測(cè)序質(zhì)量判斷和測(cè)序常見(jiàn)問(wèn)題ppt課件

1、測(cè)序質(zhì)量判斷和測(cè)序常見(jiàn)問(wèn)題DNA測(cè)序原理 目前用于測(cè)序的技術(shù)主要有Sanger等1977發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和 Gilbert1977發(fā)明的化學(xué)降解法。 Sanger 法測(cè)序的原理 Sanger 法測(cè)序的原理就是利用一種DNA聚合酶來(lái)延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測(cè)定由一套四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和

2、ddNTPs的相對(duì)濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長(zhǎng)幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。 它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上，可通過(guò)高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。自動(dòng)化測(cè)序 首先，通過(guò)對(duì)ddNTP進(jìn)行不同的熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)在一個(gè)泳道實(shí)現(xiàn)四種堿基判讀。 后來(lái)，各公司有改進(jìn)了電泳方法，將毛細(xì)管電泳技術(shù)引入了測(cè)序儀，大大提高了分辨率。（排除了橫向擴(kuò)散和泳道間的干擾）影響測(cè)序結(jié)果的因素測(cè)序反應(yīng)測(cè)序反應(yīng)反應(yīng)組分模版引物其他標(biāo)準(zhǔn)試劑污染組分反應(yīng)條件體積退火溫度退火時(shí)間產(chǎn)物純化樣品純度（空氣，鹽離子，染料，乙醇）電泳分離電泳分離上樣量電泳條件檢

3、測(cè)檢測(cè)熒光激發(fā)和接受的靈敏度常見(jiàn)問(wèn)題 反應(yīng)整體差，雜峰很多，序列完全比不上 序列能比上，但很多地方有“突變”，有“插入”，有“缺失” 測(cè)序長(zhǎng)度太短了常見(jiàn)問(wèn)題的原因 反應(yīng)整體差，雜峰很多，序列完全比不上 根本沒(méi)反應(yīng)，引物和模版不匹配 序列能比上，但很多地方有“突變”，有“插入”，有“缺失”，測(cè)序長(zhǎng)度太短了 有反應(yīng)，但質(zhì)量差 分析一下原因可幫助大家卻認(rèn)測(cè)序結(jié)果，確定是否需要重新測(cè)序。 分析時(shí)應(yīng)從大到小，從整體入手整體比對(duì)反應(yīng)整體形狀具體位置原因有強(qiáng)平均峰寬，峰形向前拖引物降解向后拖樣品降解頭大腳小反應(yīng)前部較好但很短，看峰形是個(gè)“大頭娃娃”引物過(guò)多信號(hào)突然衰減或消失Poly結(jié)構(gòu)互補(bǔ)結(jié)構(gòu)個(gè)別位置問(wèn)題70-80，100-120有C或T峰染料峰200,400有G峰乙醇峰50bp之前信號(hào)雜亂，有高峰引物二聚體個(gè)別堿基不匹配前后反應(yīng)信號(hào)良好突變反應(yīng)過(guò)程中突然有高峰位置不定氣泡弱模版量引物引發(fā)效率無(wú)有反應(yīng)信號(hào)多模版多結(jié)合