_發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基及原料處理

1、第四章 發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基 及原料處理發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基是工業(yè)發(fā)酵微生物生長(zhǎng)和分泌發(fā)酵產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)、原料處理和配制是發(fā)酵工程的重要操作單元之一。本章主要內(nèi)容第一節(jié) 發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的組成第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵中營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的種類第三節(jié) 培養(yǎng)基確實(shí)定和優(yōu)化第四節(jié) 原料的選擇及工業(yè)發(fā)酵中 重要營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的配制方法本章主要內(nèi)容第一節(jié) 發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的組成第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵中營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的種類第三節(jié) 培養(yǎng)基確實(shí)定和優(yōu)化第四節(jié) 原料的選擇及工業(yè)發(fā)酵中 重要營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的配制方法第一節(jié) 發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的選擇 培養(yǎng)基是指利用人工方法配制的供微生物、植物和動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。主要用于微生物

2、等的別離、培養(yǎng)、鑒定以及菌種保藏等方面。工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基除了包含微生物生長(zhǎng)繁殖所必須的碳源、氮源、能源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子和水等營(yíng)養(yǎng)成分，有的還含有某些前體、產(chǎn)物促進(jìn)劑和抑制劑等。一、能源 功能：微生物生長(zhǎng)、繁殖、合成、分解、運(yùn)動(dòng)、熱的產(chǎn)生等，即微生物的一切行為都需要消耗能源。光能-光能自養(yǎng)菌的能源。如：小球藻、螺旋藻利用光能生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白；嗜鹽藻利用光能生產(chǎn)甘油、-胡羅卜素和單細(xì)胞蛋白等。氫、硫、氨、亞硝酸鹽、亞鐵鹽-化能自養(yǎng)微生物的能源。如：細(xì)菌煉銅所使用的氧化亞鐵硫桿菌，將亞鐵鹽作為能源。碳水化合物等有機(jī)物，石油天然氣和石油化工產(chǎn)品-異養(yǎng)微生物能源，同時(shí)也是碳源物質(zhì)。New Biofuel

3、technology using sunlight and micro-organisms could change the industry 二、碳源 功能：碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分之一，因?yàn)樘荚次镔|(zhì)在微生物細(xì)胞中的含量很高。占細(xì)胞干物質(zhì)50%。 碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量 、組成菌體細(xì)胞成分的碳架、構(gòu)成代謝產(chǎn)物。 常用的碳源物質(zhì)包括糖類、脂類、有機(jī)酸、低碳醇。 葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、糊精、淀粉等糖類物質(zhì)，是細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母利用的碳源。其中，葡萄糖是碳源中最容易利用的單糖，幾乎所有微生物都能利用葡萄糖。葡糖效應(yīng)和中期溶氧缺乏其他糖類：蔗糖、麥芽糖、乳糖等雙糖也是常用的碳源。多

4、糖如淀粉和纖維素。淀粉還可以克服葡萄糖代謝過(guò)快的弊病，并且價(jià)格低廉，來(lái)源豐富。蔗糖、麥芽糖、乳糖等雙糖常用于抗生素、氨基酸、酶類的發(fā)酵。酯類：如植物油，動(dòng)物油等脂類，具備較活潑的脂肪酶的微生物可利用脂類為碳源，但是耗氧量會(huì)增加，因此要提供更多的氧。有機(jī)酸：有機(jī)酸或他們的鹽類或醇類能做為碳源。pH會(huì)有變化。烴類：碳酸氣、石油、正構(gòu)石蠟、天然氣、甲醇、乙醇等石油化工產(chǎn)品，也是許多微生物碳源。如：嗜甲烷棒狀桿菌利用甲醇為碳源產(chǎn)生單細(xì)胞蛋白；乳糖發(fā)酵短桿菌，以乙醇為碳源生產(chǎn)谷氨酸。糖蜜淀粉三、氮源 功能：氮源物質(zhì)構(gòu)成菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸；為微生物提供能源；合成含氮的代謝產(chǎn)物。 常用的氮

5、源分為兩類：無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源。1. 無(wú)機(jī)氮源主要包括氨水、銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽等。其被利用速度及吸收速度均快于有機(jī)氮源，也被稱為速效氮源。一般情況下作為輔佐氮源。生理酸性氮源和生理堿性氮源常被用來(lái)做發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)的一種有效手段。2. 有機(jī)氮源 主要成分復(fù)雜的工農(nóng)業(yè)下腳料，包括豆粉、玉米粉、豆餅、魚(yú)粉、蠶蛹粉、釀酒工業(yè)的酒糟等。 米粉、豆餅、魚(yú)粉、蠶蛹粉、釀酒工業(yè)的酒糟等。 玉米漿：一般含10%左右的乳酸，pH值在4左右，一般用于抗生素發(fā)酵。尿素脲 ：抗生素和氨基酸發(fā)酵，尤其是谷氨酸的生產(chǎn)。能分泌脲酶的微生物才能利用。氮含量高達(dá)50%，但是營(yíng)養(yǎng)成分單一。蛋白胨動(dòng)物組織和植物水解制備

