仿生制備及促進(jìn)脊柱融合的實(shí)驗研究

1、絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料的仿生制備及促進(jìn)脊柱融合的實(shí)驗研究摘要脊柱融合術(shù)是脊柱外科最常見的手術(shù)之一，主要用于治療由于創(chuàng)傷、退變、畸形、腫瘤等疾病導(dǎo)致的脊柱不穩(wěn)。雖然內(nèi)固定的使用為脊柱提供了即刻穩(wěn)定性，確保了植骨融合所需的生物力學(xué)環(huán)境，但脊柱的長期穩(wěn)定及生物學(xué)愈合還必須要依靠骨性融合。在目前臨床應(yīng)用的脊柱融合材料中，自體骨移植通常被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)，但是 自體骨來源有限，而且增加了手術(shù)部位，并伴有取骨區(qū)疼痛、神經(jīng)損傷、骨折、感染等并發(fā)癥，異體骨有免疫源性，而且存在傳染疾病的潛在風(fēng)險。因此，需要尋找理想的人工骨移植修復(fù)材料來促進(jìn)脊柱融合?，F(xiàn)有的人工骨修復(fù)材料：金屬材料，高分子材料、生物陶瓷材料

2、等存在各自優(yōu)缺點(diǎn)，單一材料都不能滿足臨床的需求，所以，目前研究的方向是利用不同材料的優(yōu)點(diǎn)，克服各自不足，制備具有良好性能的復(fù)合生物材料。絲素蛋白是一類由蠶絲和蜘蛛絲中提取的蛋白，與骨骼中的膠原蛋白相似，良好的生物相容性，生物安全性，優(yōu)越的力學(xué)性能，并且絲素蛋白表面容易化學(xué)共價修飾粘附位點(diǎn)和細(xì)胞因子，具有一定的生物降解性能，降解產(chǎn)物無毒副作用，對周圍組織有營養(yǎng)與修復(fù)作用，同時材料的來源廣闊，因此是一種具有廣闊應(yīng)用前景的生物材料，它作為臨床外科縫線已經(jīng)有悠久的歷史，目前在載藥系統(tǒng)以及組織工程方面的應(yīng)用研究很多，在骨科領(lǐng)域，包括骨支架，軟骨支架以及人工肌腱和韌帶等方面都有相關(guān)研究。近年來國外有報道絲

3、素蛋白能夠作為無機(jī)物礦化的模板，誘導(dǎo)羥基磷灰石的晶體生長，其與納米羥基磷灰石的復(fù)合可以模擬天然骨組織中的有機(jī)無機(jī)成分，可以彌補(bǔ)單純納米羥基磷灰石力學(xué)性能的不足，因此絲素蛋白與納米羥基磷灰石復(fù)合的生物材料有望成為理想的骨移植修復(fù)材料。本實(shí)驗以絲素蛋白和鈣磷溶液為原料，通過共沉淀法仿生合成了絲素蛋白納米羥基磷灰石類骨質(zhì)復(fù)合材料，實(shí)現(xiàn)復(fù)合材料在結(jié)構(gòu)和組成上與天然骨組織的仿生，然后對該復(fù)合材料的成骨細(xì)胞相容性進(jìn)行評價，并進(jìn)一步通過絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料與自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合用于兔腰椎后外側(cè)融合模型觀察其骨融合效果， 為探索一種可應(yīng)用于促進(jìn)脊柱融合，滿足臨床需求的的骨修復(fù)材料奠定實(shí)驗基礎(chǔ)。實(shí)驗第

4、一部分：絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料的仿生制備及表征目的：模擬骨組織的結(jié)構(gòu)和成分，仿生合成絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料。1第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文方法：以氯化鈣和磷酸氫二銨為原料，絲素蛋白作為調(diào)控納米羥基磷灰石晶體生長的模板，通過共沉淀法合成了絲素蛋白納米羥基磷灰石類骨質(zhì)復(fù)合材料。由于骨組織有榭無機(jī)為3070比例，選用nHA含量為70時制備的絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料作為研究對象。通過透射電鏡(TEM)、X射線衍射(XRD)、傅立葉傅立 葉變換紅外光譜儀(FTIR)、熱重分析儀(TGA)分析復(fù)合材料的晶相組成、微觀形貌、化學(xué)結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性。結(jié)果：通過FTIR、XRD、TEM、TGA及電

5、子衍射等檢測結(jié)果顯示，制備的SFnHA復(fù)合生物材料中絲素蛋白含量為32，模擬了天然骨組織中的有機(jī)成分比例；鈣磷比為166，與標(biāo)準(zhǔn)羥基磷灰石的鈣磷比167相近，獲得的磷灰石晶體為含有碳酸根的低結(jié)晶度納米羥基磷灰石，復(fù)合材料中的HA晶體長度約200500nIII左右，寬度在20-30nm，與天然骨組織中的磷灰石晶體相似；獲得的SFnHA復(fù)合生物材料中，nHh的鈣離子與絲素蛋白的羰基通過強(qiáng)烈的化學(xué)鍵合作用形成了熱穩(wěn)定的復(fù)合物；另外，研究結(jié)果表明，絲紊蛋白作為定向誘導(dǎo)HA晶體生長的模板，調(diào)控納米羥基磷灰石晶體沿C軸擇優(yōu)取向生長，生長方向與絲素蛋白纖維長軸平行， 與天然骨組織中磷灰石晶體在膠原纖維表面沉

