鍵,口含的時間不能太長或太短，約12分鐘。實驗報告：激活劑與抑制劑對酶促反應(yīng)的影響思考題：實驗結(jié)果如何，分析結(jié)果。實驗八 酶的

30、特異性實驗?zāi)康模?. 通過實驗說明酶具有特異性。2. 提高分析問題和動手能力。實驗原理：淀粉在淀粉酶催化下水解，產(chǎn)物是麥芽糖和G。麥芽糖和G具有還原性,可使班氏試劑中二價銅離子還原為一價銅離子，生成磚紅色氧化亞銅沉淀。而淀粉酶不能催化蔗糖水解生成G和F，蔗糖也不具有還原性，故不能使班氏試劑中二價銅離子還原，不能產(chǎn)生顏色變化。實驗器材：【器材】：10mm×100mm試管、試管架、恒溫水浴箱、沸水浴、記號筆、一次性杯子【試劑】：1 10gL淀粉溶液：（同實驗四）210gL蔗糖溶液3稀釋唾液：（同實驗四）4PH6.8磷酸鹽緩沖液：（同實驗四）5班氏試劑：結(jié)晶硫酸銅（CuSO4 。H2O）1

31、7.3g溶于熱蒸餾水100ml中，冷后稀釋至150ml，此為第一液。檸檬酸鈉173g及無水碳酸鈉100g，蒸餾水600ml，加熱溶解，冷后稀釋至800ml，此為第二液。將第一液慢慢倒入第二液中，混勻后即為班氏試劑。實驗內(nèi)容與方法：取三支試管編號，按下表操作：表 酶的特異性加入物（滴）123PH6.8磷酸鹽緩沖液10gL淀粉溶液10gL 蔗糖溶液稀釋唾液煮沸稀釋唾液55-3-55-35-53-混勻，37水浴10分鐘 班氏試劑101010沸水浴10分鐘結(jié)果（顏色） 觀察3管中顏色的區(qū)別，說明酶的特異性 實驗注意事項：稀釋唾液的制備。實驗報告：酶的特異性思考題：實驗結(jié)果如何，分析結(jié)果。實驗十二 ：

32、血清ALT定量測定實驗?zāi)康模?. 掌握血清ALT定量測定實驗的原理及臨床意義。2. 提高分析問題和動手能力。實驗原理：血清ALT以肝細胞中含量最多，因此當(dāng)肝細胞有病變時，細胞中的酶釋放入血液，血清中ALT活性增高。丙氨酸 + -酮戊二酸 丙酮酸 + 谷氨酸 丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼 丙酮酸-2，4-二硝基苯腙丙酮酸-2，4-二硝基苯腙在堿性溶液中顯棕紅色，在520nm處比色測定，根據(jù)丙酮酸生成量的多少可求得ALT的活性單位。實驗器材：器材 10mm×100mm試管、試管架、蠟筆、恒溫水浴箱、分光光度計試劑 1 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(P7.4)：準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉（AR）

33、11.928g和磷酸二氫鈉（AR）2.176g，用蒸餾水溶解至100ml。2丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（2mmol/L）：準(zhǔn)確稱取丙酮酸22.0ml于100ml容量瓶中，加PH7.4磷酸鹽緩沖液至刻度，分裝好，高壓滅菌，冷后置冰箱保存。32，4-二硝基苯肼溶液：稱取2，4-二硝基苯肼19.8mg, 用10mol/LHCL10ml溶解，加蒸餾水至100ml，置棕色瓶內(nèi)，冰箱保存。4ALT基質(zhì)液: 稱取DL丙氨酸1.79g, -酮戊二酸29.2mg于燒杯中,加P7.4磷酸鹽緩沖液80ml, 煮沸溶解,冷后用1mol/L氫氧化鈉液調(diào)P至7.4,(約加0.5ml),移入100 ml容量瓶中，再用P7.4磷酸鹽緩沖

34、液稀釋至100 ml刻度,混勻,加氯仿數(shù)滴或10g/L麝香草酚酒精溶液1ml,防腐, 冰箱保存。5 0.4mol/L氫氧化鈉液實驗內(nèi)容與方法： 取三支試管編號，按下表操作：加入物(ml)標(biāo)準(zhǔn)管 測定管 空白管血清丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 ALT基質(zhì)液 - 01 01 - 01 - 05 05 -37水浴30分鐘2，4-二硝基苯肼溶液ALT基質(zhì)液05 - 05- 05 05 37水浴20分鐘0.4mol/L氫氧化鈉液50 5.0 5.0 吸光度（A）混勻后靜置10分鐘，用520nm波長比色，空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。計算： ALT單位=測定管吸光度÷標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×20×1/

