第二章純培養(yǎng)和顯微技術(shù)

1、蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系1第二章 純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第二章 純培養(yǎng)和顯微技術(shù)純培養(yǎng)技術(shù)&顯微技術(shù)?-研究微生物的最基本的方法研究微生物的最基本的方法蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系2微生物的五大微生物的五大特點(diǎn)特點(diǎn)：1）結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，體積小，表面積/體積比值大；2）吸收多、轉(zhuǎn)化快，代謝活力強(qiáng)；3）生長(zhǎng)旺，繁殖快；4）變異易，適應(yīng)性強(qiáng)；5）分布廣、種類多。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系3微生物的基本特點(diǎn)： ??！絕大多數(shù)情況下都是利用微生物的絕大多數(shù)情況下都是利用微生物的群體群體來(lái)研究其屬性來(lái)研究其屬性微生物的物種一般也是以微生物的物種一般也是以群體群體的形式進(jìn)行繁衍、保存的形式進(jìn)行繁衍、保存蚌埠學(xué)院

2、食品與生物工程系4培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)技術(shù)在微生物學(xué)中具有重要意義！在微生物學(xué)中具有重要意義！純培養(yǎng)技術(shù)純培養(yǎng)技術(shù)是進(jìn)行微生物學(xué)研究的基礎(chǔ)！是進(jìn)行微生物學(xué)研究的基礎(chǔ)！無(wú)菌技術(shù)無(wú)菌技術(shù)是保證微生物學(xué)研究正常進(jìn)行的關(guān)鍵！是保證微生物學(xué)研究正常進(jìn)行的關(guān)鍵！關(guān)鍵技術(shù)關(guān)鍵技術(shù)微生物的基本特點(diǎn)：??！決定了決定了顯微技術(shù)顯微技術(shù)是進(jìn)行微生物研究的另一項(xiàng)重要是進(jìn)行微生物研究的另一項(xiàng)重要技術(shù)，因?yàn)榻^大多數(shù)微生物的個(gè)體形態(tài)及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)技術(shù)，因?yàn)榻^大多數(shù)微生物的個(gè)體形態(tài)及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)只能通過(guò)顯微鏡才能進(jìn)行觀察和研究。只能通過(guò)顯微鏡才能進(jìn)行觀察和研究。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系5小純培養(yǎng)技術(shù)一、無(wú)菌技術(shù)二、用固體培養(yǎng)基分離純培

3、養(yǎng)三：用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)四、單細(xì)胞（孢子）分離五、選擇培養(yǎng)分離六、二元培養(yǎng)物七、菌種保藏蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系6研究微生物“看到”微生物在群體水平上在個(gè)體水平上顯微技術(shù)一、顯微鏡的種類及其原理二、顯微觀察樣品的制備-本章主要內(nèi)容蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系7第一節(jié) 微生物的分離和純培養(yǎng) 從自然狀態(tài)下從自然狀態(tài)下混雜混雜的群體中分離的群體中分離特定的某一種微生物特定的某一種微生物即即獲得純培獲得純培養(yǎng)養(yǎng)，是研究和利用微生物的第一步。，是研究和利用微生物的第一步。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系8一、無(wú)菌技術(shù)（aseptic technique)在分離、轉(zhuǎn)接和培養(yǎng)純培養(yǎng)時(shí)，防止其被其他微生物污染的

4、技術(shù)被稱為無(wú)菌技術(shù)。滅菌（sterilization)：用于分離、培養(yǎng)微生物的器具和基質(zhì)事先不含任何微生物；無(wú)菌操作：在轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)微生物時(shí)防止其它微生物的污染；1、微生物培養(yǎng)的常用器具及其滅菌蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系9蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系102、接種操作火焰附近（酒精燈、煤氣燈）進(jìn)行（p14圖2-1，或者下頁(yè)圖示）蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系11接種操作：無(wú)菌操作接種工具：白金or 鎳鉻合金接種環(huán)/針(p14, 圖2-1), 灼燒滅菌。灼燒滅菌。無(wú)菌操作：蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系12二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系13培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基瓊脂瓊脂菌