6、積的結(jié)構(gòu)一致。結(jié)論：通過共沉淀技術(shù)成功仿生合成了在組成和結(jié)構(gòu)上均與天然骨組織結(jié)構(gòu)類似的絲素蛋白納米羥基磷灰石類骨質(zhì)復(fù)合材料。實(shí)驗第二部分：絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料的成骨細(xì)胞相容性研究目的：評價絲素蛋n納米羥基磷灰石復(fù)合材料與骨組織功能細(xì)胞一成骨細(xì)胞的相容性。方法：采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將MC3T3-E1成骨細(xì)胞接種在復(fù)合材料上進(jìn)行共培養(yǎng)，用倒置顯微鏡及掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料上的粘附及增殖情況，用茜素紅染色、Von Kossa染色等檢測成骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外鈣基質(zhì)的能力。結(jié)果：絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料可以促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的粘附、增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)和形成鈣結(jié)節(jié)。結(jié)

7、論：絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料具有良好的成骨細(xì)胞相容性。實(shí)驗第三部分：絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料復(fù)合自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)兔脊柱后外側(cè)融合的實(shí)驗研究。目的：了解絲素蛋白納米羥基磷灰石促進(jìn)兔脊柱融合的能力。方法：抽取兔子股骨大粗隆下骨髓，體外分離純化得到兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)行成骨方向誘導(dǎo)分化，行2絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料的仿生制備及促進(jìn)脊柱融合的實(shí)驗研究細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞表面抗原鑒定及堿性磷酸酶染色和Von Kossa染色評價細(xì)胞成骨情況。將絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料與骨髓基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合后應(yīng)用于新西蘭兔腰椎后外側(cè)脊柱融合模型，通過大體觀察、影像學(xué)觀察及組織學(xué)觀察、手法捫診檢查評價成

8、骨及脊柱融合情況。結(jié)果：1、BMSCs在培養(yǎng)皿中貼壁生長、增殖，條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后表現(xiàn)出明顯的成骨活性，細(xì)胞增殖良好，體外礦化結(jié)節(jié)Von Kossa染色陽性、堿性磷酸酶染色陽性，證實(shí)其有成骨潛能。2、術(shù)后12周取材。大體觀察可見SFnHA側(cè)骨組織再生明顯，新生骨體積大，X線、手法捫診均提示SFnHA側(cè)促進(jìn)脊柱融合的作用與自體骨相似，組織學(xué)分析提示SFnHA復(fù)合材料逐漸轉(zhuǎn)化為骨組織。結(jié)論：l、可以通過體外分離純化兔BMSCs，在一定條件下能夠向成骨方向誘導(dǎo)分化，并能使細(xì)胞保持較高的成骨活性，適于作為材料相容性的檢測細(xì)胞及構(gòu)建組織工程化骨的種子細(xì)胞。2、SFnHA復(fù)合材料復(fù)合自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞植入新西

9、蘭兔腰椎后外側(cè)，能夠獲得良好的脊柱融合效果，其脊柱融合效果與自體移植骨相似。關(guān)鍵詞：納米羥基磷灰石，絲素蛋白，骨誘導(dǎo)性，脊柱融合，生物相容性，骨髓基質(zhì)細(xì)胞第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文Abstractfusion is one of the most commonfor treatment ofSpinalspinalsurgery，primarilycausedand otherinstabilityby trauma，degeneration，deformity，cancerspinalspinediseasesinternal fixation is usedtO provide immedi

10、atestability of the spine，providing thebiomechanical fusionandnecessaryenvironment,however,Thelongterm stabilityfusionIn the current clinical use ofof themustbiological healingspinerelyonbonyconsideredfusionmaterials，autogenousboneisspinalgraftinggenerallythe”goldal e the limited amount of蓼m materia

11、lstandard”，themajor disadvantagesautograftofavailable嬲thepotential morbidityof the harvestcomplications including prolongedat thedamage，fractureand infectionbonehas also beendonorpainsite，nerveallograftandinclude immuneused，its disadvantagesriskof infectiouspotentialresponsetransmissiontherefore，wef

12、or the ideal bonebiomaterial tolookingpromotearegraftingspinal fusionthe bonesubstitutes currently available have specific disadvantages and noneandof them issuitable for clinicalentirelyapplication including metals，polymeron how to combine theceramicsSO，currentisof variousresearthadvantagesfocusing

