基礎醫(yī)學免疫學實驗技術

1、會計學1基礎醫(yī)學免疫學實驗技術基礎醫(yī)學免疫學實驗技術第1頁/共82頁醫(yī)學應用：科研應用：免疫共沉淀、免疫印跡、染色質免疫共沉淀、免疫熒光技術、ELISA等1.診斷：各類血清學檢測，抗人球蛋白測試，早孕檢測 等2.治療：單克隆抗體療法（類風濕性關節(jié)炎多發(fā)性硬化癥等），腫瘤治療。第2頁/共82頁第3頁/共82頁第4頁/共82頁延長抗原的作用時間增強吞噬作用刺激抗原提呈促進細胞因子分泌誘導淋巴細胞分裂、增殖影響T細胞“極化”佐劑的作用機理：佐劑的作用機理：抗原制備：抗原制備：商品化或自行表達基礎免疫：基礎免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全佐劑（Complate Freund adjuvand ,含礦

2、物油,卡介苗等)。加強免疫：加強免疫：第2次以后，抗原量減半，多次，間隔2-4周，用佛式不完全佐劑(Incomplate Freund adjuvand ,不含卡介苗).取血測效價：取血測效價： 加強免疫兩次或三次以后的第7天取血。放血制備血清：放血制備血清：可一次放血(頸動脈)也可多次取血(耳靜脈)第5頁/共82頁第6頁/共82頁第7頁/共82頁第8頁/共82頁第9頁/共82頁第10頁/共82頁HGRPT：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶 TK：胸腺嘧啶核苷激酶HAT：次黃嘌呤（H)、胸腺嘧啶核苷（T)、氨基蝶呤（A)第11頁/共82頁第12頁/共82頁第13頁/共82頁第14頁/共82頁第1

3、5頁/共82頁第16頁/共82頁第17頁/共82頁第18頁/共82頁第19頁/共82頁第20頁/共82頁第21頁/共82頁第22頁/共82頁第23頁/共82頁第24頁/共82頁 單抗 多抗抗體組成 單一 復雜 抗體性質 個體的屬性 群體綜合的性質純化標記 容易，效果好 難度高一些 種屬來源 絕大多數(shù)是小鼠 兔、羊、豚鼠等制備周期 長 (最短4個月） 短（2個月）制備技術 復雜 簡單經費 多 少 第25頁/共82頁第26頁/共82頁第27頁/共82頁第28頁/共82頁第29頁/共82頁第30頁/共82頁不易吸附不易吸附的非蛋白質抗原可用間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的的非蛋

4、白質抗原可用間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法?？乖兌却蟠筇岣?，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNADNA，這種包被方法均勻、牢固，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。脂類物質脂類物質無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISAELISA板孔中板孔中，開蓋置冰箱過夜或

5、冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質自然干固在固相表面。，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質自然干固在固相表面。 優(yōu)點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳。抗原用量少，僅為直接包優(yōu)點：試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳?？乖昧可?，僅為直接包被的被的1/101/10乃至于乃至于/100/100。第31頁/共82頁第32頁/共82頁第33頁/共82頁第34頁/共82頁第35頁/共82頁第36頁/共82頁第37頁/共82頁第38頁/共82頁印跡法（blotting）是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立

6、了將DNA轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNADNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。 埃德溫邁勒薩瑟恩 （Edwin Mellor Southern） 第39頁/共82頁第40頁/共82頁第41頁/共82頁6.最后加上相應的底物溶液，當二抗上的酶催化底物產生化學發(fā)光時,用X光片曝光，洗片后就會產生可見的區(qū)帶，指示目的蛋白質的位置和強弱。3.通過電