5、落（colony）： 單個(gè)（或聚集在一起的一團(tuán)）微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長(zhǎng)、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見(jiàn)的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系14眾多菌落連成一片菌苔（lawn）平板（plate）：又稱為培養(yǎng)平板（culture plate)：蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系15菌落或菌苔穩(wěn)定的特征（形狀、顏色等），可成為對(duì)該微生物進(jìn)行分類、鑒定的重要依據(jù)。（見(jiàn)P15， 圖2-3）蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系16蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系17各種微生物形成的菌落特征分離純培養(yǎng)物的基本原理：?jiǎn)蝹€(gè)的細(xì)胞與其他細(xì)胞分離開(kāi)；供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和合適的條件，使其生長(zhǎng)。蚌埠學(xué)院 食品與

6、生物工程系18使微生物在固體培養(yǎng)基平板上形成單個(gè)菌落的基本方法：稀釋！稀釋！稀釋方式平板劃線法-Streak plate method傾注平板法-Pour plate method涂布平板法-Spread plate method1、平板劃線法：蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系19蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系20蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系21蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系222. 傾注平板法3. 涂布平板法獲得最佳分離效果時(shí)，菌落密度100個(gè)平板較合適。而一般的起始菌液濃度可達(dá)到108-109個(gè)mL，因此需要稀釋，因此切實(shí)可行的稀釋方法是：系列稀釋法（serial dilution)常用的系列稀釋法為：1

7、0 倍或者100倍系列稀釋蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系2310 倍系列稀釋蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系24蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系25蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系26蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系274、厭氧微生物的分離厭氧罐（化學(xué)、物理或生物除氧）蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系28厭氧手套箱嚴(yán)格厭氧菌稀釋搖管法蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系29三、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng) 液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)采用的仍然是稀釋法，將液體高度稀釋直到一支試管中都分配不到一個(gè)微生物（或者一支試管中只有一個(gè)微生物），才可能獲得液體中的純培養(yǎng)。 要達(dá)到該目的即必須在同一個(gè)稀釋度即必須在同一個(gè)稀釋度的的許多平行試管中，大多數(shù)（一般應(yīng)超過(guò)

8、95%）表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系30四、單細(xì)胞（孢子）分離一般采用顯微操作儀，在顯微鏡下進(jìn)行；操作難度與細(xì)胞或個(gè)體的大小成反比；蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系31 所需要的微生物類群，在自然樣品中，如果不占有數(shù)量上的優(yōu)勢(shì)時(shí)，采用前面介紹的稀釋法幾乎是不可能分離得到的。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系32如何對(duì)微生物群落中對(duì)微生物群落中數(shù)量占少數(shù)數(shù)量占少數(shù)的微生物的分離純化？的微生物的分離純化？選擇分離培養(yǎng)五、選擇培養(yǎng)分離1. 利用選擇平板進(jìn)行直接分離蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系33實(shí)例培養(yǎng)基中不含N源：分離固氮菌；培養(yǎng)基加抗生素：分離抗性菌；高溫下培養(yǎng)：分離嗜熱細(xì)菌；蚌埠學(xué)院 食品與生物工

9、程系34. 利用鑒別平板進(jìn)行直接分離蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系35實(shí)例1牛奶平板：分離蛋白酶產(chǎn)生菌蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系36. 富集培養(yǎng) 富集培養(yǎng)是微生物學(xué)家最強(qiáng)有力的技術(shù)手段之一。營(yíng)養(yǎng)和生理?xiàng)l件的幾乎無(wú)窮盡的組合形式可應(yīng)用于從自然界選擇出特定微生物的需要其本質(zhì)仍然是其本質(zhì)仍然是選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基/ /生長(zhǎng)條件生長(zhǎng)條件的作用。的作用。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系37蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系38蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系39六、二元培養(yǎng)物純培養(yǎng)物 混合培養(yǎng)物 二元培養(yǎng)物蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系40二元培養(yǎng)物：由兩種具有特定關(guān)系的微生物組成的混合培養(yǎng)物。培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而且是有意

10、識(shí)培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而且是有意識(shí)的保持二者之間的特定關(guān)系，如寄生、伴生的保持二者之間的特定關(guān)系，如寄生、伴生和捕食。和捕食。v病毒和宿主細(xì)胞二者具有二者具有嚴(yán)格的寄生關(guān)嚴(yán)格的寄生關(guān)系系，二元培，二元培養(yǎng)物是保存病毒的有效途徑，在實(shí)驗(yàn)室條件下可以認(rèn)為接近于純培養(yǎng)物。v纖毛蟲(chóng)、變形蟲(chóng)和粘細(xì)菌與其他微生物與其他微生物屬于屬于獵食獵食關(guān)系，二元培養(yǎng)方法是分離純化此類微生物的有效技術(shù)之一。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系41蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系42蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系43蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系44第二節(jié) 顯微鏡和顯微技術(shù)蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系45幾個(gè)基本概念：蚌埠學(xué)院 食品與生物工

