第三章組織培養(yǎng)

1、Click to edit Master title styleClick to edit Master text stylesSecond levelThird levelFourth levelFifth level*單擊此處編輯母版標題樣式單擊此處編輯母版文本樣式第二級第三級第四級第五級*第三章 園林植物苗木培育技術(shù)3.4組織培養(yǎng)育苗植物組織培養(yǎng)：根據(jù)植物細胞的全能性原理，將植物的器官、組織、細胞，接種到人工配制的培養(yǎng)基上，在人工控制的條件下，進行離體培養(yǎng)，使其產(chǎn)生完整植株的過程。試管苗3.4.1植物組織培養(yǎng)技術(shù)的實用性特點（1）植株組培快繁、周期短、節(jié)省材料（2）應(yīng)用廣泛3.4.2植物

2、組織培養(yǎng)的育苗技術(shù) 1）基本條件（1）實驗室洗滌室稱量室3.4.2植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù) 1）基本條件（1）實驗室培養(yǎng)基制備室滅菌室3.4.2植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù) 1）基本條件（1）實驗室接種室緩沖室3.4.2植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù) 1）基本條件（1）實驗室培養(yǎng)室3.4.2植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù) 1）基本條件（1）實驗室培 養(yǎng) 室準 備 室滅菌室儲藏室接種室緩沖室植物組織培養(yǎng)實驗室布局示意圖為了減少污染，實驗室最好設(shè)一走廊且走廊上方最好安裝紫外燈；培養(yǎng)室最好設(shè)在南面，設(shè)大玻璃窗，以雙層玻璃窗為最好。如果培養(yǎng)室是設(shè)在房屋的邊側(cè)，其東邊或西邊的墻上也可設(shè)置大玻璃窗；培養(yǎng)室房間及門要小，而且密閉性

3、要好，最好裝移門；無菌操作室要小，要設(shè)緩沖間，也最好裝移門，且門要稍大一些。3.4.2植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù) 1）基本條件（2）儀器設(shè)備和用具酸度計細菌過濾器超凈工作臺3.4.2植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù) 1）基本條件（2）儀器設(shè)備和用具高壓蒸汽滅菌鍋3.4.2植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù) 1）基本條件（2）儀器設(shè)備和用具3.4.2植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù) 1）基本條件（2）儀器設(shè)備和用具3.4.2植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù) 1）基本條件（3）培養(yǎng)容器3.4.2植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù) 2）操作技術(shù)（1）玻璃器皿洗滌3.4.2植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù) 2）操作技術(shù)（2）培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基的重要性基本培養(yǎng)基：指只含有

4、維持離體植物細胞基本生命活動所需的營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基。通常包括水分、無機營養(yǎng)成分和有機營養(yǎng)成分，不包括激素和天然有機附加物。完全培養(yǎng)基：指在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上另外附加激素或天然有機附加物所組成的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的構(gòu)成培養(yǎng)基水無機鹽類有機營養(yǎng)大量元素化合物微量元素化合物氨基酸類糖類維生素類植物生長調(diào)節(jié)劑生長素類細胞分裂素類凝固劑組織培養(yǎng)時，植物激素的使用規(guī)律 在生長素存在的條件下，細胞分裂素的作用有加強的趨勢，但二者在使用上有一定的順序關(guān)系，處理順序不同，培養(yǎng)物的分化狀態(tài)也不同。規(guī)律如下：先用生長素處理，后用細胞分裂素處理，有利于細胞分裂，但細胞不容易分化，容易產(chǎn)生多倍體細胞。先用細胞分裂素處理，后

5、用生長素處理，細胞分裂也分化。用生長素和細胞分裂素同時處理，細胞脫分化后分化頻率提高。但二者的使用濃度比值可以決定器官分化方向：生長素/細胞分裂素比值高時，有利于根分化，抑制芽形成。反之，有利于芽分化，抑制根形成。比值適中時，促進愈傷組織的形成和生長。高無機鹽含量的培養(yǎng)基 代表類型：MS，LS，BL，ER硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基 代表類型：B5，N6，SH中等無機鹽含量的培養(yǎng)基 代表類型：Nitsch，Miller低無機鹽含量的培養(yǎng)基 代表類型：White，WS，HE培養(yǎng)基的配方成 分使用濃度(mg/L)成 分使用濃度(mg/L)硝酸鉀（KNO3）1900碘化鉀（KI）0.83硝酸銨（NH4NO

6、3）1650硼酸（H3BO3）6.2磷酸二氫鉀（KH2PO4）170硫酸鋅（ZnSO47 H2O）8.6硫酸鎂（MgSO47H2O）370鉬酸鈉（Na2MoO42 H2O）0.25氯化鈣（CaCl22H2O）440硫酸銅（CuSO45 H2O）0.025硫酸亞鐵（FeSO47H2O）27.8氯化鈷（CoCl26 H2O） 0.025硫酸錳（MnSO44H2O）22.3甘氨酸2乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）37.3鹽酸硫胺素（VB1）0.1肌醇100鹽酸吡哆醇（VB6）0.5蔗糖30000煙酸（VB5或VPP）0.5瓊脂7000MS培養(yǎng)基配方 成 分使用濃度(mg/L)成 分使用濃度(mg/

7、L)硝酸鉀（KNO3）2500碘化鉀（KI）0.75硫酸銨（NH4）2SO4）134硼酸（H3BO3）3.0磷酸二氫鉀（KH2PO4）150硫酸鋅（ZnSO47 H2O）2.0硫酸鎂（MgSO47H2O）250鉬酸鈉（Na2MoO42 H2O）0.25氯化鈣（CaCl22H2O）150硫酸銅（CuSO45 H2O）0.025硫酸亞鐵（FeSO47H2O）27.8氯化鈷（CoCl26 H2O） 0.025硫酸錳（MnSO44H2O）10鹽酸硫胺素（VB1）10乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）37.3鹽酸吡哆醇（VB6）1.0肌醇100煙酸（VB5或VPP）1.0蔗糖20000瓊脂7000B5培

