植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、植 物 組 織 培 養(yǎng)實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告學(xué)院：生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院班級(jí)：11生物技術(shù)(制品)學(xué)號(hào)： 2011192017 ： 鵬 植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)一 植物組織培養(yǎng)母液的配制一 、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解植物組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基的組分與其作用。2.學(xué)習(xí)掌握植物組織培養(yǎng)MS培養(yǎng)基的配制方法。二 、實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中離體組織賴以生存和發(fā)育的條件。大多數(shù)培養(yǎng)基的成分是有無機(jī)鹽、有機(jī)化合物（碳源、維生素、肌醇、氨基酸等）、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、水分和其他附加物等五大類物質(zhì)組成。無機(jī)鹽類由大量元素和微量元素組成。大量元素中，氮類化合物主要以硝酸類和銨類化合物的形式存在，但在培養(yǎng)基中多用硝酸類，也可以將硝酸類和銨

2、類混合使用；磷和硫常用磷酸鹽和硫酸鹽來提供；鉀是培養(yǎng)基中主要的陽(yáng)離子；鈣、鈉、鎂的需要量較少。微量元素包括碘、錳、銅、鋅、鈷、鐵。培養(yǎng)基中的鐵離子，大多數(shù)以螯合物的形式存在，即硫酸亞鐵與乙二胺四乙酸二鈉的混合。有機(jī)化合物包括碳源、維生素、肌醇、氨基酸等。培養(yǎng)中的植物組織和細(xì)胞的光合作用較弱，因此，需要在培養(yǎng)基中附加一些碳水化合物物來提供營(yíng)養(yǎng)需要。培養(yǎng)基中的碳水化合物通常為蔗糖。蔗糖除了作為培養(yǎng)基的碳源和能源外，對(duì)維持培養(yǎng)基的滲透壓也起著重要的作用。在培養(yǎng)基中加入維生素有助于細(xì)胞的分裂和增長(zhǎng)。一般包括VB1、B6、煙酸、生物素、葉酸、泛酸鈣、VC。肌醇在糖類的相互轉(zhuǎn)化、維生素和激素的利用等方面具

3、有重要的催進(jìn)作用。常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)包括以下三類：生長(zhǎng)素類：吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、二氯苯氧乙酸（2,4-D）細(xì)胞分裂素：玉米素（ZT）6-芐基嘌呤（6-BA）和激動(dòng)素（KT）。赤霉素：組織培養(yǎng)中使用的赤霉素只有一種，即赤霉酸（GA3）。培養(yǎng)基中的其他附加物包括人工合成和天然的有機(jī)物附加物。其中最為常見的為酵母提取物。瓊脂作為培養(yǎng)基的支持物，也是最常用的郵寄附加物，他可以是培養(yǎng)基呈固體狀態(tài)，以利于組織和細(xì)胞的培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)是否成功，在很大的程度上取決于培養(yǎng)基的選擇之上。目前普遍使用的是MS培養(yǎng)基。MS固體培養(yǎng)基可用于誘導(dǎo)愈傷組織，或用于胚胎、莖段、莖尖與花藥的培養(yǎng)等。MS

4、培養(yǎng)基的硝酸鹽、鉀和銨的含量略高于其他的培養(yǎng)基，也是它被普遍使用的原因之一。三 、實(shí)驗(yàn)材料、試劑、配方和儀器設(shè)備 1試劑NH4NO3 ,KNO3,KH2PO4 ,CaCl22H2O ,MgSO47H2O,FeSO47H2O Na2-EDTA,MnSO44H2O,ZnSO47H2O,H3BO3,KI,Na2MoO42H2OCuSO45H2O,CoCl26H2O,肌醇，甘氨酸，鹽酸硫胺素，鹽酸吡哆醇， 煙酸，蒸餾水。2.儀器設(shè)備 電子天平，燒杯（50ml、100ml、500ml）量筒（1000ml、100ml、25ml） ， 容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，移液管（10ml，5ml

5、，1ml）試劑瓶，玻璃棒數(shù)支，藥匙，稱量紙等。3、培養(yǎng)基配方各種母液的吸取量藥品名稱擴(kuò)大倍數(shù)1L培養(yǎng)基吸取母液的量（mL）大量元素10100微量元素10010鐵鹽10010有機(jī)10010蔗糖30g瓊脂0.8gPH5.8-6.3MS培養(yǎng)基大量元素母液配制化合物名稱培養(yǎng)基濃度(mg/L)稱取質(zhì)量(g)NH4NO3165041.25KNO3190047.50KH2PO41704.25MS培養(yǎng)基微量元素母液配制化合物名稱培養(yǎng)基濃度(mg/L)稱取質(zhì)量(g)MnSO44H2O22.355.7ZnSO47H2O8.621.5H3BO36.211.5KI0.8320.75Na2MoO42H2O0.256.2

