microRNA研究

1、miRNA研究現(xiàn)狀及技術(shù)路線TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD.內(nèi)容概要miRNA簡介miRNA研究的應(yīng)用領(lǐng)域miRNA研究的技術(shù)路線miRNA研究背景 1993年，在線蟲中克隆了lin-4基因，并通過定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)lin-4并不編碼蛋白，而是產(chǎn)生一種小RNA分子。 2001年德國，英國，美國三個(gè)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)手段發(fā)現(xiàn)大量的miRNA. 2002年，Science雜志將“Small RNA & RNAi”評為2002年度最耀眼的明星。同時(shí)，Nature雜志亦將Small RNA評為年度重大科技成果之一。 2005年，microRNA的研

2、究第五次入選“十大科技突破”。 。miRNA定義(MicroRNAs，miRNAs)是一種廣泛存在于真核生物中的單鏈小分子RNA，不具有編碼功能，定位于RNA前體的3端或者5端。miRNA的生物學(xué)特征 19-25nt的單鏈小分子，存在于真核生物中，非編碼序列，沒有ORF，在3端有12個(gè)堿基的長度變化 能夠互補(bǔ)配對結(jié)合于基因序列的側(cè)翼區(qū)域，阻遏或抑制靶mRNA的翻譯 由核酸酶Dicer作用于前體的雙鏈而生成的產(chǎn)物含有3羥基和5磷酸的核苷酸片段，這一特點(diǎn)使它與大多數(shù)寡核苷酸和功能RNA的降解片段區(qū)別開來 大多數(shù)miRNA基因以基因簇形式存在于基因組中，它們多以順反子的形式轉(zhuǎn)錄出前體轉(zhuǎn)錄本，且大部分

3、位于獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單位中 miRNA在物種間具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性。miRNA的產(chǎn)生與功能1.在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄成前體轉(zhuǎn)錄本2.被RNase核酸酶Drosha加工成約70-90nt的發(fā)夾狀pre-miRNA3.轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)被Dicer加工成成熟的miRNA4.雙鏈miRNA分子被解鏈，單鏈的miRNA進(jìn)入一個(gè)核糖蛋白復(fù)合體miRNP(RISC)5.通過與靶基因的3UTR區(qū)互補(bǔ)配對，指導(dǎo)miRNP復(fù)合體對靶基因mRNA 進(jìn)行切割或者翻譯抑制。miRNA的作用機(jī)制miRNA的調(diào)控特點(diǎn) 交叉調(diào)節(jié)：動物miRNA與靶mRNA之間的不完全配對使得任何一個(gè)miRNA都可能作用于不同的mRNA，一個(gè)m

4、RNA也可能受到多個(gè)不同miRNA的調(diào)節(jié)。 自我調(diào)節(jié)：自我調(diào)節(jié)參與了miRNA 的生物合成和功能。例如, 參與miRNA生物合成的一些酶也受到其產(chǎn)物miRNA的調(diào)節(jié)。Dcl1 mRNA編碼一種植物Dicer蛋白參與miRNA的生成, 同時(shí)它也是miR2162的靶分子。 可逆性調(diào)節(jié)：miRNA所致的翻譯抑制在某些條件下是可逆的。當(dāng)mRNA作為miRNA抑制的靶分子后, mRNA 會被送至胞漿內(nèi)的P 體( Pbodies) 重新定位。miRNA調(diào)節(jié)方式的優(yōu)點(diǎn) 與蛋白水平的調(diào)節(jié)相比，更加節(jié)省能量 與轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)相比，miRNA調(diào)節(jié)更迅速，而且是可逆的 內(nèi)含子所編碼的miRNA是一種對基因組資源的高效

