實(shí)驗(yàn)四--大黃中蒽醌類成分的提取分離和鑒定

1、實(shí)驗(yàn)四大黃中游離慈釀?lì)惓煞值奶崛　⒎蛛x與鑒定一、概述植物來源：大黃系蓼科植物掌葉大黃(Rheum palmatum L .)、唐古特大黃 (Rheumtanguticum Maxim. ex Balf .)或藥用大黃(Rheum offcinale Baill .)的干燥根及根莖。 大黃記載于神農(nóng)本草經(jīng)等許多文獻(xiàn)中，具有瀉下、健胃、清熱解毒等功效。自古以來， 大黃在植物性瀉下藥中占有重要位置，是一味很早就被各國藥典收載的世界性藥材。功效：大黃具有多方面的生物活性，其抗菌、抗感染及抗腫瘤活性有效成分主要為意 醍類衍生物，如：大黃酸、大黃素和蘆薈大黃素；止血的主要有效成分為大黃酚；瀉下的有 效成分

2、是結(jié)合型的慈昔類。蔥醍類衍生物占大黃總化學(xué)成分的3%5%,該類成分少部分以游離狀態(tài)存在，大部分與葡萄糖結(jié)合成昔的形式存在。此外，大黃還含有糅質(zhì)等多元酚類化合物，含量在10% 30%之間，具止瀉作用，與慈昔的瀉下作用恰恰相反。主要化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)及物理性質(zhì)大黃中含有多種游離的羥基慈醍及其與糖所形成的昔類化合物，已知的游離羥基慈醍主要有以下5種化合物。大黃酸OTOHH大黃素OHch3蘆薈大黃素CH20HH大黃素甲醛OCHaCHj大黃酣CH3H大黃酸(rhein) , Ci5H806,黃色針晶，m.p321 322 C (330 C分解),UV入 max431 , 258, 231 , 204。可溶于

3、堿水，微溶于乙醇、苯、三氯甲烷、乙醛和石油醒，不溶于水。大黃素(emodin) , C5H。05,橙黃色針晶(乙醇)，m.p256 257C。UV入 max436, 289, 266, 253, 222。可溶于堿水，微溶于乙醛、三氯甲烷，不溶于水。蘆薈大黃素(aloe emodin),橙色針晶(甲苯)，m.p223224 C。UV入 ma429, 287, 254, 225, 202。可溶于乙醛、苯及堿水，不溶于水。大黃素甲醛(physcion),磚紅色單斜針狀結(jié)晶(苯),m.p205207C。溶于苯、三氯甲 烷及甲苯，不溶于甲醇、乙醇、乙醛和丙酮，不溶于水。大黃酚(chrysophano1)

4、 , -04,橙黃色針晶(乙醇或苯),m.p195 196C。UV入 ma>429, 287, 256, 225, 202?？扇苡诒⑷燃淄?、苯、乙醛和冰醋酸和堿水，微溶于石油醛， 不溶于水。大黃酸葡萄糖昔(rhein 8-monoglucoside) ,黃色針晶。m.p266267C。大黃素葡萄糖昔(emodin monoglucoside),橙色針晶(甲苯)。m.p190 191C。蘆薈大黃素葡萄糖昔 (aloeemodin monoglucoside) ,黃色針晶。m.p235C。大黃酚葡萄糖昔(chrysophanol monoglucoside) ,橙色針晶(甲苯)。m.p

5、239C。二、實(shí)驗(yàn)部分（一 ） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?掌握蒽醌苷元的提取方法雙相酸水解法。2.掌握梯度PH萃取法提取分離大黃中各種蔥醍昔元的原理及操作方法。3掌握羥基蒽醌類化合物的顏色反應(yīng)及薄層色譜鑒別方法。（二 ） 實(shí)驗(yàn)的基本原理1 提取原理雙相酸水解法，為一相為與酸水不相互溶的有機(jī)溶劑，另一相為酸水，加熱回流水解的方法。 由于大黃中的羥基蒽醌類化合物多以苷的形式存在，所以首先要將苷水解成苷元，本實(shí)驗(yàn)選用硫酸和乙酸乙酯作為雙相酸水解的溶劑，采用加熱回流方法，提取大黃藥材中的游離蒽醌類化合物。根據(jù)苷元不溶于水，可溶于乙醚、乙酸乙酯等親脂性有機(jī)溶劑的性質(zhì)，即在加熱回流提取過程中，稀硫酸可將蒽醌苷水解成苷