11、程系46蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系47尼康E-600顯微鏡幾個(gè)基本概念的意義蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系48分辨率（力)（R)顯微鏡能夠分辨兩點(diǎn)之間最小距離能力。能夠分辨的距離越小，分辨率越高，反之越低。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系49光學(xué)理論依據(jù)光學(xué)理論依據(jù)德國(guó)理學(xué)家Ernst Abbe，在19世紀(jì)70年代建立的在Abbe的公式中，兩物體之間的最小可分辨距離被稱為最小距離（d）最小距離最小距離=0.5 /nsin = 0.5 /NA蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系50分辨率（R) 1/d公式解析：所用光源的光波波長(zhǎng)，是影響分辨率的最主要因素。: 為物鏡鏡口角的半數(shù)，它取決于物鏡的直徑和工作距離蚌埠學(xué)院

12、 食品與生物工程系51蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系52vn sin n sin = :n sin n sin : 被稱為數(shù)值口徑（被稱為數(shù)值口徑（Numerical Numerical Aperture, NA)Aperture, NA)它是決定物鏡性能的最重要的指標(biāo)。v獲得最小分辨距離提高分辨率的措施：減短光波波長(zhǎng)增加鏡口角增加介質(zhì)的折射率蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系53光學(xué)顯微鏡物鏡的特性蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系54 普通光學(xué)顯微鏡又稱明視野顯微鏡，其照明光線直接進(jìn)入視野，屬透射照明?；畹募?xì)菌在明視野顯微鏡下觀察是透明的。不易看清楚。v解決的措施？解決的措施？改造顯微鏡（不同種類的顯微鏡）改

13、造觀察的樣品（染色技術(shù)）；蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系552. 暗視野顯微鏡 暗視野顯微鏡利用特殊的聚光器對(duì)樣品實(shí)行斜射照明，其目的是使射向樣品上的直射光無(wú)法進(jìn)入物鏡，能夠進(jìn)入物鏡的是樣品上的反射光和折射光，因此，整個(gè)視野是暗的，而樣品是明亮的，同樣可以增加反差。即使所觀察微粒的尺寸小于顯微鏡的分辨率，仍然可以發(fā)現(xiàn)其存在。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系56明、暗視野顯微鏡的區(qū)別在于： 投射在標(biāo)本上的光線的照射方式不同。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系57蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系58暗視野顯微鏡常常用來(lái)觀察活細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性。即使小于分辨率的顆粒仍有可能被觀察到，能見(jiàn)到小至4-200nm 的微粒子，分辨率可比

14、普通顯微鏡高50倍。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系593. 相差顯微鏡v光的波長(zhǎng)長(zhǎng)短具體表現(xiàn)為顏色差別，光的振幅高低具體表現(xiàn)為明亮程度的不同。v由于微生物細(xì)胞個(gè)體微小，含水量大，與背景反差小，光線透過(guò)標(biāo)本時(shí)，光的波長(zhǎng)和振幅發(fā)生的改變不明顯，無(wú)法被眼睛識(shí)別。因此利用:普通光學(xué)顯微鏡：觀察時(shí)常常采用染色的方法增加細(xì)菌與背景的反差（利用了標(biāo)本的顏色變化-波長(zhǎng)的改變）。暗視野顯微鏡：則利用了明暗反差。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系60v實(shí)際上，標(biāo)本各部分厚薄、密度不同，光線通過(guò)時(shí)直射光和衍射光的光程產(chǎn)生差別，導(dǎo)致光波相位的改變（即出現(xiàn)相位差）。這就是相差的來(lái)源。光的相位差肉眼無(wú)法感覺(jué)，那麼相差顯微鏡是如何讓人