13、theirbiomaterials withmaterial，overcomeshortcoming，to preparationcompositeofexcellent performanceexcellent biocompatibility，biodegradability and uniquefibroin hasSilkmechanicaland growthproperties，and can induce hydroxyapatitecrystal nucleationas the template ofinorganic mineralizationsilk fibroinna

14、no-hydroxyapatitecomposite biomaterial simulatesand structure of nature bonethecompositiontissue，improve nano-hydroxyapatitesinsufficient mechanical properties，and SO is expected to bean ideal bone graft biomaterialIn this experiment，biomimetic synthesis of silk fibroirdnanohydroxyapatite likeboneco

15、mposite biomaterial is accomplished by coprecipitation method using silk fibroin，CaCl2as rawmaterials，mimicingorganictheandconstituents ofand(NH4)2HP04inorganicandnatural tissueafterthat，thewithbiological safetybiocompatibilityosteoblasts areformation capacitythe degradation performanceectopic bonea

16、ndevaluated，andof silkbiomaterial is studiedfibroinnano-hydroxyapatite4compositeit intoofby puttingbags絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料的仿生制備及促進(jìn)脊柱融合的實(shí)驗研究evaluate the effect of silkrabbitmaterialmusclefurther，wefibroinnano-hydroxyapatitestromalbone marrowof rabbitcells on thecompound autogenousenhangcementspinalfusion

17、，in order to explore all ideal bone repair material to meet clinical needPart l：Biomimetic synthesis and characterization of silk fibroiW nanohydroxyapatitecomposite biomaterial0bjective：Simulating the compositionand structure of naturebone tissuebiomimeticfibroinnanoofsilksynthesisfibroinnanohydrox

18、yapatite compositeMethod：silk-hydroxyapetite composite biomaterial is synthesized bythe coprecipitation method usingsilkand(NH4)2HP04as raw materialsasfibroin，CaCl2componentsorganicinorganicratio in nature bonebiomaterial withareis3070，composites70nanohydroxyapatiteselectedstructure andfor furtherst

19、udythemicrostructure，phase composition，chemicalThermalaredeterminedelectronmicroscopy(SEM)，transmissionstabilitybyscanningelectronFourier transform infraredmicroscopy(TEM)，X-raydiffraction(XRD)，F(xiàn)ourieronResults：Thespectrometer(FTIR)，thermal gravimetric analysis(TGA)andSOtheas-preparedSFnHAcomposites

20、contain silk fibroinof32，simulatingproportioncalciumorganic ingradients in natural bone tissue，withphosphorus ratio166，similar toofthe standard calcium phosphate ratioin hydroxyapatiteCharacterization resultsshow thatthe inorganic componentin thecomposite is poorly crystalline HA containingcarbonate

21、200-500 nm inand around 20-30 nlil inionsThetypical HA crystalliteslengthpossesswidthThe SFis incorporated into the composite by strongchemical interactions betweenvia the chemical bonding between calcium ions and theHA andtakeSF，probablyplaceorientation of HAofSFthe silk fibroin will induceself-org

22、anizedearbonyl groupsof HAprogress spontaneously withnanocrystalthe template，the growthaswillcrystalpreferred orientation(along its c-axis)，whichissimilar to the apatite crystalsdeposited onthesurfaceoffibers in natural bone tissueConclusion：Like-bone silkcollagencomposite biomaterial isthefibroinna

23、nohydroxyapatitessynthesized bycoprecipitationmethod，the composition and structureis similar to the nature bone tissuestudy on the biocompatibility of SFnHA composite biomaterial cocultureedPart 2：A5-第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文with ratosteoblastsObjective：toevaluate theof SFnHAbiocompatibilitycompositebiomaterial

24、with bone tissue functional cellsosteoblastsMethods：MC3T3-E l osteoblastswere seeded on the SFnHAcompositeand CO-culturedtheadherentcell number andoateoblasts were observed by scanning electronmorphological changes ofmicroscopetheadhesion and proliferation were determined by invertedmicroscope and s

25、canningelectroncells were also stained for matrix minerlizationResults：the adherentmicroscope，thenumber of MC3T3-E 1 osteoblasts on the sueface of SFnHA composites are higher thanthe osteoblasts are moreto adhere andthat of control，andspreadSFnHA，theeasilyonmineralization of steoblasts wasalsoConlus

26、ion：biomimeticimprovedproliferationsynthesized SFnHA composite biomaterial has excellent biocompatibility for osteoblastsPart 3：theon the enhancement of rabbitfusion with silkstudyPosterolateralspinalbiomaterialbone marrowfibroinnano-hydroxyapatite compositecompound autogenousstromal ceilsObjective：

27、To evaluate the effectof the SFnHA composite biomaterial on theenhancement of posterolateral spinalfusionin rabbitMethods：Obtain bone marrow fromfemur trochanter，Isolate and pufffy BMSCsRabbit beneath the greaterin vitro and theninduce BMSCs indifferentiationobserve cellSmorphology，identifycellosteo