6、：實(shí)驗(yàn)室用有機(jī)氮源魚(yú)粉酒糟四、無(wú)機(jī)鹽及微量元素 功能：構(gòu)成菌體的成分；酶的組成局部或其激活劑、抑制劑；調(diào)節(jié)滲透壓、菌體內(nèi)部pH以及氧化復(fù)原電位等等。大量元素1mM，包括P、S、K、Mg 、Ca、Na、Fe，常常以鹽的形式參加培養(yǎng)基。如：磷酸鹽，鉀鹽，鎂鹽，鈣鹽等。微量元素0.01 1mM，包括Cu、Zn、Mn、Mo和Co等，Co是發(fā)酵微生物 B12 的激活劑。K,Na,Ca等離子雖然不是細(xì)胞的組成成分，但是與維持細(xì)胞的一定滲透壓和細(xì)胞透性相關(guān)，并且是許多酶得得激活劑。 五、生長(zhǎng)因子 功能：生長(zhǎng)因子為微生物必不可少的物質(zhì)，一般為小分子有機(jī)物，需求量很小。包括：維生素、堿基等。維生素中需求量最大的

7、為B族維生素，多為生化代謝中的輔酶。一般不需要單獨(dú)添加。天然原料玉米漿、糖蜜、豆餅水及實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基酵母膏等都已經(jīng)含有。應(yīng)用實(shí)例：生物素合成生物質(zhì)膜的重要輔酶，缺乏會(huì)造成細(xì)胞膜不完整，細(xì)胞內(nèi)容物的滲漏。添加亞適量5mg/L，可即使菌體生長(zhǎng)少受抑制也可以使過(guò)多的谷氨酸因外泄而源源不斷地合成。六、前體物質(zhì)前體物質(zhì)指添加到培養(yǎng)基中的物質(zhì)，并不促進(jìn)微生物生長(zhǎng)，而是直接經(jīng)微生物的生物合成過(guò)程結(jié)合到產(chǎn)物分子上去，其自身結(jié)構(gòu)根本不變，而產(chǎn)物產(chǎn)量卻因此提高。可看作是一種底物。過(guò)量那么對(duì)菌體有毒！方式：流加。例子：最早在青霉素發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)前體物質(zhì)。發(fā)現(xiàn)添加玉米漿可提高青霉素G的含量，深入研究發(fā)現(xiàn)玉米漿含有苯乙酸，苯

8、乙酸是青霉素G的側(cè)鏈，即苯乙酸是青霉素G發(fā)酵的前體物質(zhì)。不同青霉素的側(cè)鏈不同：青霉素V- -苯氧乙酸 鏈霉素- -肌醇、甲硫氨酸、精氨酸 紅霉素- -丙酸、丙醇、丙酸鹽、乙酸鹽 七、促進(jìn)劑和抑制劑1、促進(jìn)劑：并不是前體或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但卻能提高產(chǎn)量的物質(zhì)。 作用方式： 或影響微生物正常代謝；或促進(jìn)中間產(chǎn)物的累積；或提高次級(jí)代謝產(chǎn)物量。 如：巴比妥鹽能增加生產(chǎn)菌菌絲的抗自溶能力，到達(dá)推遲菌體自溶目的，增加鏈霉素和利福霉素等抗生素的累積。如：谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)賴氨酸的時(shí)候，參加紅霉素可以提高產(chǎn)量25%以上，參加外表活性劑可以增加產(chǎn)量30%以上。 2、抑制劑：一些對(duì)生產(chǎn)菌代謝途徑有某種調(diào)節(jié)能力的物質(zhì)。抑

9、制某些代謝途徑的進(jìn)行，同時(shí)刺激另 一個(gè)代謝途徑，之一改變代謝途徑，如：酵母厭氧發(fā)酵中參加亞硫酸鹽或堿類，可以促 進(jìn)酒精發(fā)酵轉(zhuǎn)入甘油發(fā)酵。 淘汰雜菌的抑制劑，如：真菌發(fā)酵中參加抗生素； 帶抗生素抗性的工程菌發(fā)酵中參加該抗生素， 淘汰非重組細(xì)胞或突變細(xì)胞。 八、水1 水是良好的溶劑，菌體所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都是溶解于水中被吸收的。2 滲透、分泌、排泄等作用都是以水為媒介的；3 水直接參與代謝作用中的許多反響。所以，水在生物化學(xué)反響中占有極為重要的地位。4 水的比熱高，能有效地吸收代謝過(guò)程中所放出的熱，使細(xì)胞內(nèi)溫度不致驟然上升。5 水是熱的良導(dǎo)體，有利于放熱，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的溫度。本章主要內(nèi)容第一節(jié) 發(fā)酵營(yíng)

10、養(yǎng)基質(zhì)的組成第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵中營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的種類第三節(jié) 培養(yǎng)基確實(shí)定和優(yōu)化第四節(jié) 原料的選擇及工業(yè)發(fā)酵中 重要營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的配制方法第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵中營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的種類 一、 天然、合成、半合成培養(yǎng)基1、天然培養(yǎng)基undefined medium：是采用化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分還不恒定的各種植物和動(dòng)物組織或微生物的浸出物、水解液等物質(zhì) (例如牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、蛋白胨、玉米漿、各種淀粉水解液、糖蜜等)制成的。 優(yōu)點(diǎn)：取材方便、營(yíng)養(yǎng)豐富、價(jià)格低廉、適用范圍廣；缺點(diǎn)：原料質(zhì)量不穩(wěn)定，不利于發(fā)酵控制。2、合成培養(yǎng)基defined medium：是用化學(xué)成分和數(shù)量完全了解的物質(zhì)配制而成的，成分精確，重復(fù)性強(qiáng)