15、的眼睛感受到相位差的變化？具體表現(xiàn)在顏色上還是表現(xiàn)在明亮程度上的變化呢？蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系61v相差顯微鏡配備了特殊的光學(xué)裝置，利用光的干涉現(xiàn)象，將光的相位差轉(zhuǎn)變成人眼可辨的振幅差（明暗差），形成反差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn)。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系62v相差顯微鏡配備了特殊的光學(xué)裝置，主要是環(huán)狀光圈和相板。（位置以及作用）環(huán)狀光圈相板（相差物鏡頭， Ph)調(diào)焦望遠(yuǎn)鏡蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系63v利用光的干涉現(xiàn)象，將光的相位差轉(zhuǎn)變成人眼可辨的振幅差（明暗差），形成反差（實(shí)際上，相位推遲1/20波長(zhǎng)時(shí)，合成波的變化就已經(jīng)較明顯，可以被識(shí)別）。由于反差的基

16、礎(chǔ)是細(xì)胞不同部位的密度差異，因此相差顯微鏡很適合觀察活的細(xì)胞以及細(xì)胞內(nèi)的一些細(xì)微結(jié)構(gòu)。此技術(shù)突破使其發(fā)明人F. Zernike 獲得了1953年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系64觀察結(jié)果比較蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系65觀察結(jié)果比較蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系664.熒光顯微鏡v細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可激發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系67蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系68蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系69v熒光顯微鏡和普通光鏡的

17、區(qū)別：光源為紫外光，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見(jiàn)光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)眼睛。v應(yīng)用領(lǐng)域：免疫學(xué)，環(huán)境微生物學(xué)，分子生物學(xué)等。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系70電子顯微鏡光鏡的最高分辨率可達(dá)到0.2m，這種局限是由可見(jiàn)光的性質(zhì)決定的，與顯微鏡自身的性能無(wú)關(guān).蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系71電子顯微鏡是根據(jù)電子光學(xué)原理，用（1）電子束代替光束（2）電子透鏡代替光學(xué)透鏡大大提高了分辨率和放大倍數(shù)，可以觀察物質(zhì)的細(xì)微結(jié)構(gòu)。v電子束的波長(zhǎng)與加速電壓有關(guān)。當(dāng)加速電壓為50100千伏時(shí)，電子束波長(zhǎng)約為0.00530.0037納米。由于電子束的波長(zhǎng)遠(yuǎn)

18、遠(yuǎn)小于可見(jiàn)光的波長(zhǎng)，所以即使電子束的錐角僅為光學(xué)顯微鏡的1，電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于光學(xué)顯微鏡。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系72v電子束的波長(zhǎng)約： 0.005nm (光鏡：400nm),v提高10萬(wàn)倍；v而實(shí)際的分辨率比光鏡提高約： 1000倍v電子顯微鏡因需在真空條件下工作，所以很難觀察活的生物，而且電子束的照射也會(huì)使生物樣品受到輻照損傷。v其他的問(wèn)題，如電子槍亮度和電子透鏡質(zhì)量的提高等問(wèn)題也有待繼續(xù)研究。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系73v電子顯微鏡由鏡筒、真空系統(tǒng)和電源柜三部分組成。鏡筒主要有電子槍、電子透鏡、樣品架、熒光屏和照相機(jī)構(gòu)等部件，這些部件通常是自上而下地裝配成一個(gè)柱體；真空系

19、統(tǒng)由機(jī)械真空泵、擴(kuò)散泵和真空閥門(mén)等構(gòu)成，并通過(guò)抽氣管道與鏡筒相聯(lián)接；電源柜由高壓發(fā)生器、勵(lì)磁電流穩(wěn)流器和各種調(diào)節(jié)控制單元組成。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系74v電子透鏡是電子顯微鏡鏡筒中最重要的部件，現(xiàn)代電子顯微鏡大多采用電磁透鏡，其作用與玻璃凸透鏡使光束聚焦的作用相似，所以稱為電子透鏡。電子槍能發(fā)射并形成速度均勻的電子束。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系75電子顯微鏡按結(jié)構(gòu)和用途可分蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系765. 透射電子顯微鏡； 6. 掃描電子顯微鏡v與光學(xué)顯微鏡的差異：電子波代替了光源，波長(zhǎng)更短；采用電磁圈“聚光器”使“光線”匯聚、聚焦；形成的是電子圖像，需要用感光屏顯示或者感光膠片記錄。電

