PCR原理與技術(shù)

1、PCR-polymerase chain reaction 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，實際上是一種體外的DNA復(fù)制技術(shù)。因此，它的過程與體內(nèi)DNA復(fù)制有相似之處，只不過在體外就得采取體外的技術(shù)方法達(dá)到生物體內(nèi)的效果。體內(nèi)DNA復(fù)制首先是將雙鏈DNA打開，使用的是解旋酶。PCR技術(shù)是通過升高溫度變性的方法。體內(nèi)DNA復(fù)制的引物由RNA聚合酶來完成，PCR是通過降溫使人工合成的引物退火。延伸都是聚合酶發(fā)生作用的階段，只不過體內(nèi)體外的溫度不同。PCR原理PCR過程：變性、退火、延伸，此過程循環(huán)反應(yīng)。變性就是將雙鏈的DNA打開，使其變成單鏈，以使引物可與其結(jié)合（堿基互補(bǔ)配對）。變性的方法就是升高溫度到94-98

2、，溫度因酶而異。退火就是緩慢降低變性溫度至引物與模板結(jié)合。延伸就是將溫度升到聚合酶活性最佳溫度，進(jìn)行聚合反應(yīng)。以上3個過程完成一次為一個循環(huán)，一般PCR可以進(jìn)行25-35次循環(huán)。擴(kuò)增225-35倍。PCR原理從PCR的過程可知道，PCR反應(yīng)的進(jìn)行需要的條件為：DNA聚合酶模板引物原材料和能量dNTP反應(yīng)發(fā)生所需要的水鹽環(huán)境還有外部環(huán)境條件溫度（PCR儀提供）PCR原理94 3min （預(yù)變性）94 30s （變性）60 30s （退火）72 1min （延伸）72 10min （充分延伸）4 hold （可有可無）PCR經(jīng)典反應(yīng)條件25-35個循環(huán)Taq酶 （有很多種聚合酶）Buffer （反

3、應(yīng)所需要的緩沖液，含鎂離子等）dNTP模板DNA （來自基因組DNA, 質(zhì)粒，cDNA等）引物DNA （公司合成）無核酸酶的水PCR反應(yīng)體系（1）模板）模板 單、雙鏈DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 一般100ng DNA模板/100uL 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。PCR反應(yīng)體系參數(shù)（2）引物濃度）引物濃度 0.1-0.5 mmol/L 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq DNA聚合酶（聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ul 酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量PCR

4、反應(yīng)體系參數(shù)（4）dNTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度 四種dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性PCR反應(yīng)體系參數(shù)（5） Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度PCR反應(yīng)體系參數(shù)（1）變性）變性 使雙鏈DNA解鏈為單鏈 94 20-30秒（2）退火）退火

5、溫度由引物長度和GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。循環(huán)參數(shù)（3）延伸）延伸 70-75,一般為72 延伸時間由擴(kuò)增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版DNA的濃度 一般為25-35次 次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低 錯誤摻入率增加循環(huán)參數(shù)PCR動畫引物設(shè)計原則 引物設(shè)計必須具有特異性，應(yīng)在沒有同源序列的區(qū)域內(nèi)設(shè)計 引物長度一般在1530堿基之間 G+C含量在40%60%之間 引物盡量不形成二級結(jié)構(gòu)，引物之間盡量不形成二聚體 堿基要隨機(jī)分布，引物自身不能有連續(xù)5個以上的相同堿基 引物5端可以修飾，引物3端必須嚴(yán)格互補(bǔ) 引物3端要避開密碼子

6、的第3位，并且盡量不要用A 引物設(shè)計要跨內(nèi)含子或隔內(nèi)含子 注意mRNA 有不同的isoform，不同的引物可能針對不同的isoform進(jìn)行擴(kuò)增引物設(shè)計常用資源引物設(shè)計常用資源Primer Premier 5Oligo 6BeacondesignerPrimer Express Software（AB corporation）普通引物設(shè)計及分析網(wǎng)上real-time引物庫Primer bank/primerbank/real-time 引物設(shè)計專用普通PCR反轉(zhuǎn)錄PCR（rt-PCR） 巢式PCR反向PCR不對稱PCR實時PCR（real-tim