11、，可以減少不能控制的因素。適用于在實(shí)驗(yàn)室范圍作有關(guān)營(yíng)養(yǎng)、代謝、分類鑒定、生物測(cè)定及選育菌種、遺傳分析等定量研究工作。 缺點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)單一，價(jià)格高，適用范圍較窄。 3、半合成培養(yǎng)基semi-defined medium：既有天然有機(jī)物作碳源、氮源和生長(zhǎng)因子的來(lái)源，又含有一些化學(xué)藥品以補(bǔ)充無(wú)機(jī)鹽成分，使其更能充分滿足微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需要。 大多數(shù)微生物都能在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖。因此，在微生物 工業(yè)生產(chǎn)上和試驗(yàn)研究中被廣泛使用。二、固體、液體、半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基liquid medium：常用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)及生理代謝等根本理論研究工作。發(fā)酵工業(yè)多用作培養(yǎng)種子和發(fā)酵的培養(yǎng)基。根據(jù)微生物對(duì)氧的要求情況

12、，分別作根據(jù)微生物對(duì)氧的要求情況，分別作靜止或通風(fēng)攪拌培養(yǎng)。在菌種篩選工作和菌種擴(kuò)大培養(yǎng)工作中，也常用液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基solid medium：是在 液體培養(yǎng)基中參加凝固劑配成的，最 常用的凝固劑是瓊脂。 分類：斜面試管、平板等。 功能：在菌種的別離、保藏、 菌落特征的觀察、活菌計(jì)數(shù) 和鑒定菌種方面是不可缺少。半固體培養(yǎng)基semi-solid medium： 0.5%瓊脂。主要用于實(shí)驗(yàn)室的微生物運(yùn)動(dòng)觀察穿刺培養(yǎng)，某些厭氧菌的保藏工作。三、鑒別和選擇性培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基differential medium：是根據(jù)微生物能否利用培養(yǎng)基中某種營(yíng)養(yǎng)成分，借助指示劑的顯色反響，以鑒別不

13、同種類的微生物。選擇培養(yǎng)基selective medium：根據(jù)某種微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或其對(duì)某種物理化學(xué)因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，目的是使混合樣品中的劣勢(shì)菌群變成優(yōu)勢(shì)菌群，或同時(shí)還會(huì)參加一些特殊的抑制劑來(lái)抑制競(jìng)爭(zhēng)菌群。藍(lán)白篩選平板多種腸道菌群用EMB培養(yǎng)基來(lái)鑒別四、發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基種子、孢子、發(fā)酵培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基：供菌種繁殖孢子，常采用固體培養(yǎng)基，目的是在使發(fā)酵菌種不發(fā)生變異的前體下盡可能多的產(chǎn)生孢子。根本要求是在營(yíng)養(yǎng)根本保證、理化條件適宜的前提下，營(yíng)養(yǎng)不要太豐富特別是有機(jī)氮源，否那么不易產(chǎn)孢子。生產(chǎn)商常用的：麩皮培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基等。 種子培養(yǎng)基：供孢子發(fā)芽生長(zhǎng)出大

14、量的菌絲體，或不產(chǎn)生孢子放入菌種繁殖出大量的細(xì)胞，并具有較高的活力和純度的培養(yǎng)基。 特點(diǎn)： 1. 必須有較完全和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別需要充足的氮源和生長(zhǎng)因子； 2.供孢子發(fā)芽生長(zhǎng)用的種子培養(yǎng)基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源； 3.種子培養(yǎng)基成分還應(yīng)考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近，使種子盡快適應(yīng)發(fā)酵培養(yǎng)基，縮短周期。 發(fā)酵培養(yǎng)基：供菌種生長(zhǎng)繁殖和合成發(fā)酵產(chǎn)物的培養(yǎng)基。 是發(fā)酵生產(chǎn)中最主要的培養(yǎng)基，它不僅耗用大量的原材料，而且也是決定發(fā)酵生產(chǎn)成功與否的重要因素。 1根據(jù)產(chǎn)物合成的特點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基。 對(duì)菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物相偶聯(lián)的發(fā)酵類型，充分滿足細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基就能獲得最大的產(chǎn)物。 對(duì)于生產(chǎn)氨