7、泳將蛋白樣品分開。5.印跡首先用封閉液（如5的脫脂奶粉）處理以封閉固相載體上剩余的疏水結合位點，而后用目的蛋白的抗血清（一抗）孵育，印跡中只有目的蛋白質與一抗特異性結合。洗去游離的一抗后，用再與酶標記的二抗孵育4.將電泳分離的蛋白從凝膠轉移至一種固相支持體.轉移后的硝酸纖維素膜就稱為一個印跡（blot），用于對蛋白質的進一步檢測。1.提取細胞或組織蛋白，測定總蛋白濃度2.測定總蛋白濃度，并處理樣品第42頁/共82頁n 不論采用那種方法，都應遵循以下原則： 1盡可能采用簡單方法進行樣品處理，以避免蛋白丟失。 2細胞和組織樣品的制備應盡可能減少蛋白的降解，低溫和蛋白酶抑制劑可以減少蛋白的降解，蛋白

8、酶抑制劑的種類很多，要根據(jù)具體情況具體選擇。本實驗中選用PMSF(苯甲基磺酰氟)作為蛋白酶抑制劑。 3樣品裂解液應該新鮮制備，并且分裝凍存于-80。切勿反復凍融已制備好的樣品。BRIPA buffer： Tris-HCl 50 mM, pH 7.4 NP-40 1% 去氧膽酸鈉 0.25% NaCl 150 mM EDTA 1 mM 目的：要獲得高豐度、高品質的蛋白質，以滿足后續(xù)實驗的需求目的：要獲得高豐度、高品質的蛋白質，以滿足后續(xù)實驗的需求A細胞總蛋白裂解緩沖液(100 ml)： 1 PBS 80ml Tritonx-100 1ml 去氧膽酸鈉 0.5g SDS 0.1g 補1PBS緩沖液

9、至100ml. 第43頁/共82頁注意事項：注意事項：1.注意個人防護。PMSF嚴重損害呼吸道黏膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進有致命危險。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，立即用大量水沖洗。2.所用離心機需提前預冷。3.為防止蛋白降解，所有操作應在冰上完成。4.吸取蛋白上清液時，注意不要把沉淀吸上來。第44頁/共82頁n Western Blot作為一項半定量實驗技術，電泳前，必須盡量使各組 之間總蛋白量基本一致;n 蛋白質總量不足可能妨礙對目的蛋白的鑒定; 蛋白質含量太高則會使帶形扭曲,甚至會影響此電泳方法的分辨力基于以上兩方面原因，在進行蛋白電泳之前，先要對提取的總蛋白進行含量測定基于以上兩方面原

10、因，在進行蛋白電泳之前，先要對提取的總蛋白進行含量測定第45頁/共82頁第46頁/共82頁第47頁/共82頁第48頁/共82頁注意事項：注意事項：第49頁/共82頁第50頁/共82頁第51頁/共82頁-濾紙濾紙凝膠凝膠膜膜濾紙濾紙+第52頁/共82頁注意事項：注意事項：第53頁/共82頁n ECL ECL試劑采用氧化還原反應的原理：利用二抗上標記試劑采用氧化還原反應的原理：利用二抗上標記 的辣根過的辣根過氧化物酶氧化物酶(HRP)(HRP)，使底物發(fā)生氧化還原反應，從而產生化學。，使底物發(fā)生氧化還原反應，從而產生化學。第54頁/共82頁第55頁/共82頁注意事項：注意事項：第56頁/共82頁第

11、57頁/共82頁第58頁/共82頁第59頁/共82頁第60頁/共82頁第61頁/共82頁內參名稱分子量大小適用范圍Tubulin55kD胞漿和全細胞VCDA1/Porin31kD線粒體COXIV16kD線粒體Lamin B166kD細胞核TBP38kD細胞核第62頁/共82頁第63頁/共82頁第64頁/共82頁3T3 LinePtK1 LineNBL-6 LineRK13 LineLongitudinal FissureBlood VesselsCerebellum第65頁/共82頁直接法：熒光素標記的特異性抗直接法：熒光素標記的特異性抗體直接與相應抗原反應。體直接與相應抗原反應。間接法：特異性抗體與相應抗間接法：特異性抗體與相應抗原反應，熒光素標記的抗抗體原反應，熒光素標記的抗抗體再與第一抗體結合。再與第一抗體結合。 第66頁/共82頁第67頁/共82頁第68頁/共82頁第69頁/共82頁第70頁/共82頁第71頁/共82頁第72頁/共82頁第73頁/共82頁第74頁/共82頁第75頁/共82頁第76