6、5CuSO45H2O0.00250.625CoCl26H2O0.00250.625MS培養(yǎng)基鐵鹽母液配制化合物名稱培養(yǎng)基濃度(mg/L)稱取質(zhì)量(g)FeSO47H2O27.86.95Na2-EDTA37.39.32MS培養(yǎng)基有機(jī)物質(zhì)母液的配制化合物名稱培養(yǎng)基濃度(mg/L)稱取質(zhì)量(g)肌醇1002甘氨酸20.2煙酸硫胺素0.48鹽酸吡哆醇0.510煙酸0.510MS培養(yǎng)基鈣鹽和鎂鹽母液的配制化合物名稱培養(yǎng)基濃度(mg/L)稱取質(zhì)量(g)CaCl22H2O44011MgSO47H2O3709.25四、 實(shí)驗(yàn)步驟1 、計(jì)算：計(jì)算各化學(xué)成分所需要的量。大量、微量和鹽類按擴(kuò)大50倍，定容500ml

7、的配制計(jì)算。有機(jī)和肌醇按擴(kuò)大100倍，定容200ml的配制計(jì)算。計(jì)算后制成配方表。2、制定標(biāo)簽：裁取適當(dāng)大小的牛皮紙，用鉛筆寫上MS，種類，并標(biāo)明此類母液所含物質(zhì)，質(zhì)量，定容體積，擴(kuò)大倍數(shù)吸取量，制備人，制備日期以大量為例如圖： MS鈣鹽母液CaSO42H2O定容 500ml吸取量 20mL/L制備人： 李 鵬配制日期： 2013.10.63、大量元素母液的配制 ：先用量筒量取300ml蒸餾水放入 500ml 燒杯中，按照配方表中用量依次分別稱取： NH4NO3 ,KNO3 , KH2PO4 , 待第一種化合物完全溶解后再 加入第二種化合物，溶解過程用玻璃棒攪拌，當(dāng)最后一種化合物完全溶解后，將

8、溶液轉(zhuǎn)移至 500ml 容量瓶中，并用蒸餾水將燒杯和玻璃棒洗滌3次，每次約50ml，而后用蒸餾水定容至 500ml，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，并置于冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?、微量元素母液的配制按照配方表中用量用電子天平依次稱取 MnSO44H2O, ZnSO47H2O， H3BO3, KI, Na2MoO42H2O。CuSO45H2O和 CoCl26H2O先稀釋后用移液管吸取,按制備母液 I 的方法逐個(gè)溶 解，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，洗滌燒杯，然后定容至 500ml，轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明 母液名稱，放大倍數(shù)，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?、 鐵鹽母液的制備 把 FeSO4

9、7H2O 和 Na2-EDTA 分別置于適量蒸餾水中，加熱攪拌使之完全溶解，保持加熱，把 FeSO4 倒入 Na2-EDTA 溶液中并攪拌，接近沸騰時(shí)停止加熱，冷卻后調(diào) PH 到 5.5，將溶液轉(zhuǎn)移至 500ml 容量瓶中，洗滌后用蒸餾水定容至 500ml，轉(zhuǎn)入細(xì)口試 劑瓶中，用力振蕩 12min，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱，放大倍數(shù)，配制日期， 配制人，并置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?、 有機(jī)化合物母液的制備按配方表中用量依次稱?。蝴}酸硫胺素,鹽酸吡哆醇，煙酸, 甘氨酸，用蒸餾水溶解后，定容200ml轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱，放大倍數(shù)，配制日期，配制人， 并置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?、植物生

10、長(zhǎng)物質(zhì)母液制備 NAA 母液:準(zhǔn)確稱取 10mg,用少量 1mol/L NaOH 溶解后加蒸餾水定容至 100ml,即 配制成 0.1mg/ml 的 NAA 母液，轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱， 放大倍數(shù)，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?6BA 母液配制方法相似，濃度為 2mg/ml五、試驗(yàn)結(jié)果分析與注意事項(xiàng)1、配制母液時(shí)注意藥品只能出不能進(jìn)。2、制作標(biāo)簽時(shí)只能能用鉛筆寫，防止油性筆字跡在高壓滅菌后模糊不清。實(shí)驗(yàn)二、培養(yǎng)基的制備與滅菌一 、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)母液法配制培養(yǎng)基。2、學(xué)習(xí)用牛皮紙包三角瓶口的防污染方法。3、學(xué)習(xí)并熟悉自動(dòng)化滅菌鍋的操作和保護(hù)。二 、 實(shí)驗(yàn)原理