15、基酸等含氮的化合物時(shí)，它的發(fā)酵培養(yǎng)基除供給充足的碳源物質(zhì)外，還應(yīng)該添加足夠的銨鹽或尿素等氮素化合物。 2發(fā)酵培養(yǎng)基的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度應(yīng)盡可能高些，這樣在同等或相近的轉(zhuǎn)化率條件下有利于提高單位容積發(fā)酵罐的利用率，增加經(jīng)濟(jì)效益。 3發(fā)酵培養(yǎng)基需耗用大量原料，因此，原料來(lái)源、原材料的質(zhì)量以及價(jià)格等必須予以重視。 本章主要內(nèi)容第一節(jié) 發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的組成第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵中營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的種類第三節(jié) 培養(yǎng)基確實(shí)定和優(yōu)化第四節(jié) 原料的選擇及工業(yè)發(fā)酵中 重要營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的配制方法第三節(jié) 培養(yǎng)基的選擇和優(yōu)化一、培養(yǎng)基的選擇1首先必須做好調(diào)查研究工作，了解菌種的來(lái)源、生活習(xí)慣、生理生化特性和一般的營(yíng)養(yǎng)要求見(jiàn)表 四大類微生

16、物的典型培養(yǎng)基。 工業(yè)生產(chǎn)主要應(yīng)用細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌四大類微生物。 它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求既有共性，也有各自的特性，應(yīng)根據(jù)不同類型微生物的生理特性考慮培養(yǎng)基的組成。2其次，對(duì)生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件，生物合成的代謝途徑，代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、一般提煉方法和產(chǎn)品質(zhì)量要求等也需要有所了解，以便在選擇培養(yǎng)基時(shí)做到心中有數(shù)。3最好先選擇一種較好的化學(xué)合成培養(yǎng)基做根底，開(kāi)始時(shí)先做一些搖瓶試驗(yàn)； 然后進(jìn)一步做小型發(fā)酵罐培養(yǎng)，摸索菌種對(duì)各種主要有機(jī)碳源和氮源的利用情況和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力。 注意培養(yǎng)過(guò)程中的pH變化，觀察適合于菌種生長(zhǎng)繁殖和適合于代謝產(chǎn)物形成的兩種不同pH，不斷調(diào)整配比來(lái)適應(yīng)上述各種情況

17、。二、工業(yè)發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的選擇 完善的培養(yǎng)基設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)工廠和生產(chǎn)規(guī)模的放大中的一個(gè)重要步驟。培養(yǎng)基是否適合于菌體的生長(zhǎng)或累積代謝產(chǎn)物，對(duì)終產(chǎn)品得率的影響非常大。表 細(xì)菌、酵母和真菌的元素組成（按干重%計(jì)）1、必須提供合成微生物細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物的根本成分1作出細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成的化學(xué)計(jì)算的平衡 碳源和能源+氮源+其他需要細(xì)胞+產(chǎn)物+CO2+H2O+熱量 通過(guò)計(jì)算可以獲得生產(chǎn)一定數(shù)量的細(xì)胞時(shí)所需要的營(yíng)養(yǎng)物的最低數(shù)量。在了解一定數(shù)量的生物體所能生產(chǎn)出的產(chǎn)物的數(shù)量后，就有可能計(jì)算出形成產(chǎn)物時(shí)所需的底物數(shù)量。 這些培養(yǎng)基的根本組分的數(shù)量?jī)H僅是供給細(xì)胞形成產(chǎn)物，而不包括生產(chǎn)細(xì)胞所需要的營(yíng)養(yǎng)。所有上

18、述各項(xiàng)數(shù)量，是不易獲得其精確數(shù)字的。2組成微生物的元素包括C、H、O、N、S、P、Mg和K見(jiàn)上表，這些元素都要在方程式中予以平衡 在培養(yǎng)基中有些元素的含量往往超過(guò)需要量，如P和K。而其他元素含量那么接近最低值，如Zn、Cu等。在許多培養(yǎng)基中增加磷酸鹽濃度，其用意是增加培養(yǎng)基的緩沖容量，這一點(diǎn)，在設(shè)計(jì)培養(yǎng)基時(shí)要引起注意。3有些微生物不能合成的特定營(yíng)養(yǎng)物，如氨基酸、維生素或核苷酸，需要在培養(yǎng)基中參加適量的純潔的化合物或含有該物質(zhì)的混合物。4有些發(fā)酵產(chǎn)物，如抗生素等，除了配制培養(yǎng)基以外，還要通過(guò)中間補(bǔ)料法，一面對(duì)碳及氮的代謝予以適當(dāng)?shù)目刂?，一面間歇添加各種養(yǎng)料和前體類物質(zhì)，引導(dǎo)發(fā)酵走向合成產(chǎn)物的途徑

19、。2、根據(jù)經(jīng)濟(jì)效益選擇培養(yǎng)基原料 考慮經(jīng)濟(jì)節(jié)約，盡量少用或不用主糧，努力節(jié)約用糧，或以其他原料代糧。 糖類是主要的碳源。碳源的代用方向主要是尋找植物淀粉、纖維水解物，以廢糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工業(yè)葡萄糖代替食用葡萄糖。同時(shí)，使用稀薄的培養(yǎng)基，適當(dāng)減少碳氮配比。 石油作為碳源的微生物發(fā)酵不但可以生產(chǎn)以糧食為碳源的發(fā)酵產(chǎn)品。 有機(jī)氮源的節(jié)約和代替主要為減少或代替黃豆餅粉、花生餅粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有豐富蛋白質(zhì)的原料。代用的原料可以是棉籽餅粉、玉米漿、蠶蛹粉、雜魚(yú)粉、黃漿水或麩汁、飼料酵母、石油酵母、骨膠、菌體、酒糟，以及各種食品工業(yè)下腳料等。這些代用品大多蛋白質(zhì)含量豐富，氮源充足，價(jià)