5、利用microRNA基因組分布 60%獨(dú)立表達(dá) 15% 成簇表達(dá) 25%的miRNAs位于內(nèi)含子植物與動物miRNA的區(qū)別動物植物前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)短，簡單長，復(fù)雜，折回長度變異明顯加工過程作用機(jī)制先在細(xì)胞核，后在細(xì)胞質(zhì) 僅在細(xì)胞核中大部分作為翻譯阻遏子， 大部分介導(dǎo)靶mRNAs的小部分導(dǎo)致靶mRNAs降解 降解長度保守性22-23nt高21nt更高內(nèi)容概要miRNA簡介miRNA研究的應(yīng)用領(lǐng)域miRNA研究的技術(shù)路線應(yīng)用領(lǐng)域腫瘤研究疾病治療植物研究動物研究miRNA干細(xì)胞研究病毒研究microRNA與腫瘤研究1）腫瘤發(fā)生：MiRNA能夠作為腫瘤抑制劑或致癌因子行使功能，特定miRNA的敲除或過表達(dá)

6、可用于研究miRNA在癌癥發(fā)生和發(fā)展過程中的作用2）腫瘤診斷：正常組織和腫瘤組織中miRNA 表達(dá)明顯改變. 這些特點(diǎn)使miRNA 有可能成為腫瘤診斷的新的生物學(xué)標(biāo)記和治療藥物作用的靶標(biāo)3）腫瘤治療：由于大多數(shù)致癌基因能夠引發(fā)癌癥，因而可以設(shè)計(jì)一些人造miRNA阻礙其表達(dá)從而達(dá)到抑制癌癥形成的目的。microRNA與人類疾病目前，多種疾病與microRNA的關(guān)系已得到了研究，如胃癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、舌鱗癌、乳腺癌、惡性淋巴瘤、心臟病、血液病、腦發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌代謝疾病、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等。microRNA與干細(xì)胞研究miRNAs在干細(xì)胞的自我更新、未分化狀態(tài)的維持、繼續(xù)分化增殖

7、等都具有重要的調(diào)控作用。將miRNAs作用與轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控等相結(jié)合，有助于全面地了解干細(xì)胞自我更新和多向分化潛能的分子機(jī)制。miRNA與病毒研究miRNA可以通過與病毒的靶mRNA結(jié)合從而滅活RNA病毒；宿主細(xì)胞編碼miRNA對抗病毒感染的同時(shí),病毒本身的基因組也可以編碼自己的miRNA攻擊宿主細(xì)胞的防御系統(tǒng)。microRNA與植物研究調(diào)控植物的生長發(fā)育介導(dǎo)植物對病毒、病菌的抗性調(diào)節(jié)植物對環(huán)境的耐受脅迫如抗干旱、抗鹽、抗嚴(yán)寒等microRNA與動物研究 調(diào)控動物的生長發(fā)育 介導(dǎo)動物細(xì)胞的增殖與凋亡 調(diào)控激素如胰島素的分泌小結(jié)miRNA的作用是多種多樣的, 它既可以通過關(guān)閉一些關(guān)鍵基

8、因來改變細(xì)胞的命運(yùn)，也可能與其靶基因產(chǎn)物相互作用形成調(diào)節(jié)環(huán)并與其他調(diào)節(jié)通路交織作用形成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。 大多數(shù)miRNA并非獨(dú)立作用, 而是參與到復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。 據(jù)推測,人類三分之一的mRNA都被miRNA調(diào)控,隨著它們的作用機(jī)理逐步明了,相信將會給人類帶來更多的福音。內(nèi)容概要miRNA簡介miRNA研究的應(yīng)用領(lǐng)域miRNA研究的技術(shù)路線miRNA研究的技術(shù)路線miRNA的分離純化miRNA的檢測與鑒定miRNA功能研究miRNA分離純化方法TRNzol，PAGE電泳法離心柱法TRNzol，PAGE電泳法 TRNzol法提取total RNA。 PAGE電泳。按片段大小分離miRNA。

