神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病的基因診斷

1、神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病的基因診斷神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病的基因診斷杜萬良北京天壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科基因wDNA上的功能單位。w基因結(jié)構(gòu)模式圖：基因突變wDNA分子結(jié)構(gòu)的化學(xué)變化。突變的類型突變的類型w堿基替換：某個(gè)堿基被另一個(gè)堿基所取代（點(diǎn)突變）。嘌呤或嘧啶之間的取代為轉(zhuǎn)換；嘌呤與嘧啶之間的取代為顛換。w同義突變：突變后密碼子改變但氨基酸不變化。w錯(cuò)義突變：突變后氨基酸發(fā)生改變。w無義突變：突變后變?yōu)榻K止密碼。w堿基插入和缺失：由于堿基的增多或減少造成閱讀框架的改變移碼突變。以上突變?yōu)榉€(wěn)定突變，即傳遞中不再變化的突變。w動(dòng)態(tài)突變：傳遞中不斷發(fā)生變化的突變，如三聯(lián)體核苷酸數(shù)目的變化，一般是由于不等交換所致。突變的一般特

2、性w可逆性 (Aa, aA)w多向性(Aa1, a2, a3, a4)w有害性w稀有性(Human, 10-6)w可重復(fù)性(Hot site)遺傳病w由于遺傳物質(zhì)缺陷或發(fā)生改變而導(dǎo)致的機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能的紊亂。遺傳病的危害w1、發(fā)病率逐年上升w2、住院兒童近1/3為遺傳相關(guān)疾病w3、自然流產(chǎn)胚胎60%有染色體畸變w4、平均每人攜帶56個(gè)有害基因w5、人群中25%患有各類不同程度的遺傳相關(guān)疾病w6、絕大多數(shù)遺傳病目前沒有理想的治療方法遺傳病的分類遺傳病的分類w染色體病w單基因病w多基因病w線粒體基因病染色體病w染色體病:染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。w常染色體病的共同特征：w智力低下、發(fā)育遲緩、多發(fā)畸形。w

3、性染色體病的共同特征：w性征發(fā)育不全或畸形、智力較低。21-三體綜合征w21-三體又稱先天愚型，Down綜合征。w 1866年英國(guó)醫(yī)生JLH Down首先描述，1959年法國(guó)Lejeune證實(shí)該病的病因是由于G組染色體多了一條，后確定為21號(hào)。w發(fā)病率：1/6001/800。w臨床表現(xiàn)：w、特殊面容眼距寬、鼻塌平、口半開、流口水、耳廓小、手足短。w、發(fā)育不良、肌張力低、關(guān)節(jié)松弛、新生兒有第三囟門。w、部分患者有特殊膚紋，如通貫手、atd角達(dá)64(正常人41)，w、半數(shù)患者伴有先天性心臟病，白血病發(fā)病率高于正常20倍。男性基本無生育能力，女性少數(shù)可有生育能力。大部分壽命不長(zhǎng)，少數(shù)可達(dá)50歲以上。

4、單基因病w單基因?。喝旧w上單一基因的一個(gè)或兩個(gè)等位基因突變。w嚴(yán)格按照孟德爾規(guī)律遺傳w臨床上最多見。多基因病w多基因?。阂粋€(gè)或多個(gè)基因與一種或多種環(huán)境因素共同作用產(chǎn)生的疾病。w沒有嚴(yán)格的孟德爾傳遞規(guī)律。w病種少，但患病者多。線粒體遺傳病w線粒體遺傳病是由于mtDNA的突變所導(dǎo)致。w有性生殖的方式?jīng)Q定了線粒體遺傳屬于母系遺傳。（細(xì)胞質(zhì)遺傳）w 1987年首次提出線粒體病概念，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100多種疾病與線粒體DNA突變有關(guān)線粒體遺傳病線粒體基因組編碼線粒體基因組編碼：2個(gè)個(gè)rRNA基因和基因和22個(gè)個(gè)tRNA基因基因13種多肽基因：種多肽基因：核糖體蛋白基因核糖體蛋白基因rps4，rps13，