20、格低廉，便于就地取材，方便運(yùn)輸。3、有利于減少培養(yǎng)基原料的單耗，即提高單位營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所合成產(chǎn)物數(shù)量或最大產(chǎn)率。4、有利于提高培養(yǎng)基和產(chǎn)物的濃度，以提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力。5、有利于提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)酵周期。6、盡量減少副產(chǎn)物的形成，便于產(chǎn)物的別離純化。7、所用原料盡可能減少對(duì)發(fā)酵過(guò)程中通氣攪拌的影響，利于提高氧的利用率，降低能耗。8、有利于產(chǎn)品的別離純化，并盡可能減少產(chǎn)生“三廢的物質(zhì)。三、培養(yǎng)基的優(yōu)化在對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化的實(shí)際工作中，常常需要同時(shí)考察 3個(gè)或3個(gè)以上的試驗(yàn)因素，假設(shè)進(jìn)行全面試驗(yàn)，那么試驗(yàn)的規(guī)模將很大，往往因試驗(yàn)條件的限制而難于實(shí)施 。正交設(shè)計(jì)就是安排多因素試驗(yàn)、尋求最

21、優(yōu)水平組合的一種高效率試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。正交設(shè)計(jì)的根本特點(diǎn)是：用局部試驗(yàn)來(lái)代替全面試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)局部試驗(yàn)結(jié)果的分 析，了解全面試驗(yàn)的情況。1 正交表及其用法 正交表是一種特制的表格,以L9(34)L表示正交表,數(shù)字9表示這張表共有9行,說(shuō)明用這張表安排試驗(yàn)要做9次試驗(yàn);數(shù)字4表示這張表共有4列.說(shuō)明用這張表最多可安排4個(gè);數(shù)字3表示在表中主體局部只出現(xiàn)1,2,3三個(gè)數(shù)字,它們分別代表因素的三個(gè)水平,說(shuō)明各因素都是3個(gè)水平. 正交表的構(gòu)造遵循搭配均勻、散布均衡的規(guī)律. 例 某發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室為了提高枯草芽孢桿菌活菌生產(chǎn)能力，需要通過(guò)試驗(yàn)選擇最好的發(fā)酵培養(yǎng)基配制方案。經(jīng)初步分析，主要有3個(gè)因素影響枯草芽孢桿菌

22、活菌生產(chǎn)能力，它們是牛肉膏、蛋白胨和NaCl，每個(gè)因素都考慮3個(gè)水平，具體情況如表。問(wèn)對(duì)這3個(gè)因素的3個(gè)水平如何安排，才能獲得最高的枯草芽孢桿菌活菌含量？3因素3水平的實(shí)驗(yàn)安排 對(duì)3個(gè)因素的3個(gè)水平的問(wèn)題，如果每個(gè)因素的每個(gè)水平都互相搭配進(jìn)行全面試驗(yàn)，必須做33=27次試驗(yàn)。按正交表L9(34)的前3列安排試驗(yàn)只須做9次試驗(yàn)。9次試驗(yàn)的結(jié)果如下： Ki這一行的3個(gè)數(shù)分別是因素A、B、C的第i個(gè)水平所對(duì)應(yīng)的菌體濃度之和。ki為i水平的平均值。極差是同一列中k1、k2、k3這3個(gè)數(shù)中最大者減去最小者，反映了因素水平對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響程度。 本例中各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)菌體濃度的影響按大小順序來(lái)說(shuō)C氯化鈉、

23、A牛肉膏、B蛋白胨，最好方案是C2A3B2即： C2氯化鈉，第2水平：5 A3牛肉膏，第3水平：4 B2蛋白胨，第2水平：10 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的根本步驟 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)稱正交設(shè)計(jì)的根本程序是設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案和處理試驗(yàn)結(jié)果兩大局部。主要步驟可歸納如下： 第一步，明確試驗(yàn)?zāi)康模_定考核指標(biāo)。 第二步，挑因素，選水平。 第三步，選擇適宜的正交表。 第四步，進(jìn)行表頭設(shè)計(jì)。 第五步，確定試驗(yàn)方案。 第六步，試驗(yàn)結(jié)果分析。本章主要內(nèi)容第一節(jié) 發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的組成第二節(jié) 工業(yè)發(fā)酵中營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的種類第三節(jié) 培養(yǎng)基確實(shí)定和優(yōu)化第四節(jié) 原料的選擇及工業(yè)發(fā)酵中 重要營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的配制方法第四節(jié) 原料的選擇及工業(yè)發(fā)酵中重要營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)

24、的配制方法一、原料的定義及選擇原那么1、原料的定義：從工藝角度來(lái)講，但凡能被微生物利用并轉(zhuǎn)化成所需的代謝產(chǎn)物或菌體的物料，都可作為發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)的原料。2、原料選擇的原那么 資源豐富，價(jià)格低廉，易收集，易儲(chǔ)藏，對(duì)人體無(wú)害，影響發(fā)酵過(guò)程的雜質(zhì)含量應(yīng)極少或幾乎不含，適合微生物的需要和吸收利用，對(duì)生產(chǎn)中除發(fā)酵以外的其他方面，如通氣、攪拌、精制、廢棄物處理等帶來(lái)的困難最少。二、常用主要原料常用原料種類薯類：甘薯、馬鈴薯、木薯、山藥等。糧谷類：高粱、玉米、大米、谷子、大麥、小麥、燕麥等。野生植物：橡籽仁、葛根、土茯苓、蕨根、石蒜、金剛頭、香附子等。農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物：米糠餅、麩皮、高粱糠、淀粉渣等。非糧食生