8、養(yǎng)基配方 成 分使用濃度(mg/L)成 分使用濃度(mg/L)硝酸鉀（KNO3）80硫酸錳（MnSO44H2O）7氯化鉀（KCl）65硼酸（H3BO3）1.5硝酸鈣（Ca (NO3) 24H2O300硫酸鋅（ZnSO47 H2O）3硫酸鎂（MgSO47H2O）720硫酸鐵（Fe(SO4)3）2.5碘化鉀（KI）0.75鹽酸硫胺素（VB1）0.1硫酸鈉（NaSO4）200鹽酸吡哆醇（VB6）0.1磷酸氫鈉（NaH2PO4H2O）16.5煙酸（VB5或VPP）0.5甘氨酸3蔗糖20000White培養(yǎng)基配方 基本培養(yǎng)基母液的配制 單配法 混配法 按照避免難溶性沉淀形成的原則和物質(zhì)種類的不同，將基本

9、培養(yǎng)基配方所包括的物質(zhì)進行分組基本培養(yǎng)基配方中物質(zhì)劃分組數(shù)的多少，即配制母液數(shù)的多少可根據(jù)實際情況而定，如MS培養(yǎng)基可以配制三液式、四液式、五液式等例如：MS培養(yǎng)基五液式大量元素母液鈣鹽母液微量元素母液鐵鹽母液有機營養(yǎng)成分母液3.4.2植物組織培養(yǎng)的育苗技術(shù) 2）操作技術(shù)（3）外植體消毒、接種接種：把處理好的材料經(jīng)無菌操作程序放置到培養(yǎng)基上，這一過程外植體器皿和器具的洗滌洗滌劑：無磷中性的肥皂粉、洗衣粉和洗潔精常用清洗方法：洗滌劑清洗法、超聲波清洗法 消毒 器皿消毒器具的滅菌方法消毒 器皿消毒干熱滅菌法高壓蒸汽滅菌法（濕熱滅菌法）火焰灼燒滅菌法高溫蒸汽滅菌法消毒 培養(yǎng)基消毒培養(yǎng)基濕熱滅菌最少時

10、間液體容積（ml）121所需時間（min）20-50157520 250-50025 1000301500-200035-40培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌）操作滅菌后培養(yǎng)基的存放：鍋內(nèi)加水放入消毒桶裝入培養(yǎng)基蓋好鍋蓋接通電源加熱排盡鍋內(nèi)冷空氣達到滅菌溫度時開始計時并保持足夠長的時間繼續(xù)加熱切斷電源壓力表指針歸零時打開鍋蓋取出培養(yǎng)基并存放好高壓蒸汽滅菌鍋安全使用注意事項：滅菌前外層鍋內(nèi)要加入足夠的水,滅菌完成后要將鍋內(nèi)的水排放干凈。在滅菌過程中及滅菌后，壓力表壓力指針歸零之前,不能打開鍋蓋,以免發(fā)生危險。注意日常維護和檢查,及時發(fā)現(xiàn)問題,及時修理，保證使用安全可靠。使用高壓蒸汽滅菌鍋進行物品滅菌

11、時的注意事項：消毒鍋內(nèi)放置的物品要有一定的縫隙，便于高溫蒸汽上下回流，達到良好滅菌效果。鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡，否則壓力表的指針雖然達到了規(guī)定的壓力，但由于鍋內(nèi)冷空氣的存在，并不能達到相應(yīng)的溫度，因而影響滅菌效果。進行培養(yǎng)基滅菌時，鍋內(nèi)達到規(guī)定的滅菌溫度后，在嚴格保持滅菌溫度的同時，還要嚴格保持滅菌時間。時間過長會破壞培養(yǎng)基內(nèi)一些化學成分的有效性，時間過短則達不到滅菌效果。過濾除菌法消毒 培養(yǎng)基消毒消毒 無菌操作室內(nèi)的滅菌方法消毒 外植體的表面滅菌 化學消毒劑滅菌法70%酒精、HgCl2、次氯酸鈉、過氧化氫、次氯酸鈣等外植體表面滅菌操作前的準備工作： 無菌水、漂洗瓶、切割用器皿和金屬器具均經(jīng)過

12、高溫高壓滅菌并整齊擺放在超凈工作臺上。 滅菌劑配制好并整齊擺放在超凈工作臺上。外植體表面滅菌的一般過程外植體取材備用無菌水充分漂洗35次無菌條件下，消毒劑處理無菌條件下，70%酒精表面消毒30S60S預(yù)處理影響外植體消毒效果的因素： 消毒劑種類 消毒劑使用濃度 消毒處理時間接種 全部應(yīng)在無菌條件下進行外植體接種操作前的準備工作接種 全部應(yīng)在無菌條件下進行外植體接種的具體步驟切割外植體培養(yǎng)瓶傾斜靠近酒精燈火焰瓶蓋外部在火焰上旋轉(zhuǎn)灼燒數(shù)秒鐘旋開瓶蓋，扣放在酒精燈旁邊瓶口在火焰上旋轉(zhuǎn)灼燒數(shù)秒鐘用無菌鑷子將外植體均勻放置在培養(yǎng)基上瓶蓋在火焰上灼燒兩圈蓋緊瓶蓋接種 全部應(yīng)在無菌條件下進行常用外植體的種類莖尖帶節(jié)莖段節(jié)間部莖段葉片和葉柄鱗片