35、2.5×1/0.1實驗注意事項：1 血清及標(biāo)準(zhǔn)液的加量要準(zhǔn)確。2溫度的控制也很重要。實驗報告：血清ALT定量測定思考題：1實驗結(jié)果如何，分析結(jié)果。2說出血清ALT定量測定的方法及臨床意義。實驗十三 ：血紅蛋白與核黃素的凝膠柱色譜分離實驗?zāi)康模?. 通過實驗了解血紅蛋白與核黃素的凝膠柱色譜分離的原理及應(yīng)用。2. 提高分析問題和動手能力。初步掌握凝膠層析技術(shù)3、了解包括離子交換柱層析、親和層析及吸附層析等分離純化的方法。實驗原理： 凝膠層析又稱凝膠排阻層析、凝膠過濾、分子篩層析和凝膠滲透層析，是一種按分子大小分離物質(zhì)的層析方法，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的分離和純化。該方法

36、是把樣品加到充滿著凝膠顆粒的層析柱中，然后用緩沖液洗脫。大分子無法進入凝膠顆粒中的靜止相中，只能存在于凝膠顆粒之間的流動相中，因而以較快的速度首先流出層析柱，而小分子則能自由出入凝膠顆粒中，并很快在流動相和靜止相之間形成動態(tài)平衡，因此就要花費較長的時間流經(jīng)柱床，從而使不同大小的分子得以分離。凝膠層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。本實驗通過凝膠過濾，用核黃素（黃色，分子量267）和血紅蛋白（紅色，分子量67000）混合物作為樣品。核黃素因分子量小，能自由出入凝膠顆粒中，因此就要花費較長的時間流經(jīng)柱床，在層析柱中呈現(xiàn)其本來的黃色帶而遠遠地落在血紅蛋白的后邊。實驗器

37、材：器材醫(yī)用鑷子、5ml帶刻度滴管、250ml試劑瓶、50ml燒杯；層析柱：10mm×20cm 10支；試劑10.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.2）：量取0.1mol/L磷酸二氫鈉280ml與0.1mol/L磷酸氫二鈉720ml，混勻。2核黃素飽和水溶液3生理鹽水4 甲苯5 葡聚糖凝膠：Sephadex G-25或G-506. 血紅蛋白樣品的制備：取2ml抗凝血于離心管中，2000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘，使血細胞沉淀，棄去血漿和白細胞層。向紅細胞沉淀加入生理鹽水4ml，振搖洗滌，2000轉(zhuǎn)/ min離心10分鐘,棄去上清液，共洗滌3次。向沉淀加入蒸餾水2ml，混勻，再加入甲苯1ml

38、，猛烈振搖促使紅細胞溶血釋放血紅蛋白。2000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘,取上清血紅蛋白溶液備用。實驗內(nèi)容與方法：1 葡聚糖凝膠的預(yù)處理：取Sephadex G-25 5克或Sephadex G-50 3克,浸泡于50ml蒸餾水中充分溶脹（室溫，12h），然后反復(fù)傾斜除去表面的懸浮微粒，再加入pH7.2磷酸緩沖液沸水浴中2-3h去除顆粒內(nèi)部空氣，最后加入pH7.2磷酸緩沖液浸泡過夜備用。2. 裝柱(1) 將層析柱垂直固定在鐵架臺上，將層析柱出口接上乳膠管，注意上下不要顛倒；(2) 將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約1-2cm高的緩沖液，把溶脹好的糊狀凝膠邊攪拌邊緩慢倒入柱中，最好一次連續(xù)裝完

39、，直至凝膠床高達18cm，要求凝膠床無氣泡，無斷層，表面平整。3平衡：以恒流泵控制流速為1滴/5秒，用磷酸緩沖液洗脫平衡10min。注意在任何時候不要使液面低于凝膠表面，否則凝膠床可能干裂，影響液體在柱內(nèi)的流動與分離效果。4. 制樣：將核黃素飽和水溶液和血紅蛋白溶液按1：1（體積比）混勻。6 上樣：將柱中多余的液體從底部流出后關(guān)閉止水螺絲,取制備好的血紅蛋白樣品0.5ml，沿層析柱小心加到凝膠柱上，打開止水螺絲，使樣品溶液流入柱內(nèi)。7 洗脫：用緩沖液進行洗脫，控制緩沖液在約1滴/5秒的流速，每3ml一管，721分光光度計比色，在540波長下，以PB調(diào)零，測定血紅蛋白各管吸光度；在450波長下，