25、物質(zhì)原料：纖維素、木質(zhì)素、半纖維素等。三、發(fā)酵工業(yè)中重要營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的配制方法1、淀粉的組成和特性1淀粉顆粒的外觀 淀粉顆粒呈白色，不溶于冷水和有機(jī)溶劑，其內(nèi)部呈復(fù)雜的結(jié)晶組織。隨原料品種和種類的不同，淀粉顆粒具有不同的形狀和大小。形狀不規(guī)那么，大致上可分為圓形、橢圓形和多角形。 一般說(shuō)來(lái)，水份含量高，蛋白少的植物，顆粒較大，形狀較整齊，大多為圓形或卵形，如馬鈴薯、甘薯的淀粉。 顆粒較大的薯類淀粉較易糊化，顆粒較小的谷物淀粉相對(duì)較難糊化。偏光顯微鏡下淀粉顆粒的偏光十字(400倍) 顯微鏡下淀粉顆粒結(jié)構(gòu)板栗淀粉粒一淀粉質(zhì)原料制糖工藝及培養(yǎng)基的配制方法秈米淀粉粒偏光顯微鏡下淀粉顆粒的偏光十字(400倍

26、) 顯微鏡下淀粉顆粒結(jié)構(gòu)薏米淀粉粒2淀粉分子的組成 淀粉的本質(zhì)是由葡萄糖脫水聚合而成的，可以表示為C6H10O5n。可分為直連淀粉和支鏈淀粉，直鏈淀粉通過(guò)-1，4鍵連接。支鏈淀粉的直鏈局部通過(guò)-1，4鍵連接，分支點(diǎn)那么有-1，6鍵連接。 支鏈淀粉淀粉分子顆粒構(gòu)成過(guò)程：淀粉分子鏈針狀晶體淀粉顆粒氫鍵聚集淀粉分子顆粒構(gòu)成過(guò)程：淀粉分子鏈針狀晶體淀粉顆粒氫鍵聚集3淀粉的理化性質(zhì)淀粉一般呈白色粉末狀，在熱水中能溶脹。純支鏈淀粉能溶于冷水中，而直鏈淀粉不能，直鏈淀粉能溶于熱水。淀粉沒(méi)有復(fù)原性，也沒(méi)有甜味，不溶于冷水、也不溶于酒精、乙醚等有機(jī)溶劑。糊化：淀粉在熱水中能吸收水分而膨脹，最后淀粉顆粒破裂，淀粉

27、分子溶于水中形成一種均一的糊狀膠體溶液，這就是糊化。溶解或液化：淀粉糊化后，如果提高溫度至 130，由于支鏈淀粉的全部幾乎溶解，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)徹底破壞，淀粉溶液的粘度迅速下降，變?yōu)榱鲃?dòng)性較好的醪液，這種現(xiàn)象稱為淀粉的溶解或液化。 利用淀粉質(zhì)原料制備淀粉要經(jīng)過(guò)粗淀粉的精制過(guò)程，除去蛋白質(zhì)、纖維素、脂類物質(zhì)、灰分等。精制后的淀粉純度為83%84%。2、淀粉水解的原理1淀粉的水解反響 淀粉糖化中的主要反響，本質(zhì)是-1，4鍵和-1，6鍵被翻開(kāi)，分子量逐漸減小，糖苷鍵的斷裂是隨機(jī)的。反響趨勢(shì)是：淀粉糊精低聚糖葡萄糖。 糊精：淀粉經(jīng)酶法或化學(xué)方法水解得到的降解產(chǎn)物，為數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)葡萄糖單位的寡糖和聚糖的混合物。

28、 麥芽糖 (maltose )：兩個(gè)葡萄糖分子以-1，4-糖苷鍵連接構(gòu)成的二糖。為淀粉經(jīng)淀粉酶作用下得到的產(chǎn)物。 2葡萄糖的復(fù)合反響 葡糖在熱和酸的情況下發(fā)生聚合反響，生成異麥芽糖、龍膽二糖等等，反響可逆，可經(jīng)過(guò)再加酸水解一次來(lái)減少。3葡萄糖的分解反響 葡糖發(fā)生的較弱的脫水反響，生成5-羥甲基糠醛，又進(jìn)一步分解為乙酰丙酸、甲酸等，這些物質(zhì)相互聚合，或與氨基酸聚合，生成有色物質(zhì)。淀粉淀粉水解反應(yīng)糊精水解反應(yīng)麥芽糖葡萄糖復(fù)合反應(yīng)分解反應(yīng)復(fù)合二糖5-羥甲基糠醛低聚糖有機(jī)酸、有色物質(zhì)圖 淀粉水解過(guò)程中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)3、淀粉水解糖制備方法概述1酸解法acid hydrolysis method是淀粉水解

