動(dòng)物繁殖學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、1動(dòng)物繁殖學(xué)實(shí)動(dòng)物繁殖學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn) 2實(shí)習(xí)目的 動(dòng)物繁殖學(xué)實(shí)驗(yàn)是動(dòng)物繁殖學(xué)實(shí)踐教學(xué)的重要組成部分； 為畢業(yè)后從事動(dòng)物生產(chǎn)科學(xué)研究和應(yīng)用、生產(chǎn)服務(wù)管理打下基礎(chǔ)。 3實(shí)習(xí)要求 主要學(xué)習(xí)掌握精液品質(zhì)分析、人工授精、發(fā)情鑒定、直腸檢查等繁殖基本技術(shù)； 掌握動(dòng)物超數(shù)排卵、胚胎采集、胚胎移植等技術(shù)的基本方法。4實(shí)習(xí)內(nèi)容 1、生殖器官標(biāo)本觀察； 2、人工授精器械、胚胎移植器械的識(shí)別和使用； 3、理化因素對(duì)精液品質(zhì)的影響； 4、精液冷凍、解凍與精液品質(zhì)評(píng)價(jià)； 5、直腸檢查； 6、超數(shù)排卵、胚胎采集、胚胎移植； 7、畜牧場(chǎng)畜群繁殖力調(diào)查與評(píng)價(jià)。 5實(shí)習(xí)過(guò)程安排 與理論課在同學(xué)期，集中實(shí)習(xí)，分組進(jìn)行。 根據(jù)實(shí)踐操作、

2、考勤、實(shí)習(xí)報(bào)告（實(shí)習(xí)時(shí)間、內(nèi)容、操作技術(shù)、體會(huì)等）等綜合評(píng)定成績(jī)。 6實(shí)驗(yàn)一 公、母畜生殖器官觀察 一、目的要求認(rèn)識(shí)各種公母畜生殖器官的位置、形態(tài)、大小及解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；了解生殖器官的結(jié)構(gòu)與生理功能的關(guān)系。為學(xué)習(xí)家畜繁殖學(xué)及更好地掌握和應(yīng)用繁殖技術(shù)奠定解剖學(xué)基礎(chǔ)。 7二、材料和方法（一）材料1各種公、母畜生殖器官標(biāo)本、模型及掛圖（或投影）。2大磁方盤、解剖刀、剪刀、鑷子、金屬探針、投影儀。（二）方法用投影與標(biāo)本觀察相結(jié)合；比較各種家畜生殖器官的異同。8三、內(nèi)容 （一）雄性動(dòng)物生殖器官 1、觀察各種動(dòng)物睪丸和附睪的形狀、相對(duì)位置和大體構(gòu)造。 2、副性腺：比較各種動(dòng)物副性腺的大小、形狀、位置及內(nèi)部構(gòu)

3、造。 精囊腺： 前列腺： 尿道球腺： 3、陰莖和龜頭 9 （二）雌性動(dòng)物生殖器官 雌性動(dòng)物可以觀察生殖器官的標(biāo)本、模型及掛圖，也可以采用腹腔鏡法進(jìn)行活體觀察。 1、生殖器官的組成及位置 2、卵巢 3、輸卵管 4、子宮 5、陰道 6、外生殖器官 10四、作業(yè) 1通過(guò)觀察和比較，說(shuō)明各種公、母畜生殖器官的形態(tài)、大小、相互關(guān)系和大體構(gòu)造以及在活體上的位置有何特點(diǎn)。 2繪出任一種公、母畜生殖器官的標(biāo)本圖。11實(shí)驗(yàn)二 睪丸、卵巢組織學(xué) 及精子發(fā)生、卵泡發(fā)育過(guò)程的觀察 一、目的和要求 通過(guò)家畜睪丸、卵巢組織切片觀察，了解家畜睪丸、卵巢的組織結(jié)構(gòu)及其形態(tài)。 了解精子的發(fā)生和卵子的發(fā)生、卵泡的發(fā)育過(guò)程及其形態(tài)

4、。12二、材料和方法 （一）材料、儀器 1、睪丸、卵巢組織切片；睪丸、卵巢組織學(xué)及精子發(fā)生、卵泡發(fā)育過(guò)程的幻燈片、多媒體投影儀或膠片投影儀。 2顯微鏡、幻燈機(jī)或投影儀。 （二）方法 先結(jié)合投影或掛圖進(jìn)行講解，對(duì)睪丸、卵巢組織學(xué)結(jié)構(gòu)及精子發(fā)生、卵泡發(fā)育過(guò)程有了初步的了解。然后再用顯微鏡進(jìn)行睪丸、卵巢組織切片的觀察。13三、內(nèi)容、觀察步驟 （一）公畜睪丸的組織學(xué)觀察 1低倍鏡觀察 （1）被膜 （2）睪丸縱隔和中隔 （3）睪丸小葉： 14 2高倍鏡觀察： （1）睪丸小葉的結(jié)構(gòu) （2）間質(zhì)細(xì)胞 （3）曲精細(xì)管的結(jié)構(gòu) （4）足細(xì)胞 （5）生精細(xì)胞（生殖細(xì)胞）15 3精子發(fā)生過(guò)程（spermatogene