28、genicsurface antigen，evaluate cellS ossification by alkali phosphatase stain and Von Kossa stainto New-Zealand rabbitbiomaterialBMSCswere appliedSFnHAcompositecompoundlumbarfusion modelGross andPosterolateralimaging observation，histologicalspineexamination and manualthe fusion masses wereto evaluate

29、 thepalpation ofperformedability of enhancement of spinal fusionResults：1BMSCs cultured in the culture dish hasshowedofgood performanceadhesion，growth，proliferation,andgoodsignificantosteogenic activity after osteogenicinductionthe results ofVon Kossa stainalkaliandstain indicatedBMSCs hasrabbits we

30、reosteogenesis potential2Thephosphatasesacrificedat 1 2 weeks afterthe fusionthewereobtainedgrosssurgery，andsamplesobservation showed that thereis obsvious newon the silkboneregenerationfibroinnano-hydroxyapatite compositebiomaterial sidessimilarto theautografiedexamination demonstratedsidesX-ray，an

31、d palpation also evidenced the resultshietological6絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料的仿生制備及促進(jìn)脊柱融合的實(shí)驗研究thatbiomaterialtransformedintobonetissueSFnHAcompositegraduallyrabbit BMSCs in vitro Call been induced and differentiatedintoConclusions：1purifiedtheosteoblasts withhigh osteogenic activity，Call satisfyrequirementseed

32、ingofcell forbonetissueresearchandengineeringbiocompatibilitystudy2slikbiomaterial used for rabbitfibroinnanohydroxyapatite compositelumbarposterolateralfusion Can effectively enhance bonyfusion，similar to autograftsspinalKEY WORDS：Nanohydroxyapatite，silkfibroin，osteoinductivity，spinalstromalcellsfu

33、sion，biocompatibility，bonemarrow7第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文略縮詞表英文縮寫中文名稱英文名稱羥基磷灰石HAHydroxyapatiteSilk fibroin絲素蛋白SFX-ray diffraction spectroscopyX射線衍射光譜XRDFourier transform-infraredFT-IRspectroscopy傅立葉變換紅外光譜SEM掃描電鏡electronic microscopyScanningTEMTransmission electron透射電鏡microscopyFBSFetal bovine serum胎牛血清Phosphate

34、 buffered saline磷酸鹽緩沖液PBSMTT四甲基偶氮唑鹽3-(4，5一dimethylthiazol-2一y1)-2，5一diphenyltetrazolium bromide堿性磷酸酶ALPAlkaline phosphataseHEHematoxylin and eosin蘇木素一伊紅相對增值率RGRRelative growth rateBMSCsBone Mesenchymal stromal cells骨髓基質(zhì)(干)細(xì)胞SFnHASilk fibroinnanohydroxyapatite絲素蛋白納米羥基磷灰石DMEMDulbeccoSmodifiedmediumDul

35、becco改良Eagle培養(yǎng)基EagleS一8獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工 作。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng) 發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢 獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。學(xué)位論文作者簽名：日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)聲明本人完全了解第二軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，第二 軍醫(yī)大學(xué)有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)第二軍醫(yī)大學(xué)可以將學(xué)位論文全 文或部分內(nèi)容編入中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫、中國優(yōu)秀博碩士

36、學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)誅摯位 敝文 阼 者 躺孫彳刻馬導(dǎo)師簽名：銣歸日 期 今沁 吣年厶汨11】日期：以年石月目絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料的仿生制備及促進(jìn)脊柱融合的實(shí)驗研究刖罱一骨的組成和功能骨組織是一種高度分化的由骨細(xì)胞以及大量的細(xì)胞外基質(zhì)(骨基質(zhì))構(gòu)成的結(jié)締組織。骨細(xì)胞包括成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞，骨細(xì)胞以及骨祖細(xì)胞，骨基質(zhì)成分分為有機(jī)成分和無機(jī)成分，其中有機(jī)成分占35左右，包括95以上的膠原纖維(I型)以及少量的無定形基質(zhì)；無機(jī)成分占65，主要是弱晶態(tài)的羥基磷灰石結(jié)晶。骨組織從形態(tài)上分

37、為皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨。皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)堅實(shí)，主要起到機(jī)械支持的作用；松質(zhì)骨是類似海綿樣結(jié)構(gòu)。松質(zhì)骨具有很大的表體比，因此主要負(fù)責(zé)骨組織的代謝功能。松質(zhì)骨由鈣化的骨小梁結(jié)構(gòu)構(gòu)成，髓腔內(nèi)是造血的骨髓，周圍是堅實(shí)的皮質(zhì)骨。在健康成人骨組織，舊骨的吸收以及新骨的形成是處于平衡狀態(tài)的。一旦骨峰值在成人早期達(dá)到，骨塑形就會終生有序的進(jìn)行，骨組織被破骨細(xì)胞吸收的地方，由成骨細(xì)胞產(chǎn)生等量的新骨，這個過程叫做耦合。健康的骨組織是高度動態(tài)的組織，伴隨不斷的可控的更替。骨峰值與基因遺傳、營養(yǎng)、性激素水平以及運(yùn)動均有關(guān)。不同骨細(xì)胞在骨塑型過程中的協(xié)同作用非常復(fù)雜，并且會被許多疾病所破壞。這些疾病導(dǎo)致骨質(zhì)過度吸收或者是過度形成。