29、糖制備的傳統(tǒng)方法，它是以無(wú)機(jī)酸現(xiàn)在也用有機(jī)酸為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解為葡萄糖的方法。 優(yōu)點(diǎn)：工藝簡(jiǎn)單、水解時(shí)間短、設(shè)備生產(chǎn)能力大。目前廣泛采用此法。 缺點(diǎn)：高溫高壓以及酸的腐蝕對(duì)設(shè)備有一定要求；副反響多，影響水解液質(zhì)量；對(duì)原料要求嚴(yán)格，原料淀粉顆粒必須大小均勻，否那么造成水解不均一不徹底；廢水難處理。2酶解法enzyme hydrolysis method 是用專一性很強(qiáng)的淀粉酶將原料淀粉水解為糊精和低聚糖，在用糖化酶繼續(xù)水解為葡糖的制糖工藝。酶解法一般分為兩步進(jìn)行：液化liquification和糖化saccharification，因?yàn)槎加玫矫?，所以又稱雙酶水解法double-en

30、zyme hydrolysis method 。 優(yōu)點(diǎn)：條件溫和，設(shè)備要求低；酶專一性強(qiáng)，副反響少；淀粉液初始濃度較高，要求較低顆粒大小可以不均一；糖液顏色淺，較純潔。 缺點(diǎn)：生產(chǎn)周期長(zhǎng)常需要數(shù)十個(gè)小時(shí)，需要專門(mén)設(shè)備如培養(yǎng)酶的設(shè)備，過(guò)濾困難酶是蛋白質(zhì)。但隨著酶制劑工業(yè)的開(kāi)展，酶法取代酸法是淀粉水解糖技術(shù)發(fā)張的必然趨勢(shì)。3酸酶結(jié)合法acid-enzyme hydrolysis method是結(jié)合了酸法和酶法的水解糖制備工藝，兼具兩者特點(diǎn)。又可分為酸酶法和酶酸法兩種。酸酶法：先將淀粉用酸水解成低聚糖和糊精，在用糖化酶將其水解為葡萄糖的工藝。有些原料的淀粉，如玉米、小麥的淀粉顆粒堅(jiān)實(shí)，用-淀粉酶短時(shí)

31、間內(nèi)往往作用不徹底，因此有些工廠就先用酸將淀粉水解到一定程度DE值約為15，再用糖化酶糖化，解決了這一問(wèn)題。酶酸法：是先用-淀粉酶將原料淀粉水解到一定程度，過(guò)濾除去雜志后，再用酸完全水解的工藝。該法適用于較粗的原料，如大米淀粉，可以彌補(bǔ)酸法對(duì)原料要求較高的缺點(diǎn)，提高原料利用率。表 酸法和酶法制糖工藝比較4、淀粉酸水解法工藝流程1淀粉酸解法工藝流程：淀粉調(diào)漿過(guò)篩加酸進(jìn)料糖化放料冷卻中和脫色過(guò)濾糖液中和：從糖化鍋出來(lái)的糖化液是酸性的，淀粉漿的pH一般左右，所以必須先中和，且中和可以通過(guò)等電點(diǎn)將蛋白質(zhì)和氨基酸雜質(zhì)去掉。一次中和pH：，二次中和pH：。用純堿和燒堿中和，前者要防止產(chǎn)生泡沫，后者要邊攪邊

32、加防止局部過(guò)堿產(chǎn)生焦糖。從糖化鍋出來(lái)的糖化液溫度很高140150，需先通過(guò)緩沖桶降溫至70 80。脫色：除去對(duì)發(fā)酵過(guò)程和發(fā)酵產(chǎn)品不利的雜質(zhì)和有色物質(zhì)。有活性炭法、離子交換樹(shù)脂法和新型磺化煤法。壓濾：溫度適宜：過(guò)高使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)沉淀不完全，過(guò)低糖液粘度過(guò)大，一般控制在60 70 ；壓濾機(jī)要定時(shí)出渣，防止濾布堵塞；濾布保持清潔，經(jīng)常清洗。2酸水解技術(shù)條件一般選擇和原因：淀粉乳濃度18%21%：濃度低，水解容易，糖液DE值高，質(zhì)量高，但是原料的糖化速度低；反之糖化質(zhì)量下降但速度較快。一般精制淀粉乳的濃度可比粗制淀粉乳濃度選擇高些。鹽酸用量為干淀粉的0.5% 0.8%，使淀粉乳pH到達(dá)左右：酸提供H+

33、，是反響的催化劑，酸用量大，水解快，但副反響也強(qiáng)。進(jìn)料壓力0.02 ；水解壓力0.28 ：淀粉水解的加熱介質(zhì)是水蒸氣，由于糖化鍋有專門(mén)管道不斷排出不凝性氣體，因此鍋內(nèi)充滿水蒸氣，其溫度和壓力是正相關(guān)的。工業(yè)上一般控制壓力，壓力低水解慢，壓力高雖然水解快，但副反響也快，并且鍋體腐蝕也快。水解時(shí)間一般15min左右：糖化鍋容積不能太大，保證進(jìn)料放料迅速，保證在有效的時(shí)間內(nèi)蒸汽能均勻地作用于底物，防止水解不徹底，且盡量防止副反響；糖化鍋附屬管道設(shè)計(jì)也應(yīng)盡量保證縮短輔助時(shí)間。水解終點(diǎn)檢查，一般用無(wú)水酒精檢查無(wú)白色反響為止。圖 典型糖化鍋構(gòu)造1、原料淀粉進(jìn)口1；2、熱水進(jìn)口；3、攪拌器；4、加熱蒸汽管道