5、rps14細(xì)胞色素細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合體基因氧化酶復(fù)合體基因coxI，coxII，coxIIIATP酶復(fù)合體基因酶復(fù)合體基因atpA1，atpA2，atpA6，atpA9，atpA10NADH脫氫酶復(fù)合體脫氫酶復(fù)合體I基因：基因：ND-1，DN-5遺傳病w大多數(shù)遺傳病為先天性疾病，但先天性疾病不一定是遺傳病。w大多數(shù)遺傳病表現(xiàn)出家族聚集性，但家族性疾病不一定是遺傳病。遺傳病診斷遺傳病診斷w1、病史、癥狀、體征 病史采集、外貌特征、發(fā)育狀況。w2、系譜分析 單基因，多基因；顯性，隱性；常染色體，性染色體。 表現(xiàn)度、外顯率、隔代遺傳。 遺傳方式、發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。w3、染色體檢查標(biāo)本外周血、絨毛、羊水、活

6、檢組織。分帶G-, R-, C-, 熒光原為雜交(FISH)分析數(shù)目（單體、多體）、結(jié)構(gòu)（易位、缺失、倒位)指征智力障礙、發(fā)育畸形、多發(fā)流產(chǎn)、不育等。w 4、生化檢查 主要用于分子病和先天性代謝缺陷。 w5、基因診斷 直接診斷被檢者的DNA或RNA。發(fā)展最快，前景最好。直接DNA檢測(cè)缺失、突變、重排.。間接遺傳標(biāo)記檢測(cè)多態(tài)性，連鎖分析。 基因診斷技術(shù)：分子雜交、分子擴(kuò)增、分子測(cè)序。傳統(tǒng)的診斷（舉例）：傳統(tǒng)的診斷（舉例）：、問、望、聽、觸經(jīng)驗(yàn)型診斷、化驗(yàn)/檢驗(yàn)材料：細(xì)胞、組織、大分子、小分子、代謝/排泄物等。方法：細(xì)胞學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)等。、影像學(xué)X光、B超、CT、核磁共振、

7、內(nèi)窺鏡等。、特殊檢查染色體檢查、肌電/心電/腦電、骨密度等。 在醫(yī)學(xué)發(fā)展的過程中，這些方法發(fā)揮了巨大作用，隨著技術(shù)水平的發(fā)展，這些方法也在不斷提高和完善，也還會(huì)有其他新的診斷方法的問世。這些診斷有一個(gè)無法逾越的鴻溝：預(yù)測(cè)也就是說“發(fā)病”了才能診斷?；蛟\斷wGene Diagnosis：detection of genetic disorders by DNA analysis w直接在DNA或RNA水平上進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能檢測(cè)，從而輔助臨床進(jìn)行的診斷。w基因診斷是近年來臨床醫(yī)學(xué)中發(fā)展十分迅速的一類嶄新的診斷技術(shù)，它依托DNA重組技術(shù)，直接從基因型入手，診斷表現(xiàn)型即可以越過產(chǎn)物（酶和蛋白質(zhì)）直接檢

8、測(cè)基因結(jié)構(gòu)而作出診斷。（逆向診斷）w基因診斷始于1978年，Kan第一次成功進(jìn)行了鐮狀細(xì)胞貧血病的產(chǎn)前基因診斷。w基因診斷具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、費(fèi)用低，并對(duì)許多疾病特別是遺傳性疾病具有預(yù)測(cè)性的特點(diǎn)，是一種極具潛力的診斷方法?；蛟\斷的對(duì)象基因診斷的對(duì)象w1、病原生物的侵入，如流感、肝炎、艾滋病w2、單基因遺傳性疾病， 如苯丙酮尿癥、無丙種球蛋白血癥w3、多基因疾病，如腫瘤、高血壓 w4、其它，如親子鑒定、個(gè)體識(shí)別、法醫(yī)物證神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病wWilsons disease (WD)wHuntingtons disease (HD)wCadasilwMelasw(DMD)wCMTwSCAwLeig

