γ射線照射預防供者淋巴細胞輸注相關移植物抗宿主病的實驗研究

1、射線照射預防供者淋巴細胞輸注相關移植物抗宿主病的實驗研究我們借助相關移植物抗宿主病(PT-GVHD)動物模型，觀察不同劑量射線照射對T淋巴細胞增殖及細胞毒活性的影響，以及射線照射對GVHD的預防作用。報告如下。材料和方法1動物近交系BALB/c(H-2d)小鼠，雄性，89周齡，由第一軍醫(yī)大學實驗動物中心提供；615(H-2k)小鼠，雌性，89周齡，由中國醫(yī)學科學院血液學研究所提供。出生4872小時新生及成年615/BALB/c F1小鼠由本實驗室繁殖飼養(yǎng)。2射線照射放射源為60Co 射線，劑量率為0.5Gy/min，照射野為10cm10cm，放射源與細胞間距離為50cm。3PT-GVHD動物模

2、型參照孟玉茹等方法1，稍作改進。供鼠為親代BALB/c(H-2d)小鼠，受鼠為615/BALB/c F1新生及成年小鼠。供鼠脾淋巴細胞經(jīng)7.5Gy 照射后，新生F1代經(jīng)腹腔注射2106細胞/只，成年F1小鼠經(jīng)尾靜脈注射致死量1107細胞/只，觀察GVHD發(fā)生。4供鼠脾細胞60Co照射制備脾細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1106/ml，分別給予0，2.5，5.0，7.5，10.0Gy 射線照射。模擬體內(nèi)抗原刺激的環(huán)境，在含500U/ml白細胞介素2(IL-2)、10g/ml CD3的培養(yǎng)體系中，37、體積分數(shù)為5%CO2條件下培養(yǎng)72小時，光鏡下觀察淋巴細胞的克隆增殖情況。5測定照射后淋巴細胞DNA含

3、量收集上述不同劑量照射后培養(yǎng)72小時的脾細胞，過200目網(wǎng)，PBS洗2次。4，體積分數(shù)為70%的冷乙醇固定30分鐘，加入50l RNase(5mg/ml)消化15分鐘，碘化丙錠(PI，50g/ml)450l染色30分鐘，F(xiàn)ACScalibur檢測各樣本DNA含量，每個樣本計數(shù)2104個細胞。CellQuest軟件獲取數(shù)據(jù)，ModFitLT2.0進行結果分析。67.5Gy 射線照射淋巴細胞存活率測定參照董秀明等方法2稍作改進。7.5Gy照射淋巴細胞在培養(yǎng)終止前4小時，加入培養(yǎng)液1/10體積、濃度為5mg/ml的MTT液，4小時后棄去培養(yǎng)液，加入與培養(yǎng)液等量二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10分鐘，酶

4、標儀(芬蘭)492nm處測吸光度(A)值。分別測定照射后4，24，72小時脾細胞A值，與對照組(照射前)A值相比，即為照射后不同時間的細胞存活率。7射線照射的細胞毒活性測定參照何金生等方法3，在酶標儀492nm處測A值。8實驗設計實驗分3組，每組6只小鼠。實驗組為未照射和7.5Gy 射線照射脾細胞輸注，同時設同基因供鼠脾細胞輸注組為對照。9評價指標新生F1小鼠以脾增大指標來判斷腹腔注射供鼠脾細胞后的GVHD反應1。注射后10日處死小鼠，分別稱體重及脾重，結果以脾指數(shù)表示，計算方式如下：脾指數(shù)1(SI1)脾重/體重脾指數(shù)2(SI2)實驗組SI1均值/對照組SI1均值(通常認為SI21.3即有意義

5、)。成年小鼠致死性GVHD發(fā)生以存活率來評價。GVHD表現(xiàn)為：精神萎靡，不活潑，弓背，豎毛，體重減輕，腹瀉，進食量下降等。死亡鼠結合病理學檢查確立診斷。結果160Co 射線照射對脾T淋巴細胞增殖活性的影響不同劑量60Co 射線照射脾細胞，經(jīng)流式細胞術檢測結合細胞形態(tài)學觀察，可見T淋巴細胞增殖活性呈照射劑量依賴性降低，7.5Gy照射已基本去除T細胞的增殖活性，形態(tài)學觀察未見克隆增殖。FACScalibur測定G1期明顯阻滯，S期細胞比例下降(3.07%)。27.5Gy照射對脾淋巴細胞存活率及細胞毒活性的影響應用MTT法，對7.5Gy照射脾細胞行72小時細胞存活率動態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)細胞存活率隨照射時間