34、進(jìn)口；5、蒸汽冷凝水出口；6、糖化液放料口；7、不凝性氣體排出口；8耳架；9、原料淀粉進(jìn)料口2；10、環(huán)形槽；11、污水排出口；12、風(fēng)門(mén)3淀粉酸水解過(guò)程中的一些因素淀粉乳濃度：濃度低，水解容易，糖液DE值高，質(zhì)量高，但是原料的糖化速度低；反之糖化質(zhì)量下降但速度較快。一般精制淀粉乳的濃度可比粗制淀粉乳濃度選擇高些。酸的種類和濃度的影響：酸提供H+，是反響的催化劑，酸用量大，水解快，但副反響也強(qiáng)。鹽酸：高效，但中和后產(chǎn)生氯化物，增加糖液灰分，對(duì)葡萄糖的結(jié)晶，別離及收率會(huì)有影響。硫酸：能力僅次于鹽酸，用碳酸鈣中和，經(jīng)脫色，離子交換可除去。草酸：能力低，用石灰中和生成草酸鈣，脫色過(guò)濾易除去，非強(qiáng)酸，

35、減少了復(fù)合反響。糖化溫度和時(shí)間：淀粉水解的加熱介質(zhì)是水蒸氣，由于糖化鍋有專門(mén)管道不斷排出不凝性氣體，因此鍋內(nèi)充滿水蒸氣，其溫度和壓力是正相關(guān)的。工業(yè)上一般控制壓力，壓力低水解慢，壓力高雖然水解快，但副反響也快，并且鍋體腐蝕也快。5、淀粉酶水解法工藝流程酶法主要用到-淀粉酶和糖化酶兩種酶，因此又叫雙酶水解法。淀粉酶解法工藝流程：液化糖化滅酶過(guò)濾貯糖計(jì)量發(fā)酵 1液化：定義：雙酶水解法的第一個(gè)步驟，使用-淀粉酶的催化作用水解原料淀粉，使淀粉液黏度不斷下降，流動(dòng)性增強(qiáng)的過(guò)程。國(guó)內(nèi)一般使用的-淀粉酶來(lái)源于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，作用于-1,4糖苷鍵，可越過(guò)-1,6糖苷鍵作用于直連

36、淀粉和支鏈淀粉，主要產(chǎn)物是麥芽糖和葡萄糖。工藝要點(diǎn)： 淀粉狀態(tài)：淀粉在液化前必須先糊化，破壞其晶體結(jié)構(gòu)，使淀粉分子浸出，再參加-淀粉酶。酶只在淀粉顆粒外表反響，淀粉顆粒的水解速度和淀粉糊化液的水解速度之比為1:20000。 溫度： 目前-淀粉酶的最適作用溫度為40。但生產(chǎn)上為盡快完成液化，一般溫度為8090，并參加鈣離子作為保護(hù)劑。研究耐高溫的-淀粉酶是雙酶水解法的熱點(diǎn)問(wèn)題。 pH值： -淀粉酶在pH6.0 穩(wěn)定，最適pH為7.4 。但也與溫度有關(guān)系。 其他因素：淀粉乳中的淀粉和糊精本身對(duì)酶有保護(hù)作用； -淀粉酶是金屬酶，活性依賴鈣離子；酶的用量，這依淀粉酶的活力和原料而定。 液化程度的控制：

37、酶法液化雖然副產(chǎn)物少，但時(shí)間較長(zhǎng)以后也會(huì)使產(chǎn)物重新結(jié)合成大分子類似淀粉糊化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)引起的淀粉老化現(xiàn)象，影響下一步糖化。因此一般液化時(shí)間控制在10 15min，DE值10 20即可。用碘液顯色法控制液化終點(diǎn)(見(jiàn)下表)。 葡萄糖聚合度與碘液的呈色表2糖化：定義：利用糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶將-淀粉酶產(chǎn)生的液化產(chǎn)物進(jìn)一步水解成葡萄糖。糖化酶的作用方式是從底物的非復(fù)原糖末端開(kāi)始切下葡萄糖單位，產(chǎn)生-葡萄糖，是外切酶。即可作用于-1,4糖苷鍵，也可作用于-1,6糖苷鍵，但速度較慢，約為前者的1/3。工藝要點(diǎn)： 糖化pH：微偏酸，且和溫度及酶的來(lái)源相關(guān)。 溫度：50左右 糖化酶用量：一般30%淀粉濃度，加酶80100活力單位/g淀粉。 糖化時(shí)間：24小時(shí)左右，用無(wú)水酒精檢驗(yàn)無(wú)糊精存在時(shí)，糖化結(jié)束，然后將升溫至100 5min滅酶，降溫、過(guò)