6、元，游離出來的蒽醌苷元隨即溶于乙酸乙酯中，從而將蒽醌苷元提取出來。2 分離原理pH 梯度萃取法羥基蒽醌類化合物酸性強(qiáng)弱不同，用pH 梯度法進(jìn)行分離。具有羧基或多個(gè)3位酚羥基的蔥醍可溶于5%碳酸氫鈉溶液；具有一個(gè)3位酚羥基的蔥醍可溶于5%碳酸鈉溶液，只具有“位酚羥基的蔥醍，酸性弱，只溶于氫氧化鈉溶液。以分離酸度不同的蒽醌苷元。也可利用游離蒽醌的極性不同，采用硅膠柱色譜法進(jìn)行分離（1）大黃中游離蔥醍的酸性強(qiáng)弱順序大黃酸（一COOH）大黃素（3酚一OH）消薈大黃素（醇一OH）汰黃素甲醛（一OCH）大黃酚（一CH）。（2） 大黃中游離蒽醌的極性大小順序大黃酸大黃素蘆薈大黃素大黃素甲醚大黃酚。大黃酚和大

7、黃素甲醚酸性相近，但極性不同，可用硅膠柱色譜法進(jìn)行分離。（三 ）實(shí)驗(yàn)方法1總蒽醌苷元的提取、分離工藝流程大黃藥材（粗粉）5的如 劉HzSO/OOnl.三氯甲烷250向,水浴回流4h,梢冷后過渡三氯甲烷提取液陵水層先用蒸海水洗2次（每次20ml），再用pHfi緩沖溶液200ml.振摘革取一次三氯甲烷層HCI調(diào)pHZ，冰箭酸精制pH 10緩沖溶藻300ml,振播整取二次沉淀物（黃色結(jié)匾） （大黃酸）眼水尾三氯甲烷層HC】闊pH工閃酮精犒沉淀物1班縊晶）大黃索）pH 13(,%N打CO5%NmCH)緩沖溶液200wL振據(jù)萃取二次三氟甲烷層用80ml三氯甲烷網(wǎng)洗1次3d oNaOH 50Gml萃取一收

8、沉淀物（橙黃色結(jié)晶）蘆薈大黃霜）睡水層三甄甲烷HCI調(diào)pH3.過濾沉淀物硅膠柱色譜大黃齡"1大黃素甲m操作注意事項(xiàng)所得乙酸乙酯液中若帶有酸水液,應(yīng)用分液漏斗分出棄去；此處用蒸儲(chǔ)水洗除乙酸乙酯液中的酸。萃取時(shí)容易發(fā)生乳化， 而且隨著堿液堿度的增高，乳化現(xiàn)象會(huì)越嚴(yán)重， 所以要輕輕振 搖。每次加堿液進(jìn)行 pH梯度萃取時(shí)，注意要測(cè)一下乙酸乙酯液的pH。萃取時(shí)一定要注意乳化層的分出，不要混入。2總蒽醌苷元的提取大黃粗粉50g， 置 500ml 燒瓶中，加 20硫酸溶液100ml 和乙酸乙酯250ml， 水浴回流提取 2 個(gè) h (加磁子攪拌)，放置，冷后過濾，殘?jiān)鼦壢ィ宜嵋阴ヌ崛∫褐梅忠郝┒?/p>