6、延長而下降，照射后4小時細胞存活率為81.9%，照射后24小時細胞存活率降為62.6%，照射后72小時細胞存活率降為最低值56.7%。細胞毒活性測定結果也表明：7.5Gy照射脾細胞對原代L615白血病細胞的殺傷具有明顯的增強效應(28.06，P0.01)。3射線照射供鼠脾淋巴細胞輸注對新生小鼠GVHD的影響新生小鼠發(fā)生GVHD的結果：兩實驗組SI2均大于1.3，兩組SI1比較，差異具有非常顯著的統(tǒng)計學意義(t5.11，P0.01)，表明兩組盡管均有GVHD的發(fā)生，但發(fā)生的程度差異非常顯著(見表1)。4射線照射供鼠脾淋巴細胞輸注對成年小鼠存活率的影響從成年小鼠發(fā)生致死性GVHD結果看：未照射組受

7、鼠6周存活率33.3%，而7.5Gy照射組為83.3%，兩組比較，差異有非常顯著的統(tǒng)計學意義(251.41，P0.001)(表2)。表1射線照射供鼠脾淋巴細胞輸注對新生小鼠GVHD的影響組別鼠數(shù)(只)SI1(10-2)SI2未照射組60.9760.0631.93照射組60.6710.082?#1.33對照組60.5050.042 注：與未照射組比較，?t5.11，P0.01；與對照組比較，t3.12，P0.05；與對照組比較，t10.78，P0.001 表2射線照射供鼠脾淋巴細胞輸注對成年小鼠6周存活率的影響組別鼠數(shù)(只)存活鼠數(shù)(只)6周存活率(%)1周2周4周6周未照射組6543233.3

8、照射組6665583.3?對照組66666100.0 注：與未照射組比較，*2=51.41,P0.001 討論通過射線照射消除供者T淋巴細胞的增殖活性，使得GVHD發(fā)生的自身放大正反饋網(wǎng)絡被阻斷，無疑會減輕GVHD發(fā)生程度，降低GVHD發(fā)生率。但射線照射在去除T淋巴細胞增殖活性的同時，是否會影響到其細胞毒功能的發(fā)揮，已成為臨床研究避免GVHD發(fā)生而保留或放大移植物抗白血病作用(GVL)的關鍵。我們通過觀察不同劑量射線照射對T淋巴細胞增殖活性的影響，證實了射線照射能夠降低T細胞的增殖活性，且呈照射劑量依賴性下降，7.5Gy 射線照射已能夠最大程度地去除T細胞的增殖活性。進一步對7.5Gy 射線照

9、射脾細胞進行細胞存活率及細胞毒活性檢測發(fā)現(xiàn)：7.5Gy 射線照射脾細胞存活率隨照射時間延長而下降，且7.5Gy 射線照射脾細胞對原代L615白血病細胞殺傷具有明顯的增強效應，這與文獻4報告相一致。兩組SI2均大于1.3，表明兩組盡管均有GVHD發(fā)生，但程度顯著不同。一方面可能與本實驗脾細胞輸注的量偏大有關，另一方面更說明了GVHD是一種多因素、多種機制共同參與的復雜病理過程。7.5Gy 射線照射能夠最大程度去除T細胞增殖活性，而不影響其細胞毒功能發(fā)揮這一初步實驗結果，為進一步研究避免GVHD發(fā)生的同時，保留或放大供者淋巴細胞輸注抗白血病作用開辟了新的思路。志謝：本課題得到軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學

10、研究所董波、柳曉蘭、熊國林先生的大力支持和幫助，一并感謝基金項目:本課題受廣東省自然科學基金(950553)資助作者單位：張立成510282廣州，第一軍醫(yī)大學珠江醫(yī)院血液科郭坤元現(xiàn)在山東省泰安市，解放軍第八八醫(yī)院271001羅慶良軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所參考文獻1孟玉茹，黃平，郭坤元.淋巴因子激活的骨髓細胞或脾細胞對小鼠移植物抗宿主病的預防作用.中華血液學雜志,1993,14:564-566.2董秀明,糜福順,沈瑜.MTT法在放射生物學中的應用.中華放射醫(yī)學與防護雜志,1991,11：234-237.3何金生,李瑞珠,宗庭益.MTT還原法檢測NK細胞活性的方法學研究.中國免疫學雜志,1996,12:356-358.4Waller EK,Redei I,Yeager AM,et al.7.5Gy irradiation attenuates the graft-versus-host disease poten