7、e PCR，RT-PCR）http:/ 鼠白血病病毒來源的M-MLV rt-PCR有一步法和兩步法兩種。rt-PCR18一步法：逆轉(zhuǎn)錄和特異性擴(kuò)增在一管內(nèi)完成，需用基因特異性引物兩步法：先逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA ，再分別進(jìn)行擴(kuò)增，需用Oligo dT 或隨機(jī)引物 兩者區(qū)別：一步法簡單，減少污染的幾率，可適用于大量樣品和定量分析，但一次只能分析一個基因，cDNA 不能重復(fù)利用；兩步法比較靈活，一次逆轉(zhuǎn)錄可以檢測多個基因，方便進(jìn)行比較，推薦使用兩步法一步法和兩步法一步法和兩步法逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄模板：提取的RNA底物：dNTP 引物：Oligo dT適用于真核生物的mRNA 逆轉(zhuǎn)錄，對RNA樣品質(zhì)量要求高，

8、甚至可以得到全長cDNA 。隨機(jī)引物適用于長的、低豐度的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA。適用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。主要用于單一模板的RT-PCR反應(yīng)。 特異性引物與模板序列互補(bǔ)的引物，適用于目的序列已知的情況 。20總總 RNA 提取步驟（以細(xì)胞為例）提取步驟（以細(xì)胞為例）1、將細(xì)胞（六孔板、6cm培養(yǎng)皿）用冷PBS洗一遍，棄去PBS2 、向培養(yǎng)皿中加1ml Trizol，反復(fù)吹打，并轉(zhuǎn)移至1.5ml RNAse free的EP管中，室溫放置5min，使細(xì)胞完全裂解3 、加入200ul 氯仿，劇烈搖晃15s，12000rpm離心15min，44、轉(zhuǎn)移上清500ul至

9、一個新的1.5ml RNAse free EP管中5、加入500ul 異丙醇異丙醇，充分混合，室溫放置10min，12000rpm離心10min，4 6、棄去上清液，此時可見白色、棄去上清液，此時可見白色RNA沉淀沉淀7、加入、加入1ml 75%乙醇乙醇，輕輕洗沉淀，輕輕洗沉淀，12000rpm離心離心5min，4 8、小心棄去液體，開蓋放置、小心棄去液體，開蓋放置EP管，等待沉淀完全干管，等待沉淀完全干燥燥9、加入、加入30100ul RNAse free H2O，溶解，溶解RNA10 、將、將EP管放置管放置60 加熱器中加熱器中10min，助溶，助溶RNA11 、定量定量12、 -80

10、保存保存RNA質(zhì)量的鑒定質(zhì)量的鑒定分光光度法 ：OD260/2801.92.1 : RNA 純度好小于1.8 ： 有蛋白或酚污染大于2.2 ： RNA降解用TE（Tris-HCl-EDTA) 洗脫，OD260/280會偏大 （2.02.3）瓊脂糖電泳法 ：28S亮度約 為18S的兩倍28S18SFrom internet24RNA提取的注意事項提取的注意事項I.新鮮組織、細(xì)胞新鮮組織、細(xì)胞II. 低溫操作（如液氮研磨，冰上處理）低溫操作（如液氮研磨，冰上處理）III. 低溫保存（低溫保存（-80），勿反復(fù)凍融），勿反復(fù)凍融IV. 所有儀器、試劑均要進(jìn)行無所有儀器、試劑均要進(jìn)行無RNAse處理，

11、處理，尤其是水尤其是水V. 操作人員戴帽子、口罩，勤換手套操作人員戴帽子、口罩，勤換手套VI. 使用使用RNAse 抑制劑抑制劑RT-PCRReal-time PCR，是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實時監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進(jìn)行分析，計算待測樣品的初始模板量。使用儀器：熒光實時定量PCR儀，是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀,通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件普通PCR ：終點(diǎn)定量，結(jié)果不穩(wěn)定，反應(yīng)環(huán)境、循環(huán)次數(shù)對結(jié)果影響較大，不能定量起始DNA模板數(shù)量。Real-time PCR ： 靈敏度高（SYBR green 法）/特異性高

12、（分子信標(biāo)、Taqman法），線性關(guān)系好，高通量，可定量起始DNA模板數(shù)量。普通PCR與real-time PCR的比較 內(nèi)摻式染料SYBR Green I 序列特異性探針Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特異性探針 Amplifluor (Intergen)熒光定量PCR標(biāo)記方法5353SGExcitationSGSGSGSGEmission 5353SGSGSGSGSGExcitationEmission 30Taqman 法法 ：以Taqman探針為基礎(chǔ)，Taqman探針是兩端分別標(biāo)有熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸，探針完整時