9、h基因變異的類型基因變異的類型1、點(diǎn)突變）單個(gè)堿基置換）單個(gè)堿基的缺失或插入2、片段缺失編碼片段；調(diào)節(jié)序列3、片段插入編碼片段；調(diào)節(jié)序列4、重排融合基因5、擴(kuò)增拷貝大量增加6、動(dòng)態(tài)突變遺傳物質(zhì)傳遞過程中不等交換使STR重復(fù)數(shù)增加原理：找突變基礎(chǔ)：PCR（聚合酶鏈反應(yīng)） DNA DNA以指數(shù)形式擴(kuò)增以指數(shù)形式擴(kuò)增(2(2n n) )，其中長(zhǎng)片段以線性形式擴(kuò)增其中長(zhǎng)片段以線性形式擴(kuò)增 (2(2n+2)n+2)，最終主產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在兩個(gè)引物之間。最終主產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在兩個(gè)引物之間。預(yù)變性(92-95C,2-5m)變性(92-95C,30s)復(fù)性(40-60C,30s)延伸(72C,30-60s)總延伸

10、(72C,7m)(25-35)PCRPCR的一般過程：的一般過程：經(jīng)過30次的循環(huán), 擴(kuò)增的DNA片段可達(dá)100萬倍以上。2401625611452228200短片段（單鏈）1412108642長(zhǎng)片段（單鏈）128643216總片段（單鏈）循環(huán)數(shù)策略1w直接診斷：直接檢查致病基因本身的異常。它通常使用基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針，或通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以探查基因無突變、缺失等異常及其性質(zhì)，這稱為直接基因診斷，它適用已知基因異常的疾??； w間接診斷：當(dāng)致病基因雖然已知但其異常尚屬未知時(shí)，或致病基因本身尚屬未知時(shí)，也可以通過對(duì)受檢者及其家系進(jìn)行連鎖分析，以推斷前者是否獲得了帶有致病基因的染色

11、體。連鎖分析是基于緊密連鎖的基因或遺傳標(biāo)記通常一起傳給子代，因而考察相鄰DNA是否傳遞給了子代，可以間接地判斷致病基因是否傳遞給子代。連鎖分析多使用基因組中廣泛存在的各種DNA多態(tài)性位，特別是基因突變部位或緊鄰的多態(tài)性位點(diǎn)作為標(biāo)記。RFLP、VNTR、SSCP、AMPFLP等技術(shù)均可用于連鎖分析。 遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記1、第一代遺傳標(biāo)記限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)8kb5kb3kb在個(gè)體和群體中，片段長(zhǎng)度表現(xiàn)出多態(tài)性。如3kb, 5kb, 7kb, 8kbRFLP呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。常用檢查方法：核酸雜交；P

12、CR-酶切等。產(chǎn)生多態(tài)性的原因是內(nèi)切酶位點(diǎn)的變化。原位點(diǎn)的消失；新位點(diǎn)的產(chǎn)生。GAATTCCTTAAGGATTTCCTAAAG1 21 21 2III2kb3kb5kb7kb2、第二代遺傳標(biāo)記微衛(wèi)星DNA(Micro-satellite DNA) 屬高度重復(fù)序列，重復(fù)單元26bp，重復(fù)區(qū)大多幾十幾百bp，分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內(nèi)，具有較高的多態(tài)性。呈現(xiàn)孟德爾式遺傳。目前微衛(wèi)星DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了萬余個(gè)位點(diǎn)。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG常用檢查方法：PCR等。微衛(wèi)星微衛(wèi)星

13、DNA PCRDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果（示例）：擴(kuò)增結(jié)果（示例）：500bp400bp300bp240bp 該結(jié)果顯示在所檢查的人群中，該位點(diǎn)多態(tài)性有4種。 微衛(wèi)星DNA差異最小只相差2個(gè)堿基（重復(fù)片段只有2個(gè)堿基）。2、第三代遺傳標(biāo)記單核苷酸多態(tài)性(SNP) 某些DNA位點(diǎn)上，單個(gè)堿基存在著變化。如：AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCTAATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCTAATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCT個(gè)體A個(gè)體B個(gè)體C SNP分布于整個(gè)基因組，可在基因內(nèi)，也可在基因間。估計(jì)每1000個(gè)b