11、為防止組織培養(yǎng)各物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)所以把微量和鐵鹽混在一起，為了避免物質(zhì)的反應(yīng)，所以要迅速倒入沸騰的蒸餾水中，瓊脂應(yīng)慢慢倒入，并邊攪拌邊倒入。組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有植物生長(zhǎng)所必需的各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)， 同時(shí)也是微生物繁殖的極好場(chǎng)所，因此必須對(duì)培養(yǎng)基滅菌處理，以確保無菌操作的順利進(jìn)行。三 、 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器設(shè)備1.試劑： 瓊脂，蔗糖，蒸餾水，1mol/L NaOH,各類母液2.儀器設(shè)備：電子天平，燒杯，量筒，移液管，玻璃棒，藥芍，稱量紙，PH 試紙，錐形瓶，牛皮紙，棉塞等。四、 實(shí)驗(yàn)步驟1.準(zhǔn)備 將所需的各種母液按順序放好，將潔凈的各種玻璃器皿放在指定置。2 .大量的量取 取 50ml量筒一個(gè)，將大

12、量、有機(jī)、肌醇、鎂鹽，鈣鹽、按配方表中的用量依次稱取并倒入500ml燒杯中。3 .微量鐵鹽的量取 取 50ml 量筒一個(gè)，將微量和鐵鹽按配方表中的用量稱取并倒入100ml燒杯中。 4.培養(yǎng)基配制 取瓷盆一個(gè)，加入 1.5L 蒸餾水，置于電磁爐上加熱，將稱量好的所有母液倒入瓷盆中，用玻璃棒不斷攪拌。再稱量瓊脂 16 克，白砂糖 60 克，依次倒入瓷盆中，邊倒入邊攪拌，待瓊脂和白砂糖完全溶解后，并定容至 2L。5、調(diào)PH 用 1mol/L NaOH 和1molL HCl調(diào) PH 至 6.0。6、分裝 把培養(yǎng)基分裝到三角瓶中，每瓶約50ml，用棉塞塞好再用牛皮紙，細(xì)繩包扎好，待滅菌。7、滅菌 將所有

13、的三角瓶整齊的放在滅菌鍋的鐵絲籃中，將溫度調(diào)為121滅菌20min。滅完后擺放在水平的實(shí)驗(yàn)桌上勿動(dòng)。五、 試驗(yàn)結(jié)果分析與注意事項(xiàng) 1、配制培養(yǎng)基前先大致估計(jì)一下藥品數(shù)量，不夠時(shí)提前配制。 2、三角瓶滅菌時(shí)注意要放干凈冷空氣。3、加的藥品種類較多，切忌加錯(cuò)。4、注意把三角瓶用棉塞塞好和用牛皮紙包好。5、滅完菌的三角瓶勿動(dòng)，等待培養(yǎng)基冷卻凝固。6、瓊脂不可加太快，以防加太快瓊脂結(jié)塊。實(shí)驗(yàn)三 無菌植株的建立一 、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、通過實(shí)驗(yàn)，初步掌握外植體材料的消毒。2、學(xué)習(xí)超凈工作臺(tái)滅菌方法和操作要求。3、學(xué)習(xí)掌握無菌接種操作技術(shù)。二 、 實(shí)驗(yàn)原理 植物細(xì)胞具有全能型，其外植體接種在無菌的人工培養(yǎng)基上，

14、給予適當(dāng)?shù)臈l件能長(zhǎng)成完整的無菌植株。三 、 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器設(shè)備豌豆，1% 84消毒液，0.5升汞溶液，超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)基，鑷子，酒精燈，噴霧器。四、 實(shí)驗(yàn)步驟1.準(zhǔn)備 打開超凈工作臺(tái)，將鑷子酒精燈放如超凈工作臺(tái)中，用紫外燈照20min后關(guān)閉紫外燈，同時(shí)將豌豆種子用自來水沖20min關(guān)閉紫外燈后在臺(tái)上點(diǎn)燃 2 個(gè)酒精燈，用棉球?qū)㈣囎訜?次，超凈作臺(tái)少2次。將滅菌溶液，無菌水， 豌豆，大燒杯等放入超凈工作臺(tái)。2.滅菌 在超凈工作臺(tái)上取經(jīng)浸泡處理的豌豆，先用酒精倒入種子瓶中約23消毒一次（1-2s）接著用無菌水沖洗一次。再用84 消毒液搖晃清洗清洗 3 次，每次 5 分鐘，清洗完后用無菌水沖洗