9、從PAGE膠中回收純化核酸。離心柱法提取miRNA 樣品的處理 miRspin吸附 miRelute吸附 漂洗 洗脫樣本前處理離散，均一，細(xì)胞集或細(xì)胞系液氮研磨植物：100mg動物：30-50mg細(xì)胞：107勻漿或液氮研磨應(yīng)用紅細(xì)胞裂解液處理蛋白酶K處理離心柱法提取miRNA天根公司DP501試劑盒miRNA研究的技術(shù)路線miRNA的分離純化miRNA的檢測與鑒定miRNA功能研究miRNA檢測鑒定方法 克隆測序法 Northern雜交 RT-PCR技術(shù) 生物信息學(xué) 基因芯片技術(shù) 原位雜交技術(shù) 熒光定量技術(shù)克隆測序法 先分離純化小RNA，3和5寡核苷酸接頭連接進(jìn)行RT-PCR獲得cDNA，連接

10、到載體上構(gòu)建，連接到載體上構(gòu)建cDNA文庫，篩選克隆進(jìn)行測序，獲得文庫，篩選克隆進(jìn)行測序，獲得miRNA序列。序列。 優(yōu)點(diǎn)：直接、可靠。 缺點(diǎn)：很難克隆出在不同時(shí)期表達(dá)或只在特定組織或細(xì)胞系中表達(dá)的miRNA; 而且由于克隆方法固有的局限性,也很難捕獲表達(dá)豐度較低的miRNA；該方法受其他小分子（如siRNA）的影響，易產(chǎn)生假陽性。ABmiRNA克隆流程圖克隆流程圖15%的變性的變性PAGE，電泳分，電泳分離并回收小片段RNA3端加端加adaptorRT反應(yīng)反應(yīng)15%的變性的變性PAGE，電泳分，電泳分離并回收小片段RNA3端加端加adaptor5端加端加adaptor(DNARNA)5端加端

11、加adaptor(DNA)pcrTA克隆克隆測序并分析結(jié)果RT反應(yīng)反應(yīng)pcrTA克隆克隆測序并分析結(jié)果基因芯片技術(shù) 可以高通量的檢測基因表達(dá)譜，檢測靈敏度較高 芯片制作和檢測需要昂貴的儀器 結(jié)果是半定量的，重復(fù)性較差 不能同時(shí)優(yōu)化所有待測miRNA的雜交環(huán)境，因而不能區(qū)分高度類似的miRNANorthern雜交雜交 簡便可靠，將已知濃度梯度的寡核苷酸參照物與待測樣品進(jìn)行平行雜交，實(shí)現(xiàn)對miRNA的半定量檢測 既可用于檢測miRNA在組織細(xì)胞中的表達(dá)水平，又可結(jié)合RNA marker檢測miRNA的分子大小 缺點(diǎn)：對樣品的需求量較高，需要微克級樣品才能避免假陰性，有時(shí)樣品量達(dá)到40ug才會出現(xiàn)明

12、顯雜交信號原位雜交技術(shù) 可檢測miRNA表達(dá)，并直觀的展示出miRNA的時(shí)空表達(dá)模式 可在福爾馬林固定的組織、石蠟包埋組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞水平進(jìn)行miRNA的檢測 既可以檢測不同細(xì)胞系單個(gè)細(xì)胞中的miRNA表達(dá)，又可在不經(jīng)分類和分離的情況下，比較不同細(xì)胞系中miRNA的表達(dá)水平RT-PCR技術(shù)技術(shù) 簡潔、快速、特異的檢測miRNA的相對含量 高通量，可同時(shí)檢測多種miRNA的表達(dá) 僅需少量RNA，且不用放射性同位素標(biāo)記 可同時(shí)檢測到成熟miRNA及其對應(yīng)的pre-miRNA 需確保引物3端的不同，較高的退火溫度（6061）可提高反應(yīng)特異性，以富集的miRNA為模板擴(kuò)增可提高檢測的靈敏性熒光定量技