9、中，分出酸水層，乙酸乙酯提取液用蒸儲(chǔ)水洗2次(每次20ml),將乙酸乙酯液放置在錐形瓶中，密封。3.游離蒽醌的分離與精制(1)大黃酸的分離和精制將乙酸乙酯提取液置 500m1分液漏斗中，用 5%NaHCO3溶液萃取三次(80ml, 60ml, 40ml),合并堿液，在攪拌下滴加濃鹽酸，調(diào)節(jié) ph =2,放置，待沉淀析出完全后，過濾， 并用少量水洗沉淀物至洗出液呈中性，60干燥，得深褐色粉末，主為大黃酸。沉淀干燥后，樣品加冰醋酸10ml 加熱溶解，趁熱過濾，濾液放置析晶，過濾，用少量冰醋酸淋洗結(jié)晶，得黃色針晶為大黃酸。(2) 大黃素的分離和精制經(jīng)NaHCO3溶液提取過的乙酸乙酯液，繼用5%Na2

10、CO3溶液萃取三次，每次用量40ml, 合并堿液，在攪拌下滴加濃鹽酸，調(diào)節(jié)ph=2,析出棕黃色沉淀，抽濾，水洗沉淀物至洗出液呈中性，60干燥，沉淀經(jīng)干燥后，用 15ml 丙酮熱溶，趁熱過濾，濾液靜置，析出橙色針晶，過濾后，用少量丙酮淋洗結(jié)晶，得大黃素。(3) 蘆薈大黃素，大黃素甲醚和大黃酚混合物的分離經(jīng)Na2CO3提取過的乙酸乙酯液，再用 5%NaOH溶液提取三次，每次用量 40ml,合并 后的堿液同(1 )法處理，所得產(chǎn)品為黃色粉末，為蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素6甲醚的混合物。3. 游離蒽醌類化合物的鑒定(1) 化學(xué)鑒定堿液試驗(yàn)分別取各蒽醌結(jié)晶少許置于小試管中，加lml 乙醇溶解，加10氫氧

11、化鈉溶液數(shù)滴，觀察顏色變化。羥基蒽醌類應(yīng)呈紅色。醋酸鎂試驗(yàn)分別取各蒽醌結(jié)晶少許置于小試管中，各加乙醇lml 使溶解，滴加0 5醋酸鎂乙醇溶液，觀察顏色變化，羥基蒽醌應(yīng)顯橙色到藍(lán)紫色。(2) 色譜鑒定 薄層色譜鑒定吸附劑：硅膠 G- CMC-Na板。樣 品：上述分別獲得的大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚和大黃酚的三 氯甲烷溶液及各相應(yīng)對(duì)照品的三氯甲烷溶液。展開劑：石油醚乙酸乙酯醋酸 (2 ： 1 ： 0.2) 。 展開方式：上行展開。顯 色：在可見光下觀察，記錄黃色斑點(diǎn)出現(xiàn)的位置，然后用濃氨水熏或噴5醋酸鎂甲醇溶液，斑點(diǎn)顯紅色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄：觀察斑點(diǎn)顏色，記錄圖譜并計(jì)算Rf 值。四、注意事

12、項(xiàng)大黃中蒽醌類化合物的種類、含量與大黃的品種、采集季節(jié)、炮制方法及貯存時(shí)間均有關(guān)系。由于蒽醌類衍生物主要以苷的形式存在，所以較新鮮的原藥材蒽醌類成分含量高，如果是貯存時(shí)間長的飲片，則蒽醌類成分含量低，實(shí)驗(yàn)選材要注意。用堿液萃取時(shí)要注意濃度和用量，酸化時(shí)，加酸要慢，多攪拌。分液漏斗的正確使用。五、思考題1簡述液液萃取法的原理、溶劑選擇原則和操作技術(shù)。2什么叫雙相酸水解?掌握其原理和用途。3大黃中5 種游離羥基蒽醌化合物的酸性和極性與結(jié)構(gòu)有什么關(guān)系?4 pH 梯度萃取法的原理是什么?該法適用于哪些中藥成分的分離?5蒽醌類化合物及其甙的薄層色譜用什么作吸附劑、展開劑和顯色劑?6. 蒽醌類與醋酸鎂顯色反應(yīng)的必要條件是什么?其顏色反應(yīng)與羥基所在的位置有何關(guān)系 ?參考文獻(xiàn)1 楊其菖主編天然藥物化學(xué)北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1998， 84-872李嘉蓉主編天然藥物化