15、一次。而后用 0.5%HgCI 泡8min，處理 2 次，每次 5 分鐘。后用無菌 水搖晃清洗 4-5次。3.接種 將所要用的三角瓶用75的酒精噴濕，接著把手噴濕并把三角瓶帶入超凈工作臺(tái)。接著將滅菌處理好的材料在超凈工作臺(tái)上用鑷子靠近酒精燈的外焰放入向下傾斜的錐形瓶杯中，每個(gè)瓶裝 4 粒豌豆，接種過程中錐形瓶應(yīng)一直保持向下傾斜，直到接種完畢蓋上棉塞。4.標(biāo)記 接種完畢后，用棉線綁好用鉛筆在牛皮紙標(biāo)上制作人，日期和“隴豌一號(hào)”，放入有光的培養(yǎng)架上。五、 試驗(yàn)結(jié)果分析與注意事項(xiàng)1.豌豆在自來水下不能沖洗太長(zhǎng)，以免影響發(fā)芽率。2.在豌豆滅菌時(shí)注意升汞、酒精滅菌時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格注意， 過長(zhǎng)會(huì)對(duì)種子活性造成影

16、響。3.升汞有劇毒，操作要小心。4.接種時(shí)瓶口一定要在酒精燈火焰上方，瓶口要朝下以減少污染率。實(shí)驗(yàn)四 脫分化培養(yǎng)基的制備一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 學(xué)習(xí)脫分化培養(yǎng)基的制備。2、 熟悉MS培養(yǎng)基與脫分化培養(yǎng)基的異同。二、 實(shí)驗(yàn)原理 脫分化所用到的化學(xué)物質(zhì)與MS培養(yǎng)基最大的區(qū)別是需要激素誘導(dǎo)。所以脫分化培養(yǎng)基需要在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加激素進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)。三 、實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器設(shè)備 MS培養(yǎng)基的大量，微量，鈣鹽，鎂鹽，鐵鹽，有機(jī)，肌醇和0.1mg/ml 的 2，4-D，0.1mg/ml的6-BA，瓊脂，糖，1molL的NaOH，1molL的HCl，三角瓶，棉塞，牛皮紙，燒杯，量筒，移液管，玻璃棒，PH試

17、紙。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.準(zhǔn)備 將所需的各種母液按順序放好，將潔凈的各種玻璃器皿放在指定置。2 .大量的量取 取 50ml量筒一個(gè)，將大量、有機(jī)、肌醇、鎂鹽，鈣鹽、按配方表中的用量依次稱取并倒入500ml燒杯中。3 .微量，鐵鹽的量取 取 50ml 量筒一個(gè)，將微量和鐵鹽按配方表中的用量稱取并倒入100ml燒杯中。4.激素的量取 用移液管量取6ml 0.1mgmL的6-BA，用量筒量取30ml 0.1mgL的2，4-D一并到入50ml的小燒杯中。4.培養(yǎng)基配制 取瓷盆一個(gè)，加入 2L 蒸餾水，置于電磁爐上加熱，將稱量好的所有母液倒入瓷盆中，用玻璃棒不斷攪拌。接著把激素加入，邊倒入邊攪拌再稱量瓊脂 1

18、5克，白砂糖 90克，依次倒入瓷盆中，邊倒入邊攪拌，待瓊脂和白砂糖完全溶解后，并定容至 3L。5、調(diào)PH 用 1mol/L NaOH 和1molL HCl調(diào) PH 至 6.0。6、培養(yǎng)基分裝 把培養(yǎng)基分裝到60個(gè)三角瓶中，每瓶約50mL，用棉塞塞好再用牛皮紙，細(xì)繩包扎好，待滅菌。7、滅菌 將所有的三角瓶整齊的放在滅菌鍋的鐵絲籃中，將溫度調(diào)為121滅菌20min。滅完后擺放在水平的實(shí)驗(yàn)桌上勿動(dòng)，等待凝固。五、試驗(yàn)結(jié)果與注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng)1、三角瓶滅菌時(shí)注意要放干凈冷空氣。2、加的藥品種類較多，切忌加錯(cuò)。3、注意把三角瓶用棉塞塞好和用牛皮紙包好。4、滅完菌的三角瓶勿動(dòng)，等待培養(yǎng)基冷卻凝固。5、瓊脂不可加太快，以防加太快瓊脂結(jié)塊。實(shí)驗(yàn)五 豌豆莖、葉愈傷組織的建立一 、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)組培接愈傷操作技術(shù)。2、了解最佳接愈傷的植物組織部位。3、通過誘導(dǎo)豌豆莖、葉形成愈傷組織學(xué)習(xí)愈傷組織的建立方法。二 、實(shí)驗(yàn)原理植物細(xì)胞具有全能性，已經(jīng)分化的植物細(xì)胞在適宜條件下可脫分化形成愈傷組織。三 、實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器設(shè)備