20、鏡鏡筒中要求高真空（電子運(yùn)行中如遇到游離的氣體分子會(huì)因碰撞而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，導(dǎo)致物象散亂不清）；蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系77蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系78v透射電子顯微鏡：電子束穿過(guò)薄切片；v掃描電子顯微鏡：觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系79蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系807. 掃描隧道顯微鏡v原理：量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)。v金屬探針對(duì)樣品表面極近距離掃描（0.5-2 nm)，探針與樣品之間加零點(diǎn)幾伏的電壓，將產(chǎn)生納安級(jí)的隧道效應(yīng)電流。該電流對(duì)探針與樣品之間的距離非常非常敏感，距離改變0.3nm，電流將改變1000倍?？刂茠呙桦娏骰蛘邟呙韪叨群愣?，記錄電壓和電流的變化而了解樣品的表面形

21、貌特征。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系81v優(yōu)點(diǎn)：分辨率高：是目前分辨率最高的顯微鏡，其橫向分辨率達(dá)到0.1-0.2 nm，縱向可達(dá)到0.001nm?？杀３謽悠吩玻河捎趻呙钑r(shí)不接觸樣品，又沒(méi)有高能電子束轟擊，原則上可避免樣品變形?？梢栽谡婵找约氨３謽悠飞?xiàng)l件的大氣甚至是液體環(huán)境下工作。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系82應(yīng)用：直接觀察大分子，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)等；生物膜、病毒、古生菌的細(xì)胞壁等超微結(jié)構(gòu)。8、原子力顯微鏡（AFM）v利用細(xì)小探針對(duì)樣品表面進(jìn)行恒定高度掃描，但是不產(chǎn)生隧道電流。而是通過(guò)激光裝置監(jiān)測(cè)探針隨樣品表面的升降變化，獲取樣品表面形貌特征。v特點(diǎn)：可以對(duì)不具有導(dǎo)電性，或者導(dǎo)電性

22、能較差的樣品進(jìn)行觀察。 蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系83蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系84蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系85二、顯微觀察樣品的制備v顯微技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，直接影響觀察效果顯微技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，直接影響觀察效果結(jié)合顯微鏡的特點(diǎn)結(jié)合顯微鏡的特點(diǎn)生物樣品的特點(diǎn)生物樣品的特點(diǎn)樣品的生理結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定樣品的生理結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定提高反差提高反差1、光學(xué)顯微鏡的制樣v光學(xué)顯微鏡是生物學(xué)研究的最常用工具光學(xué)顯微鏡是生物學(xué)研究的最常用工具v基本使用方法：基本使用方法：活體觀察活體觀察、染色觀察染色觀察蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系86蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系87活體觀察v在顯微鏡（明視野、暗視野或相差顯微鏡）在顯微鏡

23、（明視野、暗視野或相差顯微鏡）下對(duì)微生物活體進(jìn)行直接觀察下對(duì)微生物活體進(jìn)行直接觀察v特點(diǎn)：避免對(duì)微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，可用避免對(duì)微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，可用于研究運(yùn)動(dòng)能力、攝食特性、生長(zhǎng)過(guò)程中的于研究運(yùn)動(dòng)能力、攝食特性、生長(zhǎng)過(guò)程中的形態(tài)變化，如細(xì)胞分裂、芽孢萌發(fā)等動(dòng)態(tài)過(guò)形態(tài)變化，如細(xì)胞分裂、芽孢萌發(fā)等動(dòng)態(tài)過(guò)程。程。v常用的方法：壓滴法壓滴法、懸滴法懸滴法、菌絲埋片法菌絲埋片法v壓滴法：將菌懸液滴于載玻片上，加蓋將菌懸液滴于載玻片上，加蓋蓋玻蓋玻片片后立即進(jìn)行顯微鏡觀察；后立即進(jìn)行顯微鏡觀察；v懸滴法：在蓋玻片中央加一小滴菌懸液后反在蓋玻片中央加一小滴菌懸液后反轉(zhuǎn)置于特制的凹玻載片上后進(jìn)行顯微鏡觀