5、sis）可分為兩個(gè)明顯的時(shí)期。 第一時(shí)期：精細(xì)胞生成：精原細(xì)胞經(jīng)一系列分裂形成精子細(xì)胞。 第二時(shí)期：精子形成（spermiogenesis）：精子細(xì)胞變形成為精子。 16（二）母畜卵巢的組織學(xué)觀察 1低倍鏡觀察 在低倍鏡下找出卵巢表面上皮和白膜，區(qū)分卵巢的皮質(zhì)部和髓質(zhì)部。 （1）表面上皮 （2）白膜 （3）皮質(zhì)部 （4）髓質(zhì)部17 2高倍鏡觀察 （1）卵泡發(fā)育的觀察 每個(gè)卵泡都由位于中央的卵母細(xì)胞和圍繞在卵母細(xì)胞周圍的卵泡細(xì)胞所組成。有的卵泡在發(fā)育過(guò)程中可能退化而形成閉鎖卵泡。卵泡可根據(jù)發(fā)育程度不同而分成下列各期。 1）原始卵泡 2）初級(jí)卵泡 3）次級(jí)卵泡 4）三級(jí)卵泡 5）成熟卵泡 6）閉鎖

6、卵泡 18 （2）黃體 是排卵后的卵泡轉(zhuǎn)變成的富于血管的內(nèi)分泌器官。 牛、羊、豬的黃體位于卵巢皮質(zhì)淺層突出于表面。 馬的黃體則完全埋藏在卵巢深部。 根據(jù)黃體發(fā)育階段而分成下列各期。 1）血體期 2）血管增生期 3）成熟期 4）白體期193輸卵管組織學(xué) 輸卵管從外向內(nèi)由漿膜、肌層和粘膜三層不同細(xì)胞層構(gòu)成。 （1）粘膜 上皮 固有膜 （2）肌層 （3）漿膜 20 4子宮組織學(xué) 內(nèi)膜 肌層 外膜21 四、作業(yè)： 1繪出并注明睪丸曲精細(xì)管及其所含細(xì)胞的構(gòu)造圖。 2繪出并注明卵巢組織結(jié)構(gòu)及卵泡發(fā)育各階段示意圖。22實(shí)驗(yàn)三 兔的超數(shù)排卵、胚胎移植 及早期胚胎觀察 一、目的和要求 通過(guò)實(shí)驗(yàn)了解促卵泡素（FS

7、H），孕馬血清促性腺激素（PMSG），人絨毛膜促性腺激素(hCG)的作用。 了解卵子的正常和異常形態(tài)結(jié)構(gòu)，認(rèn)識(shí)受精卵和未受精卵之區(qū)別。 初步掌握沖卵、檢卵技術(shù)，為掌握胚胎移植技術(shù)打下基礎(chǔ)。23二、材料和儀器設(shè)備 1動(dòng)物： 選擇健康的成年未孕母兔。 分組后，用作超排處理的供體。 另外，準(zhǔn)備兩只母兔，作胚胎移植受體。 實(shí)驗(yàn)?zāi)竿米詈糜卯a(chǎn)過(guò)仔的母兔，效果較好。 需公兔23只。 2藥品： FSH、PMSG、hCG、0.9NaCl、75酒精、碘酒、新潔而滅、沖卵液、846麻醉藥。 3器材： 玻璃注射器（20ml、10ml、1ml），兔用手術(shù)臺(tái)、創(chuàng)巾、止血紗布、藥棉、縫針、縫線、消炎粉、青霉素、鏈霉素、剪毛

8、剪、止血鉗、鑷子、手術(shù)刀、剪、塑料細(xì)管（沖卵管）、表面皿、移卵管、連續(xù)變倍實(shí)體顯微鏡。24三、供體兔超排分組及操作步驟 FSH處理組： 先用碘酒棉球消毒母兔頸部皮膚，每只頸部皮下注射FSH1015IU或0.15mg（動(dòng)物所產(chǎn)品）。連續(xù)注射6次，每次相隔1014h?？偭繛?.9mg/只。最后一次注射FSH后12h，從耳靜脈注射hCG75IU（先用酒精棉球消毒耳朵邊緣）。 隨即放置于公兔籠中，觀察是否配種。 超排處理后，母兔陰部表現(xiàn)出發(fā)情癥狀，能成功地配種。 PMSG處理組： 母兔頸部皮膚消毒同上。于頸部皮下一次注射PMSG150IU。之后4872h時(shí)，同上述方法注射同量hCG。即同公兔交配。 對(duì)

9、照組： 頸部皮下注射生理鹽水。其它處理同上。 25四、手術(shù)沖胚方法 于注射hCG并與公兔交配后24、36或48h，進(jìn)行沖胚。 1應(yīng)用乙醚、烏拉糖、846麻醉藥（耳靜脈注射0.3ml/只）等麻醉后，再按外科手術(shù)要求打開(kāi)腹腔。 2將母兔背朝下方固定于兔手術(shù)臺(tái)上。 3在兔腹部最后兩對(duì)乳頭的腹中線部剪毛，用沾滿肥皂液的紗布清洗局部，再用剃須刀片刮毛，先后用碘酒和酒精棉球由內(nèi)向外進(jìn)行消毒。然后蓋上創(chuàng)巾并固定。 4用手術(shù)刀在腹部正中線處皮膚切開(kāi)23cm長(zhǎng)的術(shù)口，再在腹壁肌白線上切一小口，用中指墊著以手術(shù)剪來(lái)擴(kuò)大剪口。 5.沖卵時(shí)，注意止血，隨時(shí)用溫生理鹽水紗布保溫術(shù)部。26 6.打開(kāi)腹腔后，沿著子宮輕輕引