14、p存在一個(gè)。在人類DNA序列變異中，SNP占90%。 單個(gè)堿基的插入和缺失不認(rèn)為是SNP。目前已知基因組中含有150萬個(gè)芯片雜交結(jié)果示意圖A C G T位點(diǎn)1位點(diǎn)2位點(diǎn)3常用檢查方法：DNA測(cè)序、芯片雜交等。常用技術(shù)等位基因特異性寡核苷酸雜交（allele-specific oligonucleotide，ASO ） 當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時(shí)，可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素標(biāo)記進(jìn)行診斷。探針通常為長(zhǎng)20bp左右的核苷酸。用于探測(cè)點(diǎn)突變時(shí)需要合成兩種或兩種以上的探針，一種與正常基因序列完全一

15、致，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個(gè)堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來. PCR可結(jié)合ASO，即PCRASO技術(shù)，即先將含有突變點(diǎn)的基因有關(guān)片段進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后再與ASO探針作點(diǎn)雜交，這樣大大簡(jiǎn)化了方法，節(jié)約了時(shí)間，而且只要極少量的基因組DNA就可進(jìn)行。異常探針 T A G正常人 患者 DNA DNA點(diǎn)雜交正常探針 G A G正常人 患者 DNA DNA點(diǎn)雜交單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR (SSCP-PCR)PCR (SSCP-PCR)DNA分子在電泳中的行為取決于分子量和分子

16、構(gòu)象。DNA單鏈的構(gòu)象取決于序列。PCR產(chǎn)物變形后于中性膠中電泳，與正常對(duì)照比較，若電泳行為異常，則認(rèn)為內(nèi)含突變的堿基。對(duì)照對(duì)照 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)等位基因特異性等位基因特異性PCR(Allele-PCR(Allele-Specific PCR, AS-PCR)Specific PCR, AS-PCR)利用末端突變的引物進(jìn)行PCR。實(shí)際應(yīng)用中，常使用三個(gè)引物：A35G3553正常上游引物正常下游引物突變上游引物使用正常引物，在正常人有擴(kuò)增，異常人無擴(kuò)增。使用突變引物，在異常人有擴(kuò)增，正常人無擴(kuò)增。（嚴(yán)格條件下的PCR）ACGTATGGTACCGCAT染色體FISH探針整條染色體涂染探針染色體重復(fù)序列探針

17、染色體專一位點(diǎn)探針基本過程：1、染色體標(biāo)本制備2、探針制備3、雜交4、顯微觀察（染色體分帶）整條染色體涂染通過整條染色體涂染判斷易位染色體引物原位標(biāo)記技術(shù)引物原位標(biāo)記技術(shù)(Primed in situ (Primed in situ Labeling, PRINS)Labeling, PRINS) 針對(duì)染色體的特異性-衛(wèi)星DNA 序列設(shè)計(jì)和合成引物。 利用未標(biāo)記的寡核苷酸引物與變性后的染色體DNA特異結(jié)合, 然后用熒光素標(biāo)記的脫氧核苷酸(dUTP)與未標(biāo)記的脫氧核苷酸一起在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸反應(yīng),標(biāo)記了的dUTP將以堿基配對(duì)的形式摻入到新合成的DNA單鏈中, 最后用相應(yīng)的熒光抗體與標(biāo)

18、記物結(jié)合以顯示檢測(cè)結(jié)果。 舉例1wDMDBMD的缺失型診斷：wDMDBMD是一種連鎖隱性遺傳的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)受累的致死性遺傳病。wDMDBMD有70左右為缺失型。w此基因很大，缺失可發(fā)生在不同部位，因此應(yīng)盡可能采用多對(duì)引物作PCR擴(kuò)增（多重PCR）來檢測(cè)。如擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后發(fā)現(xiàn)有帶紋的缺失，即可作出診斷并對(duì)缺失定位。w在進(jìn)行產(chǎn)前診斷時(shí)，一般可先通過檢測(cè)家系中有關(guān)成員，即確定先證者的缺失區(qū)，然后有針對(duì)性地作PCR擴(kuò)增，包括缺失部分的兩端，以判斷胎兒或有關(guān)患兒是否也獲得了相同的基因缺失，但非缺失型不能用此法查出。 舉例2w脊肌萎縮癥（SMA）w5q13.1 wSMN1,SMN2舉例3wHuntingt