24、察轉(zhuǎn)置于特制的凹玻載片上后進(jìn)行顯微鏡觀察。為防止液滴蒸發(fā)變干，一般還應(yīng)在蓋玻片。為防止液滴蒸發(fā)變干，一般還應(yīng)在蓋玻片四周加封凡士林；四周加封凡士林；v菌絲埋片法：將無(wú)菌小塊玻璃紙鋪于平板表將無(wú)菌小塊玻璃紙鋪于平板表面，涂布放線菌或霉菌孢子懸液，經(jīng)培養(yǎng)，面，涂布放線菌或霉菌孢子懸液，經(jīng)培養(yǎng)，取下玻璃紙置于載玻片上，用顯微鏡對(duì)菌絲取下玻璃紙置于載玻片上，用顯微鏡對(duì)菌絲的形態(tài)進(jìn)行觀察。的形態(tài)進(jìn)行觀察。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系88蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系89染色觀察v微小而透明的細(xì)菌細(xì)胞，如何觀察呢？常見(jiàn)的堿性染料：結(jié)晶紫、番紅、美蘭、孔雀綠、中性紅。常見(jiàn)的酸性染料：剛果紅、伊紅、品紅、藻紅。蚌埠

25、學(xué)院 食品與生物工程系90蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系91（參見(jiàn)P26）蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系92簡(jiǎn)單染色水洗、吸干涂片干燥固定染色染色1min鏡檢蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系93革蘭氏染色法vThe Gram-stain technique was developed The Gram-stain technique was developed by the Danish bacteriologist Christian by the Danish bacteriologist Christian Gram in 1884. It divides bacteria into Gram in

26、1884. It divides bacteria into 2 groups, Gram-positive (G2 groups, Gram-positive (G) and the ) and the Gram-negative (GGram-negative (G) )v1、用堿性染料結(jié)晶紫對(duì)菌液涂片進(jìn)行初染v2、用碘液進(jìn)行媒染，其作用是提高染料和細(xì)胞間的相互作用，使二者結(jié)合得更牢固。v3、用乙醇或丙酮沖洗進(jìn)行脫色。在經(jīng)歷脫色后仍將結(jié)晶紫保留在細(xì)胞內(nèi)的為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，而革蘭氏陰性細(xì)菌的結(jié)晶紫被洗掉，細(xì)胞呈無(wú)色。v4、用一種與結(jié)晶紫具有不同顏色的堿性染料對(duì)涂片進(jìn)行復(fù)染。例如沙黃，它使原來(lái)

27、無(wú)色的革蘭氏陰性細(xì)菌最后呈現(xiàn)桃紅到紅色，而革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌繼續(xù)保持深紫色蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系94v注意：注意：染色前必須先對(duì)涂在載玻片上的樣品進(jìn)染色前必須先對(duì)涂在載玻片上的樣品進(jìn)行固定，其目的有二：行固定，其目的有二：v 一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上；一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上；v 二是增加其對(duì)染料的親和力。二是增加其對(duì)染料的親和力。v常用固定方法：常用固定方法：酒精燈火焰加熱酒精燈火焰加熱和和化學(xué)固定化學(xué)固定。固定時(shí)應(yīng)注意盡量固定時(shí)應(yīng)注意盡量保持細(xì)胞原有形態(tài)保持細(xì)胞原有形態(tài)，防止細(xì)防止細(xì)胞膨脹和收縮胞膨脹和收縮。蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系95蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系96Gra

28、m stain of G+ Staphylococcus cells. Gram stain of G- E. coli cells蚌埠學(xué)院 食品與生物工程系97金黃色葡萄球菌和大腸桿菌革蘭氏染色結(jié)果2、電子顯微鏡的制樣v生物樣品在進(jìn)行電鏡觀察前必須進(jìn)行生物樣品在進(jìn)行電鏡觀察前必須進(jìn)行固定固定和和干燥干燥，否則鏡筒中的，否則鏡筒中的高真空會(huì)導(dǎo)致其嚴(yán)重脫高真空會(huì)導(dǎo)致其嚴(yán)重脫水，失去樣品原有的空間構(gòu)型水，失去樣品原有的空間構(gòu)型。v由于構(gòu)成生物樣品的主要元素對(duì)電子的由于構(gòu)成生物樣品的主要元素對(duì)電子的散射散射與吸收的能力均較弱與吸收的能力均較弱，在制樣時(shí)一般都需要，在制樣時(shí)一般都需要采用采用重金屬鹽染色或噴鍍重金屬鹽染色或噴鍍，以，以提高其在電鏡提高其在電鏡下的反差下的反差，