38、骨組織中可以找到四種骨細(xì)胞：成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞，骨細(xì)胞以及骨襯細(xì)胞。成骨細(xì)胞是骨組織中的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)合成骨基質(zhì)及類骨質(zhì)，通過礦化作用進(jìn)而成為骨組織。成骨細(xì)胞是間充質(zhì)細(xì)胞起源的，在局部生長因子比如成纖維細(xì)胞生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白以及Writ蛋白等作用下分化形成【l】。成骨細(xì)胞還需要Runx2以及Osterix轉(zhuǎn)錄因予的轉(zhuǎn)錄作用【l】。成骨細(xì)胞的胞膜富含堿性磷酸酶，其血清水平是成骨的標(biāo)志。成骨細(xì)胞膜還有甲狀旁腺激素、前列腺素、激素(雌激素和維生素D3)以及其它許多粘附分子和細(xì)胞因-了的受體。成骨細(xì)胞還在胞膜表達(dá)細(xì)胞因子。特別要指出，成骨細(xì)胞表達(dá)集落刺激因子1，以及核因子kB受體活化子，這兩

39、者可以活化破骨細(xì)胞生成。護(hù)骨素是核因予kB活化子的假受體，成骨細(xì)胞可以分泌護(hù)骨素來抑制破骨細(xì)胞的骨吸收。另外，骨內(nèi)的成骨細(xì)胞還有助于維持造血干細(xì)胞的自我更新潛能，后者可以傳遞信號促使干細(xì)胞在有助于成骨細(xì)胞生長的微環(huán)境巾錨赳2，31。成骨細(xì)胞分泌產(chǎn)生的細(xì)胞表面結(jié)合信號的配體，比如血管生成素一1，它是Tie一2受體酪氨酸激酶的受體，后者是由造血干細(xì)胞表達(dá)【41。研究發(fā)現(xiàn)Tie2陽性造血干細(xì)胞位于骨組織9第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文的表面，并且與表達(dá)血管生成素一l的成骨細(xì)胞聯(lián)系【5J。血管生成素1Tie2信號通路 對于維持成人骨髓中造血干細(xì)胞的靜止?fàn)顟B(tài)以及遠(yuǎn)期的再植活動具有重要作用【56J。骨細(xì)胞只是占

40、骨組織中一小部分比例，大部分是骨基質(zhì)，骨基質(zhì)即礦化的細(xì)胞外基質(zhì)，主要由有機(jī)質(zhì)(35)和無機(jī)基質(zhì)(65)構(gòu)成。礦化的細(xì)胞外基質(zhì)保證了骨骼的硬度和強(qiáng)度，同時還具有一定的彈性。有機(jī)基質(zhì)主要成分是I型膠原纖維(95)，其余是蛋白聚糖以及非膠原蛋白，比如骨鈣素，骨連接素，骨橋蛋白、骨涎蛋白和鈣結(jié)合蛋白等。骨細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白是由成骨細(xì)胞合成和分泌的。細(xì)胞外基質(zhì)中的無機(jī)成分主要是弱結(jié)晶狀態(tài)的納米羥基磷灰石晶體，形成連續(xù)的有支持力的類膠原纖維樣結(jié)構(gòu)，并與膠原纖維結(jié)構(gòu)平行，與膠原之間有交聯(lián)，在膠原纖維周圍可以獲 得晶體結(jié)合力。膠原纖維可以作為模板調(diào)控納米羥基磷灰石的形成，并且決定了礦化物的結(jié)晶方式和結(jié)晶的大小

41、，提供礦物結(jié)晶的生長點(diǎn)。因此，從骨的組成和功能而言，天然骨組織主要是有無機(jī)納米羥基磷灰石和有機(jī)膠原纖維構(gòu)成的復(fù)合材料，納米羥基磷灰石晶體賦予骨組織的堅硬性和高壓縮強(qiáng)度，而膠原纖維(主要是I型膠原纖維)賦予骨組織的韌性、彈性和高抗拉、抗彎強(qiáng)度，兩者的有機(jī)結(jié)合使得骨組織成為機(jī)體最堅硬的組織之一【】。二骨移植修復(fù)材料在脊柱融合術(shù)中的應(yīng)用臨床上對于脊柱創(chuàng)傷、退變、腫瘤、畸形等疾病的患者行手術(shù)治療后造成的脊柱不穩(wěn)，常需進(jìn)行脊椎融合術(shù)，因而脊椎融合術(shù)是脊柱外科中最常施行的外科術(shù)式。據(jù)統(tǒng)計，在美國每年約要進(jìn)行425，000例以上植骨融合術(shù)，其中60以上為脊柱融合術(shù)。相應(yīng)的用于脊柱融合術(shù)的骨移植修復(fù)材料及促進(jìn)

