細胞生物學實驗課件：細胞化學成分顯示

1、1.了解細胞化學反應基本原理 2.了解細胞內(nèi)酸性蛋白和堿性蛋白、DNA和RNA分布狀況 3.熟練血涂片技術(shù) 1、材料 蟾蜍 洋蔥 2、儀器和器材 光學顯微鏡 解剖器械 載玻片 染色缸 水浴箱 3、試劑 70%乙醇 5%三氯醋酸 0.1%堿性固綠染液 0.1%酸性固綠染液 丙酮 甲基綠-哌羅寧染液 實驗內(nèi)容：實驗內(nèi)容：n細胞內(nèi)酸性蛋白、堿性蛋白的顯示n細胞內(nèi)DNA和RNA分布 蟾蜍紅細胞洋蔥表皮細胞n細胞內(nèi)不同蛋白質(zhì)分子中所帶的堿性基團(-NH2)和酸性基團(-COOH)的數(shù)量不同，在不同PH溶液中，整個蛋白質(zhì)所帶靜電荷多少也不同。n在一定生理條件下： 整個蛋白質(zhì)所帶的負電荷多（-COO-），就

2、為酸性蛋白；其主要分布在細胞質(zhì)中。 整個蛋白質(zhì)所帶的正電荷多（NH3+），就為堿性蛋白，其主要分布在細胞核內(nèi)。n標本經(jīng)三氯醋酸處理抽提掉核酸后，用不同pH值的固綠染液分別染色，使細胞內(nèi)的堿性蛋白與酸性蛋白質(zhì)顯示出來。一、酸性蛋白質(zhì)、堿性蛋白質(zhì)的顯示一、酸性蛋白質(zhì)、堿性蛋白質(zhì)的顯示n處死蟾蜍，制作三張蟾蜍血涂片，晾干。n兩張 70%乙醇固定6min 90、5%三氯醋酸、15min 沖洗 一張酸性固綠5-10min、另一張堿性固綠30-40min 沖洗晾干、觀察n酸性蛋白：細胞質(zhì)、核仁區(qū)域內(nèi)的蛋白 堿性蛋白：細胞核內(nèi)組蛋白處死蟾蜍的方法： 左手握住蟾蜍的身體和四肢，使其腹部貼著掌心，食指壓住蟾蜍頭

3、部前端使其盡量腹屈。在頭與軀干之間可觸及一凹陷(即枕骨大孔所在處)，右手持解剖針直插入此凹陷約2 mm，將針尖轉(zhuǎn)向頭側(cè)插入顱腔搗毀腦組織。將解剖針向尾側(cè)刺入脊椎管內(nèi)搗毀其脊髓。直至其四肢伸直、肌肉松馳為止。這個時候，蟾蜍已經(jīng)不能動，但是心臟還可以跳動，剪開胸腔，打開心包，小心將心臟剪一小口。n涂片：取心臟血滴一滴在干凈載玻片一端，用另一載玻片的一端邊緣緊貼在血滴處，待血液沿其邊緣展開后，以45度角均勻地向另一端推片，使血液在玻片上成為較薄的血膜，切記不要來回推，因為這樣會破壞細胞的完整性，推成單層是最好的，利于觀察。室溫下晾干。將推片自血滴左 側(cè)向右移動 將推片自血滴左 側(cè)向右移動 當血滴均勻

4、地附著在兩片之間后，再將推 片向左平穩(wěn)地推移 細胞內(nèi)的DNA、RNA分布原理：原理： 核酸是呈酸性，與堿性染料甲基綠-哌羅寧是具有親和力，這兩種堿性染料有選擇的特異染色，甲基綠把DNA染成綠色，哌羅寧把RNA染成紅色。步驟：步驟：n血涂片，70%乙醇固定6min 晾干 甲基綠-派羅寧滴染20min 沖洗，吸干 丙酮分色（沾2-3次）晾干觀察n一小塊洋蔥表皮 甲基綠-哌羅寧滴染30-40min 滴水沖洗 蓋片、觀察 n蟾蜍血涂片：細胞質(zhì)紅色紅色、核藍綠色藍綠色、核仁紫紅紫紅 洋 蔥 表 皮：細胞質(zhì)紅色、核綠色n處死蟾蜍，制作三張蟾蜍血涂片，晾干。n兩張 70%乙醇固定6min 90、5%三氯醋酸

5、、15min 沖洗 一張酸性固綠5-10min、另一張堿性固綠30-40min 沖洗晾干、觀察n血涂片，70%乙醇固定6min 晾干 甲基綠-派羅寧滴染20min 沖洗，吸干 丙酮分色（沾2-3次）晾干觀察n一小塊洋蔥表皮 甲基綠-哌羅寧滴染30-40min 滴水沖洗 蓋片、觀察 洋蔥內(nèi)表皮細胞甲基綠-哌羅寧染色DNA被甲基綠染成綠色 RNA被哌羅寧染成紅色1.細胞組織化學法細胞組織化學法：在保持細胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，利用某些化學試劑與細胞內(nèi)的一些物質(zhì)發(fā)生化學反應，從而在細胞局部形成有色沉淀在通過顯微鏡對細胞內(nèi)的化學成分進行定位定性的檢測方法。2.三氯醋酸的作用三氯醋酸的作用：抽提DNA 、RNA，使蛋白質(zhì)與DNA 、RNA分開。3.固定固定：將細胞殺死，使其仍然保持原來的結(jié)構(gòu)和形態(tài)。4.甲基綠甲基綠-哌羅寧染色原理哌羅寧染色原理：核酸是強性酸，甲基綠-哌羅寧是堿性染料，具有