10、出輸卵管及卵巢。與卵巢下脂肪組織處，用長(zhǎng)夾夾住以固定卵巢。仔細(xì)觀察卵巢的變化。記錄排卵點(diǎn)（卵巢排過(guò)卵后的小紅點(diǎn)）。 7.先在卵巢附近找到輸卵管傘，從傘部插入沖卵管并用手指或夾子固定，另一端接表面皿。另一人用10ml注射器配上9號(hào)針頭，吸一管沖卵液（也可用生理鹽水代替）。 8.從子宮向輸卵管方向，于子宮角末端和輸卵管交界的無(wú)血管處插入針頭，使針頭伸入輸卵管內(nèi)并用手指固定。然后慢慢的推動(dòng)注射器，將沖卵液注入輸卵管，使沖卵液由傘部收集到表面皿內(nèi)。一般每次5ml即可。注意沖卵液不得流失。 27五、胚胎觀察 將接有沖卵液的表面皿置于實(shí)體顯微鏡下，檢查胚胎的數(shù)量和發(fā)育形態(tài)。 正常兔受精卵為卵圓形，直徑約1

11、40m，在透明帶外圍有一厚層粘蛋白層（為兔胚胎特有結(jié)構(gòu)）。卵黃顆粒很細(xì)，分布很均勻。容易看到核的變化。在卵黃周隙內(nèi)可見(jiàn)兩個(gè)極體。 未受精的卵母細(xì)胞中，粗細(xì)不一的卵黃顆粒清楚可見(jiàn)，且分布不均。不能看到細(xì)胞核。在卵黃周隙內(nèi)只有一個(gè)極體。 一般在交配后24h，受精卵已發(fā)育成2-細(xì)胞胚胎。48h即發(fā)育成16-細(xì)胞胚胎（早期桑椹胚）。28六、胚胎移植 1受體的選擇： 選擇與供體發(fā)情時(shí)間一致（相差不超過(guò)一天）的受體（自然發(fā)情或超排處理誘發(fā)發(fā)情）。 2麻醉、保定及開(kāi)腹手術(shù)： 參照供體處理方法。 3胚胎分裝： 先向移卵管內(nèi)吸進(jìn)少量PBS，接著吸入一點(diǎn)空氣，然后再將胚胎連同少量PBS吸入，接著再吸入一點(diǎn)空氣和P

12、BS, 在移卵管尖端需保留一端空隙。這樣就可防止胚胎丟失。 4移植部位： 將胚胎移入排卵側(cè)的生長(zhǎng)道內(nèi)。凡從供體輸卵管內(nèi)得到的胚胎應(yīng)移植到受體輸卵管內(nèi)。從輸卵管傘部插入23cm深，輕輕地注入胚胎，然后慢慢地抽出移卵管。一般一側(cè)輸卵管可移植510枚胚胎。如從供體子宮內(nèi)收集的胚胎也應(yīng)移植到受體母兔相應(yīng)的部位。 5按外科手術(shù)要求分別縫合肌層和皮膚。并進(jìn)行消毒。注意術(shù)后護(hù)理。29七、作業(yè) 簡(jiǎn)述實(shí)驗(yàn)過(guò)程和結(jié)果，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。30實(shí)驗(yàn)四 小鼠超數(shù)排卵及早期胚胎的質(zhì)量鑒定 一、目的和要求 通過(guò)實(shí)驗(yàn)及操作，使學(xué)生了解孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）對(duì)卵巢機(jī)能的生理作用，掌握超數(shù)排

13、卵方法和早期胚胎的質(zhì)量鑒定。 充分認(rèn)識(shí)正常與異常胚胎的形態(tài)結(jié)構(gòu)及等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，為大家畜超數(shù)排卵和胚胎移植打下良好的基礎(chǔ)。31二、材料 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 56周齡昆明白系雌性小鼠為超數(shù)排卵的供體，成年同系公鼠與之1:1配比。 2藥物與試劑： PMSG、hCG、75酒精、沖胚液（mPBS）、礦物油。 3器材： 一次性1ml注射器、鑷子、剪刀、表面皿、巴氏吸管、直徑35mm培養(yǎng)皿、實(shí)體顯微鏡等。32三、超數(shù)排卵方法及胚胎采集 取56周齡昆明白系雌性小鼠，間隔48h分別腹腔注射10IU PMSG和hCG，hCG注射后與性成熟公鼠合籠，次日檢查陰道栓。 有栓雌鼠在注射hCG后7884h處死、摘取子宮。 在實(shí)

14、體顯微鏡下，用含有mPBS液的1ml注射器將子宮置于表面皿中沖洗3遍，以回收桑椹胚及早期囊胚。 操作液和胚胎置于37恒溫臺(tái)上保存。33四、胚胎質(zhì)量鑒定 將回收的胚胎用mPBS洗凈后，移入新鮮的覆蓋有礦物油的100l mPBS液滴中，在410倍以上實(shí)體顯微鏡下進(jìn)行胚胎質(zhì)量鑒定。 （一）胚胎的級(jí)別劃分 目前對(duì)胚胎的質(zhì)量鑒定基本上采用形態(tài)學(xué)的方法 將胚胎分為A級(jí)（1級(jí)）、B級(jí)（2級(jí)）、C級(jí)（3級(jí)）和D級(jí)（4級(jí)）四個(gè)級(jí)別。 其中A級(jí)和B級(jí)胚胎為可移植胚胎。34 （二）異常胚胎 異常胚胎指胚胎體積過(guò)小、過(guò)大、呈橢圓形、扁形、帶有大型極體，細(xì)胞內(nèi)有大空泡，透明帶破裂、收縮，卵裂球色澤發(fā)暗、界限不清、個(gè)別萎