40、以PB調(diào)零，測定核黃素各管吸光度，以管號為橫坐標(biāo)，光密度為縱座標(biāo)繪制圖。8 清洗：待所有色帶流出層析柱后，加快流速，繼續(xù)清洗層析柱2min。注意事項：1、調(diào)整好緩沖液的流速后，立即收集洗脫樣品。2、葡聚糖凝膠的預(yù)處理由老師提前配好。實驗報告：血紅蛋白與核黃素的凝膠柱色譜分離思考題：1、請解釋為什么在洗脫樣品時，流速不能太快或者太慢？2、向凝膠柱加樣品時，為何須保持膠面平整？上樣體積為什么不能太大？實驗十七：饑餓與飽食對肝糖元含量的影響一目的 了解飽食與饑餓對肝糖原的影響，學(xué)習(xí)組織中糖原的提取和測定方法。 二原理 把動物分成饑餓與飽食兩組，用三氯醋酸提取其肝糖原，后者與碘試劑產(chǎn)生顏色反應(yīng)。與標(biāo)準(zhǔn)

41、液同時比色即可定量。 三材料 （一）儀器 721分光光度計；研缽；試管；漏斗。 （二）試劑 1碘試劑 （1）稱取1克碘和2克碘化鉀，溶于20ml蒸餾水中。（2）19.6%氯化鈉溶液 取196克氯化鈉用蒸餾水溶解并定容至1000ml。將16.5ml的（1）液加到990ml的（2）液中，混勻后貯存于棕色瓶中。 25%三氯醋酸溶液 稱50克三氯醋酸，用蒸餾水溶解并定容至1000ml。配制后需用標(biāo)準(zhǔn)的0.1mol/L氫氧化鈉溶液滴定（酚酞指示劑）。三氯醋酸的濃度必須在4.9-5.1范圍內(nèi)才能用，否則會影響顯色結(jié)果。 3肝糖原標(biāo)準(zhǔn)液（30mg%） 精確稱取100%純度的肝糖原30mg，溶于5%三氯醋酸溶

42、液至100ml，貯于冰箱中。 四方法 1動物準(zhǔn)備 選擇體重相近的健康小白鼠二只，一只照常喂食，另一只饑餓6小時。 2糖原提取 將上述二只小白鼠以斷頭術(shù)殺死，立即取出肝臟，盡快精確稱取各0.2克，分別放入研缽內(nèi)，先加5%三氯醋酸溶液1ml，仔細勻漿，然后再加入5%三氯醋酸溶液9ml，攪勻后靜置15分鐘，過濾取得肝濾液。 3糖原的測定 取6支試管，編號，按表7-1操作?；靹蚝?，以1號管調(diào)零，在520nm波長下測吸光度。 表7-1肝糖原的測定 試管（ml） 1 2 3 4 5 6 5%三氯醋酸 2 1 1.5 1.5 1 1 肝糖原標(biāo)準(zhǔn)液 1 飽鼠肝濾液 0.5 0.5 饑鼠肝濾液 1 1 碘試劑

43、3 3 3 3 3 3 4計算 以3、4兩管吸光度平均值為A，5、6兩管吸光度平均值為B，標(biāo)準(zhǔn)管吸光度為C. 飽食小白鼠肝糖原克%A/C×0.3×1/1000×（10+肝重量）/0.5×100/肝重量 餓小白鼠肝糖原克%B/C×0.3×1/1000×(10肝重量)/1×100/肝重量 思考題 肝糖原的合成與分解是如何進行的？實驗十八 肝組織中核酸的提取和鑒定實驗?zāi)康尿炞C核酸的三大組成成分。熟悉組織中核酸的提取與鑒定的基本操作方法。實驗原理 動物組織細胞中的核糖核酸（RNA）與脫氧核糖核酸（DNA）大部分與蛋白質(zhì)結(jié)合

44、而形成核蛋白。被三氯醋酸沉淀的核蛋白，先用95%的乙醇加熱去除附著在沉淀上的脂類雜質(zhì)，再用1.7mol/L NaCl溶液提取出核酸的鈉鹽，然后加入乙醇即可使核酸鈉鹽沉淀析出。RNA與DNA均可被硫酸水解產(chǎn)生磷酸、含氮堿基(嘌呤與嘧啶)及戊糖（RNA為核糖，DNA為脫氧核糖）。此三類物質(zhì)分別可按照下述原理鑒定。1.磷酸 磷酸與鉬酸銨試劑作用生成黃色磷鉬酸，磷鉬酸中的鉬在有還原劑（硫酸亞鐵）存在時可被還原成藍色的鉬藍。根據(jù)此呈色反應(yīng)即可鑒定磷酸的存在。2.嘌呤堿 根據(jù)嘌呤堿能與硝酸銀產(chǎn)生灰褐色的絮狀嘌呤銀化合物而鑒定。3.戊糖 根據(jù)核糖經(jīng)濃鹽酸或濃硫酸作用生成糠醛，后者能與3，5二羥甲苯縮合而形成綠色化合物而鑒定。脫氧核糖在濃酸中生成-羥基-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成藍色化合物。實驗器材：器材剪刀、鑷子、玻棒、濾紙、試管、試管架、蒸發(fā)皿、勻漿器、離心機、沸水浴箱。試劑1.