13、術(shù) 高度特異性 超寬的定量線性范圍和高度的檢測靈敏度 樣品消耗少，僅需110ng的總RNA 適用范圍廣，總RNA、細(xì)胞裂解物及純化的RNA都可用于miRNA的定量檢測 引物、探針設(shè)計(jì)要求較高Oligo dT熒光定量技術(shù)引物設(shè)計(jì)Reverse引物通常為通用引物，F(xiàn)orward引物一般都直接用miRNA序列或?yàn)樵黾悠錂z測的特異性而特殊設(shè)計(jì)的序列：引物末端加適當(dāng)?shù)腁堿基；引物3端去除幾個(gè)堿基后整理的序列。頸環(huán)結(jié)構(gòu)引物生物信息學(xué)1）發(fā)夾結(jié)構(gòu)是miRNA二級結(jié)構(gòu)的基本特性2）依據(jù)miRNA序列和結(jié)構(gòu)的保守性，這是區(qū)分miRNA候選基因和其他不相關(guān)發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列的關(guān)鍵因素3）根據(jù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的動力學(xué)穩(wěn)定性和序列

14、、結(jié)構(gòu)的相似性，或者利用相關(guān)已知miRNA的遺傳座位進(jìn)行預(yù)測新的miRNA預(yù)測軟件：MIRscan軟件、snarloop軟件、RNAz軟件序列檢索miRNA研究的技術(shù)路線miRNA的分離純化miRNA的檢測與鑒定miRNA功能研究miRNA功能研究的方法 定點(diǎn)突變 異位表達(dá) 轉(zhuǎn)基因 基因芯片 計(jì)算機(jī)預(yù)測miRNA靶基因的預(yù)測方法Stark et al.miRandamiRanda miRBaseTargetScanTargetScanSDIANA microTPicTarRNAHybrid依據(jù)互補(bǔ)性互補(bǔ)性互補(bǔ)性Seed區(qū)互補(bǔ)性區(qū)互補(bǔ)性Seed區(qū)互補(bǔ)性區(qū)互補(bǔ)性miRNA-靶標(biāo)復(fù)合體熱力學(xué)穩(wěn)定性靶

15、標(biāo)復(fù)合體熱力學(xué)穩(wěn)定性miRNA-靶標(biāo)復(fù)合體熱力學(xué)穩(wěn)定性靶標(biāo)復(fù)合體熱力學(xué)穩(wěn)定性miRNA-靶標(biāo)復(fù)合體熱力學(xué)穩(wěn)定性靶標(biāo)復(fù)合體熱力學(xué)穩(wěn)定性網(wǎng)址http:/www.russell.embl.de/miRNAs/http:/microrna.sanger.ac.uk////http:/bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrm

16、iRNA與靶基因的相互作用驗(yàn)證miRNAmRNA間相互作用的結(jié)構(gòu)學(xué)驗(yàn)證miRNAmRNA間相互作用的功能學(xué)驗(yàn)證miRNAmRNA間相互作用的結(jié)構(gòu)學(xué)驗(yàn)證熒光素酶報(bào)告載體系統(tǒng)miRNAmRNA間相互作用的結(jié)構(gòu)學(xué)驗(yàn)證pull down策略策略通過使用針對Argonaute(：Ago)蛋白家族成員(這組蛋白已知與miRNAs結(jié)合并與特異性靶mRNAs 3-UTR區(qū)部分互補(bǔ)序列結(jié)合)的抗體，可免疫共沉淀Ago蛋白結(jié)合的mRNAs。是一種基于它們在體內(nèi)物理學(xué)上的相互作用來鑒定功能性miRNA靶的方法miRNAmRNA間相互作用的功能學(xué)驗(yàn)證miRNA和靶mRNA的共表達(dá)為了抑制生物學(xué)的靶基因的表達(dá)，miRNA必須和其靶mRNA在同種細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)。1、通過從一種特異細(xì)胞中提取總RNA，用特異性的探針進(jìn)行Northern blot分析，或用特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測來證明2、原位RTPCR方法可直接定位成熟miRNAs及其前體，證明在生理學(xué)相關(guān)標(biāo)本中以組織或細(xì)胞特異性的方式進(jìn)行表達(dá)。miRNAmRNA間相互作用的功能學(xué)驗(yàn)證miRNAs對靶基因蛋白表達(dá)的影響用miRNA抑制劑來抑制內(nèi)源性miRNAs的功能，如果miRNAmRNA間的相互作用是真實(shí)的，那么靶基因的表達(dá)量應(yīng)該增加。用針對此蛋白的特異性抗