42、骨愈合的相關(guān)產(chǎn)品的醫(yī)療市場達(dá)4-20億美圓【l們。按此估算，我國每年實(shí)施的脊柱融合術(shù)數(shù)量應(yīng)不亞于這一數(shù)字，其 未來的骨移植材料市場需求極大。目前臨床脊柱融合手術(shù)中使用的骨移植修復(fù)材料根 據(jù)來源的不同分為自體骨、異體骨和人工骨移植材料。它們都存在各自不同的優(yōu)缺點(diǎn)， 目前還沒一種理想的骨移植替代材料可以完全滿足臨床的需求，因此，關(guān)于骨移植修 復(fù)材料的研究近十年來一直是生物材料學(xué)和骨外科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。以下就當(dāng)前的骨移植修復(fù)材料研究現(xiàn)狀及進(jìn)展予以闡述。-lO絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料的仿生制備及促進(jìn)脊柱融合的實(shí)驗研究(一)自體骨理想的骨移植替代材料應(yīng)該具有良好的生物相容性，生物可吸收性，骨傳導(dǎo)性，

43、骨誘導(dǎo)性，結(jié)構(gòu)與自然骨組織相似，使用方便，價格低廉【ll12】。自體骨是目前最接近理想要求的骨移植修復(fù)材料，也是目前評價其他新型骨移植修復(fù)材料植骨融合效果的“金標(biāo)準(zhǔn)”【13】。自體骨同時具有骨傳導(dǎo)性，骨誘導(dǎo)性以及成骨性能。同時，自體骨移植不存在免疫反應(yīng)、組織相容性、疾病傳播或高醫(yī)療費(fèi)用等問題，是目前脊柱融合術(shù)首選的骨移植材料。但是自體骨移植也存在不少問題，如：1、數(shù)量及來源有限，松質(zhì)自體骨通常取自髂嵴，包括髂前和髂后。其他的取骨部位包括脛骨近端、橈骨遠(yuǎn)端、尺骨鷹嘴、跟骨、股骨大轉(zhuǎn)子等，所有這些部位的自體骨取骨量均有限，不能滿足大段骨缺損和各類翻修手術(shù)的需要；2、供區(qū)取骨導(dǎo)致的相關(guān)并發(fā)癥，有報道

44、在5,-25114】，主要有：血管、神經(jīng)損傷，骨折，血腫，感染和慢性疼痛等；3、延長手術(shù)時間，增加了手術(shù)部位，加重手術(shù)創(chuàng)傷。當(dāng)自體骨用于脊柱融合部位后，可能存在自體骨移植物的缺血壞死，但是，其巾一些骨細(xì)胞存活下來，并且作為成骨材料。自體皮質(zhì)骨具有一定的力學(xué)強(qiáng)度可以用作結(jié)構(gòu)性成分，但是在植骨愈合及融合之前必須進(jìn)行保護(hù)。松質(zhì)骨較皮質(zhì)骨能夠更快與周圍骨組織融合，但是其強(qiáng)度較皮質(zhì)骨差。目前，自體骨移植可取最大量的部位在髂嵴后部。雖然自體骨是目前最接近理想骨移植物的材料，但是其仍存在一定的不足，因此也促進(jìn)了骨移植物的研究。(二)異體骨異體骨包括同種異體骨和異種異體骨。目前臨床使用的異體骨包括各種形式，如

45、皮質(zhì)骨，松質(zhì)骨及骨軟骨等。異體骨的優(yōu)點(diǎn)在于沒有取骨區(qū)的并發(fā)癥，并且不存在取骨數(shù)量的限制，移植骨的尺寸也較自體骨要大。不過與自體骨相比，它與宿主骨的整合較慢，并且可能存在免疫排斥反應(yīng)。而且，自體骨更大的問題在于費(fèi)用以及捐獻(xiàn)者的數(shù)量有限，大多數(shù)都從尸體中獲得。近幾年肌肉骨骼捐獻(xiàn)的數(shù)量有所上升，但是絕對數(shù)量還是很低，比如有個最新的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)在美國每年的捐獻(xiàn)數(shù)量大約在22000例左 右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于每年進(jìn)行的骨移植手術(shù)數(shù)量。而且，異體骨移植存在疾病傳播的潛在風(fēng)險，而且植入體內(nèi)后可能出現(xiàn)免疫反應(yīng)，11第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文導(dǎo)致炎癥及植骨塊吸收等，這些都限制了異體骨移植的應(yīng)用。(三)脫鈣骨基質(zhì)脫鈣骨基質(zhì)(de