15、縮、邊緣變得粗糙，空透明帶，在透明帶內(nèi)無(wú)一定結(jié)構(gòu)的變性胚胎等。 35 （三）未受精卵 呈圓球形，外周有一圈折光性強(qiáng)且發(fā)亮的透明帶，中央為質(zhì)地均勻色澤較暗的細(xì)胞質(zhì)，透明帶和卵黃膜之間的空隙很小甚至看不到。36五、作業(yè) 將觀察到的不同發(fā)育階段的正常胚胎、異常胚胎或未受精卵繪圖并加以說(shuō)明。37實(shí)驗(yàn)五 人工授精器材的認(rèn)識(shí)和假陰道的安裝 一、目的和要求 1熟悉人工授精所用的采精和輸精器材,了解其用途及使用方法。 2練習(xí)假陰道的安裝方法。38二、材料和儀器設(shè)備 1采精器材： 各種公畜采精用假陰道，牛、羊電刺激采精棒，豬手握法采精用的橡膠手套等。 2輸精器材： 各種母畜輸精器、陰道開(kāi)張器、額燈和手電筒。 3

16、輔助器材及藥品： 高壓滅菌器、酒精燈、長(zhǎng)柄鉗、鑷子、玻璃棒、棒狀溫度計(jì)、漏斗、量杯、滅菌凡士林、70和95酒精棉球、滑石粉、來(lái)蘇兒、洗衣粉等。39三、方法和步驟 先講解人工授精器材的構(gòu)造、各部名稱和用途，并作假陰道安裝的示范。然后學(xué)生分組觀察并作假陰道的安裝練習(xí)。 （一）人工授精器材的認(rèn)識(shí)： 1假陰道： 長(zhǎng)筒狀，由外殼、內(nèi)胎和集精杯（管）三個(gè)主要部分組成。 外殼 內(nèi)胎 集精杯（管） 2輸精器： 蘇式牛、羊輸精器為一長(zhǎng)頸玻璃注射器。 目前常用的為金屬或塑料制成的輸精管，其后連接一個(gè)橡皮球。冷凍細(xì)管精液輸精則使用特制的卡蘇槍或輸精器。 對(duì)一些家畜的輸精需借助陰道開(kāi)張器和額燈或手電筒照明進(jìn)行。開(kāi)張器

17、的種類和大小因畜種而異。40（二）假陰道的準(zhǔn)備要點(diǎn) 1假陰道外殼及內(nèi)胎的檢查 2采精器材的清洗 3內(nèi)胎的安裝： 4消毒 5集精杯（管）的的安裝 6注水： 7涂潤(rùn)滑劑： 8調(diào)節(jié)假陰道內(nèi)腔的壓力： 9假陰道內(nèi)腔溫度的測(cè)量： 10用一塊褶成四折的消毒紗布蓋住假陰道入口，以防灰塵落入，即可準(zhǔn)備采精。41 (三) 輸精器材的準(zhǔn)備 金屬和玻璃制成的輸精管、輸精槍，最好用高壓蒸汽消毒，在輸精前最好將輸精管用稀釋液沖洗12次。 細(xì)管冷凍精液的輸精器一般由金屬外殼和里面的推桿組成。使用前金屬外套應(yīng)進(jìn)行消毒，前端的金屬套不能連續(xù)使用。使用時(shí)將細(xì)管的一端剪去，另一端插在輸精槍的推桿上。借助推桿，推動(dòng)細(xì)管中的活塞即可

18、將精液推出。 若采用開(kāi)張器法輸精，需對(duì)開(kāi)張器先進(jìn)行嚴(yán)格消毒方可使用。 42四、作業(yè) 指出各種公畜采精器材的異同及優(yōu)缺點(diǎn)，試提出改進(jìn)意見(jiàn)。43實(shí)驗(yàn)六 精液品質(zhì)的肉眼檢查及精子活率評(píng)定 一、目的和要求 掌握檢查精子密度、評(píng)定活率的方法； 熟悉肉眼檢查精液品質(zhì)的方法； 驗(yàn)證觀察理化因素對(duì)精子運(yùn)動(dòng)及生存能力的影響。 44二、材料和儀器 1精液： 牛、豬或兔等任一種動(dòng)物的精液。 2藥品器械： 顯微鏡、顯微鏡保溫箱（或顯微鏡恒溫臺(tái)）、載玻片、蓋玻片、搪瓷盤、溫度計(jì)、滴管、擦鏡紙、紗布、試管、3%和0.9%氯化鈉溶液、2%煤酚皂溶液、1/1000新潔而滅溶液、76%酒精、5%伊紅、1%苯胺黑。 3精子密度的

19、投影圖表 45三、內(nèi)容和方法 （一）精液的肉眼觀察 觀察測(cè)定下列各項(xiàng)結(jié)果并記入登記表內(nèi)。 1射精量 2色澤、氣味 3云霧狀的觀察46 （二）精子密度的檢查（顯微鏡觀測(cè)法）及活率評(píng)分 1檢查精子的密度 密在整個(gè)視野中精子的密度很大，彼此之間空隙很小，看不清各個(gè)精子個(gè)體運(yùn)動(dòng)的情況。每毫升精液含精子數(shù)約在10億個(gè)以上。登記時(shí)以“密”字。 中精子之間空隙明顯，精子彼此之間的距離約有一個(gè)精子的長(zhǎng)度，有些精子的活動(dòng)情況清楚可見(jiàn)。這種精液的密度評(píng)為“中”，每毫升所含精子數(shù)約210億個(gè)之間。登記時(shí)以“中”字。 稀視野中精子稀疏、分散，精子之間的空隙超過(guò)一個(gè)精子的長(zhǎng)度。這種精液每毫升所含精子數(shù)在2億以下。登記時(shí)