13、，兩基團(tuán)靠近，不能檢測到熒光信號，當(dāng)特異性擴(kuò)增時，Taq酶的5-3外切酶活性使探針降解，兩基團(tuán)分開，此時可檢測到熒光并實現(xiàn)熒光的積累。From AB corporation在普通引物設(shè)計的基礎(chǔ)上，還要注意I.引物要短，1525為好II.引物內(nèi)部不能有二級結(jié)構(gòu)，引物之間不能形成二聚體III. 產(chǎn)物片段不能太長，以100250為好IV. Tm值在60 左右為好V.產(chǎn)物必須是單一的real-time PCR引物設(shè)計原則：引物設(shè)計原則：real-time PCR探針設(shè)計原則：探針設(shè)計原則：I.探針序列要保守，與靶DNA要完全互補(bǔ)，無非特異結(jié)合II.同時考慮在兩條鏈上設(shè)計探針I(yè)II. 探針位置盡可能靠近

14、上游引物IV. 長度通常2030bp，Tm 6570 ，GC含量4070%，C比G明顯多V.探針5端避免使用G，以免淬滅探針Real-time PCR 檢測實例檢測實例（以SYBR green 法為例）SYBR green 法既可以絕對定量又可以相對定量絕對定量： 未知樣本DNA拷貝數(shù)通過從已知量的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線中直接推算出相對定量： 不需知道樣本DNA拷貝數(shù)，通過與同一樣本中內(nèi)參的比較得出樣本DNA的相對豐度，用于樣品之間比較Xn = X0 (1+Ex)n = M實際PCR擴(kuò)增產(chǎn)物增加的數(shù)學(xué)模型：n: 循環(huán)數(shù) X0 : 初始模板量EX :擴(kuò)增效率 （ Ex = 0 1 )Xn :

15、n次循環(huán)后終產(chǎn)物的量 Real-time PCR 可用于定量檢測的可用于定量檢測的數(shù)學(xué)原理數(shù)學(xué)原理理想PCR擴(kuò)增產(chǎn)物增加的數(shù)學(xué)模型：Xn = X0 2nPCR擴(kuò)增效率小于 1 的原因I.反應(yīng)體系有限反應(yīng)體系有限II. 終產(chǎn)物增加對反應(yīng)的抑制終產(chǎn)物增加對反應(yīng)的抑制III. 酶活性下降酶活性下降IV. 酶酶-模板復(fù)合物飽和模板復(fù)合物飽和V. 引物消耗引物消耗VI. 離子濃度變化離子濃度變化XCt = X0 (1+Ex)Ct = M取對數(shù)log XCt = log X0 (1+Ex)Ct = log Mlog XCt = log X0+log(1+Ex)Ct = log Mlog X0 = -Ct

16、log (1+Ex) + log MCt : 反應(yīng)產(chǎn)物的量達(dá)到閾值時的循環(huán)數(shù)反應(yīng)產(chǎn)物的量達(dá)到閾值時的循環(huán)數(shù) 0log X0Ct Real-time PCR 可用于定量檢測的可用于定量檢測的數(shù)學(xué)原理數(shù)學(xué)原理36閾值閾值 ： real-time PCR中預(yù)先設(shè)定的熒光信號強(qiáng)度，當(dāng)反應(yīng)中熒光信號達(dá)到閾值后，收集到的信號才被認(rèn)為是有效信號閾值閾值閾值閾值可由機(jī)器自動設(shè)置，也可手動設(shè)置，機(jī)器默認(rèn)315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍作為閾值相對定量很多時候我們不需要知道樣品的絕對量，只需要知道樣品比對照組是增多（減少）多少倍，因此不需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，把樣本直接和對照組來比較得出相對值。相對定量的方法：同

17、一樣本要做內(nèi)參的檢測，內(nèi)參常選用管家基因，如GAPDH。內(nèi)參的特點(diǎn)是在所檢測的所有樣品中有恒定高量的表達(dá)。內(nèi)參的高低可以反應(yīng)樣本量的多少。不論是絕對定量還是相對定量都需要做4個復(fù)孔。 由SYBR GREEN 染料的特點(diǎn)我們可以知道，PCR的產(chǎn)物必須單一，引物必須沒有二聚體形成，否則PCR雜帶和二聚體形成的雙鏈也會被誤收集而干擾結(jié)果。 所以，引物設(shè)計很關(guān)鍵。如何在軟件上判斷引物是不是良好，需要觀察溶解曲線。好的溶解曲線是一條單一的峰。39在 AB 7300 real-time PCR儀上創(chuàng)建反應(yīng)文件 From AB corporation40創(chuàng)建絕對定量反應(yīng)板（相對定量也用這個程序）41選擇熒光SYBR和參比熒光ROX42選擇要進(jìn)行反應(yīng)的孔，單擊SYBR前的復(fù)選框43給反應(yīng)孔命名44切換到instrument選項卡，設(shè)置反應(yīng)條件，反應(yīng)體系反應(yīng)體系并添加融解曲線45在File菜單中選Save As，保存反應(yīng)板文件4