46、mineralized bone matrix，DBM)是異體骨的一種特殊類型，是由同種異體骨經(jīng)過酸提取去除礦化相后所得到的膠原和生長因予成分。由于活性的生長因子在脫鈣骨基質(zhì)制備過程中活性得以保留，因此它均有骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)性能。皮質(zhì)骨比松質(zhì)骨更適合用來制備脫鈣骨基質(zhì)。最早1965年由Urist首次報道了脫鈣骨基質(zhì) 作用1151。隨后其在脊柱融合術(shù)中應(yīng)用得到深入的研究。Oikarinen等最初證實(shí)DBM 可成功地促進(jìn)家兔腰椎的后路融合，其融合率高于凍干的異體骨。在大鼠胸腰椎后路融合術(shù)模型中，Peterson掣171通過組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)DBM的骨誘導(dǎo)效應(yīng)與自體松質(zhì)骨等同。Bomback等實(shí)驗表明在大

47、鼠后路脊柱融合中應(yīng)用DBM結(jié)合自體骨髓細(xì)胞移植，其融合效果優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用DBM和自體骨髓移植。Martin等【19】應(yīng)用一種用油灰結(jié)合的新型DBM材料進(jìn)行實(shí)驗研究，結(jié)果表明，其成骨能力優(yōu)于自體骨。然而臨床應(yīng)用DBM進(jìn)行脊椎融合的療效，各家報道不一。Thalgott等【20】的回顧性研究顯示，在腰椎前路融合術(shù)中，DBM的假關(guān)節(jié)形成率為46，高于自體松質(zhì)骨的假關(guān)節(jié)形成率(26)。Cammisa等【211則在腰椎后外側(cè)融合術(shù)中應(yīng)用DBM和自體骨進(jìn)行對比研究， 結(jié)果表明，DBM無論在融合率和融合后的力學(xué)強(qiáng)度劣于自體骨。而另有一組資料顯示，在36例應(yīng)用DBM結(jié)合自體骨和54例單純自體骨移植的腰椎后路融合術(shù)

48、的比較研究中，兩組最后的融合效果無差別【22】。不過，DBM作為骨移植替代物也存在一些缺點(diǎn)，如：分批處理時存在骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)性能差異；仍有一定的抗原性；原料污染后存在易傳染的致病微生物等。(四)人工骨移植修復(fù)材料l醫(yī)用金屬材料醫(yī)用金屬材料是骨科應(yīng)用最早的生物醫(yī)用材料之一，強(qiáng)度高、耐疲勞并且容易加工，是骨科常用的生物材料，多用作骨科內(nèi)固定板、螺釘、人工關(guān)節(jié)、椎間融合器、脊柱矯形棒等。最常用的金屬材料包括：不銹鋼、鈷基合金、鈦合金、鎳鈦形狀記憶合金等。相關(guān)研究表明，不銹鋼金屬進(jìn)入體內(nèi)后會發(fā)生腐蝕作用，導(dǎo)致長期植入后的穩(wěn)定1 2絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料的仿生制備及促進(jìn)脊柱融合的實(shí)驗研究性下降，

49、而且不銹鋼的密度及彈性模量與人體骨組織相差較大，容易導(dǎo)致力學(xué)遮擋的發(fā)生。鈷基合金較不銹鋼相比，耐蝕性更好，耐磨性是醫(yī)用金屬材料中最好的材料，但是加工較困難，另外價格也較昂貴，鈦合金足目前臨床應(yīng)用效果最理想的醫(yī)用金屬材料之一，具有良好的生物親和性，抗腐蝕性高，彈性模量與骨組織相對接近，韌性好，但是鈦合金的硬度較低，耐磨性差，長期磨損會導(dǎo)致鈦合金表面氧化膜破壞，產(chǎn)生的磨損碎屑會導(dǎo)致植入物周圍的骨細(xì)胞死亡，發(fā)生溶骨反應(yīng)。鎳鈦合金具有其他醫(yī)用金屬材料無法比擬的特性一超彈性和形狀記憶性能，但是，鎳的致敏性和可疑的致癌性使得其生物安全性受到質(zhì)疑。植入人體的金屬材料與組織間的相互作用儀發(fā)生在材料表面的幾個原

50、子層處，通過對其表面改性可改善材料的性能。如用鈦合金粉末與鈷鉻鉬合金通過粉末冶金方法制造多孔金屬材料，用于制備人工關(guān)節(jié)，因材料呈多孔狀態(tài)，骨組織可以長入孔中，實(shí)現(xiàn)植入材料與機(jī)體組織的結(jié)合。金屬材料的強(qiáng)度和韌性較高，耐腐蝕性、耐磨性，可鍛性和再現(xiàn)性好，澆鑄成型不降低強(qiáng)度。但將其植入人體后仍存在許多問題，往往植入的金屬材料并沒有像設(shè)想的那樣完全發(fā)揮作用，相反還產(chǎn)生或多或少的副作用，給人體帶來不適。因此進(jìn)一步改善金屬材料的生物相容性，增加與肌體組織的結(jié)合力，提高安全使用性能是今后所要著力解決的問題。2醫(yī)用高分子材料該類材料分為合成高分子材料和天然高分予材料。合成高分子材料主要包括聚乳酸、聚羥基乙酸、