20、以“稀”字。47 2評(píng)定精子的活率 必須于采精后立刻在25左右的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，最好在37保溫箱內(nèi)或加熱的載物臺(tái)上進(jìn)行。在評(píng)定精子活率的同時(shí)也可以測(cè)定精子的密度。 用玻璃棒蘸取一滴原精液或經(jīng)稀釋的精液（馬、豬精液的精子密度低，不須稀釋；而牛、羊精液的密度大，須用0.9%氯化鈉溶液稀釋，其溫度須與精液密度相近），滴在潔凈的載玻片上，蓋上潔凈的蓋玻片，其間充滿精液，不存留氣泡。也可滴在蓋玻片上翻放于凹玻片的凹窩上。置于顯微鏡下，放大250400倍檢查。注意顯微鏡的載物臺(tái)須放平，最好是在暗視野中觀察。48 （三）死活精子百分率測(cè)定： （1）將5%的伊紅和1%的苯胺黑按1:1混勻，分裝于12ml容量的試

21、管中（加入試管容量的1/2），并在37水浴中加溫，隨后加入原精液13滴，搖勻后再放回水浴中，3min后立即取出待用。 （2）從以上混合液中用火柴棍沾上一小滴于載玻片的一端，用另一載玻片進(jìn)行推動(dòng)制成抹片，待干燥后，高倍鏡鏡檢（500600倍）。抹片時(shí)，最好在3540的條件下制作，而且制作過(guò)程要快。 49實(shí)驗(yàn)七 精子密度計(jì)數(shù)檢查及精子生理特性的測(cè)定 一、目的和要求 由于目測(cè)法不夠準(zhǔn)確，所以采用精子計(jì)數(shù)的方法測(cè)定1ml精液內(nèi)的精子數(shù)。 要求要熟練掌握此法，它是目前許多簡(jiǎn)單而實(shí)用方法的基礎(chǔ)。 50二、精子呼吸強(qiáng)度的測(cè)定 （一）材料和設(shè)備 1新鮮的?；蜓蚓海ㄆ渌倚笠部桑?2器材：毛細(xì)玻璃管、載玻片

22、、小燒杯、水浴鍋、試管、試管架、滴管。 3試劑：美蘭溶液：取美蘭100mg，溶解于100ml的1%NaCl溶液中，然后置于容量瓶?jī)?nèi)保存三天，再用1%NaCl溶液稀釋10倍。 （二）方法和步驟 取美蘭溶液與精液各一滴于載玻片上。混勻后，吸入到兩段毛細(xì)管中約23cm，一段置于3740條件下，另一段置于10條件下，比較和觀察美蘭退色所需要的時(shí)間。 51三、精子密度的計(jì)數(shù)檢查 （一）器材 普通顯微鏡、血球計(jì)數(shù)器、紗布、95%酒精、乙醚、3%NaCl、保溫瓶、溫度計(jì)、藥棉、試管、滴管等。 52（二）器材介紹 1介紹血球計(jì)數(shù)室的構(gòu)造（用多媒體或投影儀）。 2介紹血球吸管的構(gòu)造及各種家畜應(yīng)該使用何種血球吸管

23、（紅血球吸管或白血球吸管）。 （1）牛、羊、雞的精液（密度高）用紅血球吸管：若將精液吸至“0.5”刻度處，然后再吸3% NaCl至“101”刻度，為稀釋200倍。如將精液吸至“1.0”刻度處，再吸3%NaCl至“101”刻度，則為稀釋100倍。 2）豬、馬、兔的精液（密度低）用白血球吸管：若將精液吸至“0.5”刻度處，然后再吸3%NaCl至“11”刻度，為稀釋20倍。如將精液吸至“1.0”刻度處，再吸3%NaCl至“11”刻度，則為稀釋10倍。53（三）方法和步驟 1將計(jì)數(shù)室推上蓋玻片。 2將蓋好蓋玻片的計(jì)數(shù)板置于低倍鏡下觀察，首先要求找到清晰的計(jì)數(shù)室。 3用血球吸管吸精液，用藥棉擦去吸管尖端

24、外圍附著的精液，并用3%NaCl稀釋，因不同的家畜用不同的吸管稀釋。 4吸管吸好精液和3%NaCl以后，用拇指及食指堵住吸管兩端進(jìn)行來(lái)回的充分搖動(dòng)，混勻。然后棄去吸管中的前兩滴，再將吸管尖端置于血球計(jì)數(shù)室和蓋玻片交界處的邊緣上，吸管內(nèi)的精液自動(dòng)滲入計(jì)數(shù)室內(nèi)，使之自然、均勻地分充滿計(jì)數(shù)室。注意不要使精液溢出蓋玻片，也不可因精液不足而使計(jì)數(shù)室內(nèi)有氣泡或干燥處，否則，應(yīng)重新操作。靜放2分鐘，開(kāi)始計(jì)數(shù)。 5鏡檢和計(jì)數(shù)：移到高倍鏡下檢查。 首先數(shù)出四角和正中間的五個(gè)方格中的精子數(shù)，也就是80個(gè)小方格中的精子數(shù)。載物臺(tái)要平置，不能斜放。光線不必過(guò)強(qiáng)。 54 （四）注意事項(xiàng)： 1若精子壓計(jì)數(shù)室的線，則以精子

25、頭為準(zhǔn)，按照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則計(jì)數(shù)。 2為了減少誤差，應(yīng)對(duì)同一樣品做23次重復(fù)，求其平均值。如果計(jì)數(shù)的結(jié)果相差較大，則應(yīng)進(jìn)行再次檢查。55四、作業(yè) 寫出實(shí)驗(yàn)過(guò)程及其精子計(jì)數(shù)結(jié)果。56實(shí)驗(yàn)八 精子形態(tài)和畸形率的測(cè)定 一、目的和要求 由于所需時(shí)間等原因，無(wú)需對(duì)每次采精進(jìn)行精子畸形率的測(cè)定。但應(yīng)當(dāng)每月對(duì)每一頭種公畜進(jìn)行一次畸形率的測(cè)定，以繪出精子畸形率變化圖。 畸形率突然增高，表明存在問(wèn)題，應(yīng)當(dāng)查找和分析原因?；温试?5以內(nèi)，受精力一般不受影響?；尉右话悴槐憩F(xiàn)前進(jìn)運(yùn)動(dòng)，因而隨著畸形精子數(shù)增多，精子活率下降。如在檢查精子運(yùn)動(dòng)力時(shí)，可觀察到許多畸形精子，也需要進(jìn)一步作形態(tài)學(xué)檢查。 通