19、ons Disease (HD)wIT15 w（CAG）n舉例4w腓骨肌萎縮癥（CMT）wHereditary motor and sensory neuropathieswa clinically and genetically heterogeneous group of inherited neuropathieswdemyelination (CMT1) waxonal loss (CMT2)wautosomal-dominant, autosomal-recessive, and X-linked inheritance .wmyelin protein zero (MPZ),wea

20、rly growth response gene 2 (EGR2)wperipheral myelin protein 22 (PMP22)wmyotubularin related protein 2 gene (MTMR2)wthe N-myc downstreamregulated gene 1 (NDRG1)wthe L-periaxin gene (PRX)wthe ganglioside-induced differentiation-associated protein 1 gene (GDAP1)wconnexin 32 gene (GJB1)GJB1 alteration (

21、323TC)GJB1 mutation 323TC舉例5wCADASIL： subcortical ischemic stroke and vascular dementia in human adults.wNotch3 is a large gene composed of 33 exons encoding for a 2321 amino-acids protein.wmutations are highly stereotyped missense mutations,located within the 23 exons encoding for the 34 Epidermal

22、Growth Factor (EGF)-like repeats of the extracellular domain of the Notch3 receptor, all mutations resulting either in a gain or a loss of a cysteine residue.wHigh G-C Content up to 88% (mean G-C content 66%).wIn 65% of the patients, these mutations are clustered within exons 3 and 4 but in the 35%

23、remaining ones, mutations are scattered through the 21 other exons.舉例6wMERRF綜合癥肌陣攣性癲癇和破碎紅纖維病w多系統(tǒng)紊亂，肌陣攣性癲癇，共濟(jì)失調(diào)，輕度癡呆，耳聾，脊髓退化。w大量團(tuán)塊狀線粒體聚集于肌細(xì)胞中（可被特異性染料染成紅色，破碎紅纖維）。大腦卵圓核與齒狀核有神經(jīng)元的缺失。w當(dāng)線粒體中90%存在這種突變，將出現(xiàn)典型癥狀，當(dāng)突變比例下降時(shí)，癥狀也隨之變輕。MTTK*MERRF8344G線粒體突變轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因 賴氨酸 疾病縮寫突變位置該位原堿基問題w各種遺傳病的基因異常是不同的，同一遺傳病也可以有不同的基因異常 。w

24、根據(jù)對(duì)基因異常類型的了解，可以采用不同的診斷方法 w如基因缺失可用基因探針雜交，PCR擴(kuò)增直接檢測(cè)；點(diǎn)突變可用等位基因特異的ASO探針、SSCP等直接檢查。一般無需對(duì)家系成員進(jìn)行分析。但條件是必需知道基因異常的性質(zhì)，并肯定該異常與疾病之間的關(guān)系。w然而，由于許多疾病的遺傳異質(zhì)性，以及多數(shù)遺傳的基因異常尚屬未知，目前能直接診斷的病種雖日益增多，但仍然是比較有限的。 策略2w熱點(diǎn)突變w全基因掃描肝豆?fàn)詈俗冃?. AR 2. 臨床癥狀： 進(jìn)行性肝硬化，伴有基底神經(jīng)節(jié)豆?fàn)詈俗冃?，引起神?jīng)癥狀。 3. 病因：存在細(xì)胞膜上的與銅轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的ATP7B缺陷導(dǎo)致銅不能從細(xì)胞內(nèi)及時(shí)清除而在組織中沉積。 4、基因定位：13q14.3wATP7B gene maps to chromosome 13q14.3, contains 21 exons, and encodes a copper-transporting P-type ATPase. wATP7B mutations are scattered over the entire geneWilsons Disease (WD)Rapid identification of