51、聚羥基丁酸、聚羥基戊酸及聚乳酸與聚羥基乙酸共聚物等，并可通過選擇不同合成方式和成型工藝，調(diào)整聚合物分I了量、分子量分布，控制其力學(xué)性能和降解速度，但其存在細(xì)胞親和性差、致炎癥反應(yīng)、機(jī)械強(qiáng)度不足、X線片不能顯示不便于觀察等問題【231。Goma等通過共聚反應(yīng)合成了羥基丁酸和乙二醇嵌段共聚物，顯著改善了聚羥基丁酸均聚物的韌性和親水性【241。天然高分子材料主要包括膠原、 明膠、纖維蛋白，絲素蛋白、海藻酸鈣、甲殼素及其衍生物等，該類材料特點(diǎn)是生物相容性好，利于細(xì)胞黏附、增殖和分化。缺點(diǎn)是缺乏必要的機(jī)械強(qiáng)度。明膠具有良好的生物相容性及可降解性，Ponticiello等人的研究顯示明膠可作為骨髓基質(zhì)細(xì)胞

52、、軟骨細(xì)胞或生長因子的載體，進(jìn)行細(xì)胞移植，促進(jìn)骨折愈合及骨缺損的修復(fù)【25-271。Labiji13第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文等研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖與成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分別混合培養(yǎng)，成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞均能保持其在機(jī)體內(nèi)的球形或圓形正常形態(tài)281。膠原是骨組織的主要成份之一，為鈣化組織提供必不可少的三維結(jié)構(gòu)，對礦物沉 積有誘導(dǎo)作用。Scotchford等研究發(fā)現(xiàn)I型膠原是骨中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，它占骨干 重的30，占骨中有機(jī)相成分的90-95t291。目前對于應(yīng)用I型膠原作為骨修復(fù) 材料的研究引起了許多學(xué)者的興趣。Mizuno等將I型膠原用作骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞可定向分化為成骨細(xì)胞，最

53、終形成含骨髓成分的新生骨組織【30】。I型膠原具有可降解性、生物相容性好、可參加組織愈合過程等優(yōu)點(diǎn)。但I(xiàn)型膠原材料具有降解快、機(jī)械強(qiáng)度小等缺點(diǎn)，而且其主要來自與動物體內(nèi)提取或人工合成，動物來源的I型膠原存在免疫反應(yīng)的可能，而人工合成的I型膠原價格昂貴。因此，目前有學(xué)者開始尋找其他類似膠原的生物材料，來進(jìn)行骨組織成分的仿生，同時克服其不足。單一高分子材料的力學(xué)性能和生物相容性往往難以滿足硬組織一骨修復(fù)材料的 要求，因而圍繞著：1)提高機(jī)械強(qiáng)度，2)控制降解速度，3)改善組織相容性等方面的研究和開發(fā)新型的生物降解高分子復(fù)合材料是目前醫(yī)用高分子生物材料的熱門課題【3133】o3醫(yī)用生物陶瓷材料目前，

54、在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的生物陶瓷根據(jù)其在體內(nèi)的活性可分為(1)生物惰 性陶瓷，如氧化鋁生物陶瓷、氧化鋯生物陶瓷、硼硅酸玻璃；(2)生物活性陶瓷，如羥基磷灰石、磷酸鈣基生物陶瓷、生物活性玻璃陶瓷、雙相鈣磷陶瓷；(3)可吸收性生物陶瓷，如B磷酸三鈣生物陶瓷、硫酸鈣生物陶瓷134,351。其中，羥基磷灰石(HA)，13磷酸三鈣(B-TCP)，生物活性玻璃陶瓷(BGC)和雙相鈣磷陶瓷(HA廠rCP)是最常用的骨移植修復(fù)材料。羥基磷灰石納米羥基磷灰石羥基磷灰石的分子式為Ca6(P04)10(OH)2，在組成成分和結(jié)構(gòu)上與骨骼、牙齒等 一致，具有良好的生物活性和生物相容性。但該材料也存在一些不足之處，如不具有 骨誘導(dǎo)性，脆性大，塑形差，降解速度慢等。(1)納米羥基磷灰石因其具有超微納米結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出一系列的獨(dú)特性能。由于納米材14絲素蛋白納米羥基磷灰石復(fù)合材料的仿生制備及促進(jìn)脊柱融合的實(shí)驗研究料存在表面效應(yīng)和界面效應(yīng)，不僅使燒結(jié)溫度降低，還可以顯著提高陶瓷材料的強(qiáng)度、硬度、