26、過(guò)本實(shí)驗(yàn)，了解家畜精液中精子形態(tài)與精液品質(zhì)的關(guān)系，掌握精子形態(tài)的分類和分析方法。57二、材料和儀器設(shè)備 精液、染色液、高倍顯微鏡、相差顯微鏡等。58三、方法和步驟 （一）威廉氏染色法：觀察精子頭部形態(tài)的染色方法。 1染色液 復(fù)紅（又稱品紅）染色液： 復(fù)紅原液（10g復(fù)紅溶于100ml 96的酒精）10ml加5的石碳酸（苯酚）100ml。 取上述混合液50ml加飽和伊紅酒精溶液25ml放置兩周后即可使用。 美蘭（又稱甲基蘭）染色液： 美蘭溶液（10g美蘭溶于1000ml 96的酒精中）30ml加0.01KOH 100ml過(guò)濾后再加入3倍量的蒸餾水，混合后即可使用。59 2染色程序 （1）先制作精

27、液抹片，要求薄而均勻。然后風(fēng)干或用酒精燈火焰固定。 （2）浸入無(wú)水酒精中固定23min，取出風(fēng)干。 （3）浸入0.5氯胺T中12min。 （4）用清水洗12min。 （5）迅速通過(guò)96的酒精、風(fēng)干。 （6）放入石碳酸復(fù)紅染色液中1015min。清水中沾2次。 （7）迅速通過(guò)美蘭染色液。 （8）水洗后風(fēng)干60 （二）蘇木精伊紅染色： 用以觀察精液中非精子有形成分的類型和比例。細(xì)胞核染成藍(lán)色，細(xì)胞漿呈紅色。 蘇木精溶液： 2g蘇木精溶于100ml無(wú)水酒精中，加入100ml蒸餾水，100ml甘油，3g冰醋酸和10g鋁酸鉀混合，放置14天后使用，用前震蕩。 伊紅染液： 1g伊紅加入100ml 95的酒

28、精，染色時(shí)，取一定量的該液加入等量70的酒精。 61 2染色程序 （1）制備間斷式的精液抹片（即當(dāng)推制抹片時(shí)，不要一推到底，而要斷續(xù)前推，使抹片厚度有一個(gè)梯度變化，染色后易于觀察不同類型的精子成分），風(fēng)干。 （2）浸入無(wú)水酒精中固定35min，風(fēng)干。 （3）分別浸入95、75的酒精和蒸餾水中各1min。 （4）浸入蘇木精染色液中5min。 （5）浸入伊紅染色液中12min。 （6）水洗13min。 （7）通過(guò)70和無(wú)水酒精。 （8）風(fēng)干后，用二甲苯加蓋片封存。如不保存，直接觀察。 62 （三）精子尾部形態(tài)的觀察 1福爾馬林緩沖液的制備 將21.82g二水磷酸氫二鈉和22.25g磷酸二氫鉀分別溶

29、于500ml蒸餾水中，取200ml磷酸氫二鈉溶液加80ml磷酸二氫鉀溶液，配成緩沖液。取該緩沖液100ml，加入40（V/V）福爾馬林溶液62.5ml，最后加蒸餾水至500ml。 2觀察程序 （1）將福爾馬林緩沖液注入容量為1ml的小玻璃管中，然后置37恒溫箱中備用。 （2）根據(jù)原精液的濃度，向裝有福爾馬林緩沖液的小管中注入25滴精液充分混合。 （3）取一滴混合后的精液置于載波片上，加蓋片后靜止數(shù)分鐘?？稍?00倍的相差顯微鏡下觀察精子尾部的形態(tài)。隨機(jī)觀察400個(gè)精子，計(jì)算各種尾部畸形精子所占的比例。 63 （四）精子形態(tài)的分類 1頭部畸形的精子 包括：窄頭、頭基部狹窄、梨形頭、圓頭、巨頭、小

30、頭、頭基部過(guò)寬、雙頭、頂部脫落等。但以前六種居多。 2尾部畸形精子 包括：帶原生質(zhì)滴的精子（近端、遠(yuǎn)端）、無(wú)頭的尾（它和無(wú)尾的頭往往是一個(gè)精子的兩部分，在分析時(shí)一般算作尾部的畸形）、單卷尾、多重卷尾、環(huán)形卷尾、雙尾等。 3中段畸形 包括：頸部腫脹、中段纖絲裸露、中段呈螺旋狀、雙中段等。 64 （五）非精子有形成分 多為精子形成過(guò)程中的某些退化物，生殖上皮的脫落物和血細(xì)胞等。這些成分在精液中出現(xiàn)的比例和類型在一定程度上能反映睪丸和精液排出管道的生理狀態(tài)。 在精液中經(jīng)常出現(xiàn)的有：白細(xì)胞、紅細(xì)胞和鱗狀上皮細(xì)胞等。 65四、作業(yè) 繪出你所觀察到的各類畸形精子。66實(shí)驗(yàn)九 精子頂體染色觀察 一、目的和要

31、求 頂體在精子受精過(guò)程中起著重要的作用。因它能釋放蛋白質(zhì)分解酶消化卵丘細(xì)胞之間的粘合基質(zhì)，使精子能夠通過(guò)卵的被膜進(jìn)行受精。由于頂體結(jié)構(gòu)的畸形，可導(dǎo)致受精率降低或者不受精。精子老化或損傷，會(huì)引起頂體帽破壞，先是頂體嵴部分變化，最后整個(gè)頂體消失。這些變化可用電鏡觀察到。但用微分干涉差顯微鏡及相差顯微鏡也能看到。 精液冷凍解凍會(huì)損傷一些精子，重要的是要準(zhǔn)確知道受傷精子百分?jǐn)?shù)。優(yōu)質(zhì)奶牛精液冷凍前，約90精子具有完整的頂體。冷凍后下降至6065。研究表明，頂體完整率和不返情率之間比精子活率與不返情率之間相關(guān)性更強(qiáng)。因而，檢查精子頂體完整率很重要。 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，1）學(xué)習(xí)精液抹片染色技術(shù)；2）觀察正常精子頂

32、體和異常精子頂體形態(tài)，計(jì)算精子頂體完整率。 67二、材料和儀器設(shè)備 （一）二人一組，每組所需材料及器材： 燒杯2個(gè)（大小均可，用于清洗染色片用）； 玻璃滴管2支； 小磁盤、染色架各一個(gè)； 衛(wèi)生紙（墊在小磁盤內(nèi)，以免磁盤被顏色污染）； 玻璃平皿1個(gè)； 切片盒一個(gè)； 血球計(jì)數(shù)器2個(gè)； 普通光學(xué)顯微鏡1臺(tái)； 鑷子1把。 68 （二）公用器材 酒精棉球； 姬姆薩（Giemsa）原液（預(yù)先一個(gè)月前配好）； 固定液； 擦鏡紙； 精液； 蒸餾水； 玻璃移液管； 玻璃滴管2支，小鑷子2把； pH試紙； 玻璃棒2支。69（三）試液的配制 1磷酸鹽緩沖液： Na2HPO412H2O 2.2g NaH2PO42H2

33、O 0.55g 先用少量蒸餾水溶解，再用蒸餾水定容至100ml 用pH試紙測(cè) pH值，應(yīng)為7.07.2。 2福爾馬林磷酸鹽固定液： （1）Na2HPO412H2O 2.25g NaH2PO42H2O 0.55g 置于100ml容量瓶中，加入0.89NaCl溶液約30ml，使之溶解。 （2）加入甲醛MgCO3飽和液8ml 甲醛MgCO3飽和液配制方法：在500ml福爾馬林（40甲醛）中加入8g MgCO3。此飽和液必須在一周前配好。 （3）用0.89NaCl溶液少許沖洗裝過(guò)甲醛的量筒置于容量瓶中，并定容至100ml。此液配好后，第二天即可用。一般在室溫下保存。此液pH 為7.07.2。70 3G

34、iemsa原液： Giemsa原料：1g 甘油：66ml 甲醇：66ml 將Giemsa染料置于研缽中，先加入少量溫?zé)幔?0）的甘油，充分研磨至無(wú)顆粒呈漿糊狀。再將剩余甘油全部倒入，置56恒溫箱中保溫2小時(shí)。分次用甲醇清洗容器于棕色瓶中保存。保持一個(gè)月后才能使用。此原液放置時(shí)間越長(zhǎng)越好，但使用前需經(jīng)過(guò)濾。 4Giemsa染液：必須在染色前配制。 Giemsa原液:緩沖液:蒸餾水的比例為2 : 3 : 5。71三、頂體染色方法步驟 先準(zhǔn)備潔凈的載波片。用洗滌靈擦洗，清水沖洗，在用蒸餾水漂洗，以不掛水珠為凈。烘干或涼干備用。 1抹片 2風(fēng)干 3固定 4水洗 5染色 6水洗72 四、精子頂體觀察 將

35、精液染片置于顯微鏡下，先用低倍鏡找到精子，再在1000倍下進(jìn)行油鏡觀察。精子頂體呈紫色，包圍精子頭前部。 根據(jù)精子頂體完整和損傷與否，將精子頂體形態(tài)分為4種類型： 1頂體完整型 2頂體膨脹型 3頂體破損型 4頂體全脫型 73 五、作業(yè) 分析制片染色的質(zhì)量。觀察各種類型精子頂體形態(tài)。統(tǒng)計(jì)精子頂體完整率。74實(shí)驗(yàn)十 家畜精液的冷凍 一、目的和要求 通過(guò)實(shí)驗(yàn)，了解家畜精液冷凍保存的基本操作和流程，初步掌握家畜精液冷凍和解凍的基本方法。75 二、材料和儀器 牛和豬的精液樣品、液氮罐、鋁飯盒、燒杯、試管、冰箱、水浴箱、低溫溫度計(jì)、顯微鏡、蓋玻片、載玻片等。76三、內(nèi)容和方法 （一）牛精液的冷凍 1冷凍稀

36、釋液的配制 12蔗糖液 75ml 卵黃 20ml 甘油 5ml 青霉素 1000IU/ml 鏈霉素 1000IU/ml 2解凍液的配制 檸檬酸鈉 2.9g 蒸餾水 100ml 配好后過(guò)濾，煮沸消毒。77 3精液的稀釋與平衡 稀釋前先檢查精液的活率，一般不低于0.7，密度應(yīng)在8億/ml左右，用與精液同溫的稀釋液作25倍稀釋。將稀釋后的精液用棉花包裹放入冰箱內(nèi)緩慢降溫到05，并保持24h。 4滴凍和保存 用吸管吸取平衡后的精液滴于用液氮冷卻到-100左右的鋁飯盒的表面（飯盒表面距液氮面23cm），制成0.1ml劑量的冷凍顆粒。滴凍要求快速、均勻，滴凍結(jié)束應(yīng)使精液顆粒停留3min，待顆粒由黃變白，即

37、可將飯盒蓋浸入液氮。然后用青霉素瓶或紗布袋收集顆粒，作好標(biāo)記，投入液氮罐中保存。78 5解凍 在1ml容量的試管內(nèi)裝入2.9的檸檬酸鈉解凍液1ml，放入4的水浴中，隨后取12粒精液投入試管中，立即搖動(dòng)直至顆粒溶化再取出試管，取樣觀察，凡活率在0.3以上即為合格。 79（二）豬精液的冷凍 1、冷凍稀釋液和解凍稀釋液的配制80 1、冷凍稀釋液 12%蔗糖溶液 75ml 氨基乙酸 0.5g 檸檬酸鈉 0.5g Tris 0.2g 卵黃 20ml 雙重蒸餾水加至100ml 甘油最終濃度1% 青、鏈霉素500-1000g/ml。 配制12%蔗糖溶液，并加入氨基乙酸，檸檬酸鈉和Tris后過(guò)濾煮沸15分鐘消

38、毒。 待涼后按比例加入卵黃、甘油、青、鏈霉素，充分?jǐn)嚢杈鶆?。配方?1 2、解凍液： 葡萄糖 5g 雙蒸水 100ml 檸檬酸鈉 0.5g 10%安鈉加 5ml 配好后過(guò)濾煮沸消毒。82配方二 1冷凍稀釋液 8的葡萄糖 77ml 卵黃 20ml 甘油 3ml 青霉素 5001000IU/ml 2.解凍液 5的葡萄糖溶液 83 2、精液的稀釋與平衡 用手握法采精獲得的濃份精液，活率應(yīng)在0.7以上。 用同溫的稀釋液作1:2稀釋。 隨后用棉花和紗布包裹，放于8的冰箱內(nèi)，緩慢降溫到8并保持36h。84 3滴凍和解凍 在滴凍前，自冰箱內(nèi)取出的經(jīng)平衡的精液，檢查活率不應(yīng)低于0.6。 用吸管吸取平衡后的精液

39、，迅速滴于經(jīng)液氮冷卻的鋁飯盒上，制成0.10.2ml的冷凍顆粒，停留3min后浸入液氮。 取裝有5葡萄糖解凍液的小試管一支，在40的水浴中遇熱，投入顆粒冷凍精液一粒，經(jīng)搖動(dòng)直至顆粒溶化，立即取出檢查精子活率。 凡在0.3以上者即為合格，可用于輸精。85 四、作業(yè) 寫出牛、豬精液冷凍的基本程序，并比較其異同。86實(shí)驗(yàn)十一、畜牧場(chǎng)畜群繁殖力調(diào)查與評(píng)價(jià) 1.牛場(chǎng)牛群繁殖資料 2.豬場(chǎng)豬群繁殖資料 3.雞場(chǎng)雞群結(jié)構(gòu)與繁殖狀況 4.試述牛精液冷凍的程序和方法 5.試述牛精液常溫保存和低溫保存的技術(shù)和方法871.1.牛場(chǎng)牛群繁殖資料 某奶牛場(chǎng)，飼養(yǎng)2頭種公牛，30頭1歲左右的未參加配種的青年母牛。 在本年

40、度內(nèi)，有100頭母牛參加配種，其中99頭發(fā)情參與配種，第一情期配種妊娠的母牛有45頭，第二情期配種妊娠的母牛有25頭，第三情期配種妊娠的母牛有15頭。本年度共生牛犢75頭，其中死胎5頭，活牛犢70頭，斷奶時(shí)，共有65頭活牛犢。 計(jì)算該場(chǎng)本年度內(nèi)發(fā)情率、受配率、受胎率，第一情期受胎率、第二情期受胎率、第三情期受胎率、配種指數(shù)、繁殖率、繁殖成活率、成活率。 882.2.豬場(chǎng)豬群繁殖資料 某種豬場(chǎng)，飼養(yǎng)有2頭種公豬，30頭0.5歲左右的未參加配種的青年母豬。 本年度內(nèi)，有100頭母豬參加配種，其中99頭發(fā)情參與配種，第一情期配種妊娠的母豬有45頭，第二情期配種妊娠的母豬有25頭，第三情期配種妊娠的母

41、豬有15頭。 本年度共生仔豬250窩，生仔豬2850頭，其中死胎100頭，活仔豬2750頭，斷奶時(shí)，共有2700頭活仔豬。 計(jì)算該場(chǎng)本年度內(nèi)發(fā)情率、受配率、受胎率，第一情期受胎率、第二情期受胎率、第三情期受胎率、配種指數(shù)、繁殖率、繁殖成活率、成活率、平均窩產(chǎn)仔豬數(shù)、平均窩產(chǎn)活仔豬數(shù)。893.3.雞場(chǎng)雞群結(jié)構(gòu)與繁殖狀況 某種雞場(chǎng)，飼養(yǎng)100只種母雞。 在本年度內(nèi)，共產(chǎn)種蛋2500枚。經(jīng)照蛋后，其中受精蛋有2450枚。將全部受精蛋進(jìn)行孵化，出雛2400只，所孵化雞苗全部用于育雛。至140日齡，有2000只雞成活。 計(jì)算該場(chǎng)雞平均年產(chǎn)蛋量、種蛋受精率、受精蛋孵化率、入孵蛋孵化率、雛雞育成率。90 4.試述牛精液冷凍的程序和方法。 5.試述牛精液常溫保存和低溫保存的技術(shù)和方法。91實(shí)習(xí)要求 主要學(xué)習(xí)掌握精液品質(zhì)分析、人工授精、發(fā)情鑒定、直腸檢