第十一章 核酸的物理化學(xué)性質(zhì)

1、第十一章第十一章 核酸的物理化學(xué)性質(zhì)核酸的物理化學(xué)性質(zhì) 一一.核酸的水解核酸的水解 核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。水解切斷。DNA和和RNA對酸或堿的耐受程度有很大差別。對酸或堿的耐受程度有很大差別。例如，在例如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，溶液中，RNA幾乎可幾乎可以完全水解，生成以完全水解，生成2-或或3-磷酸核苷；磷酸核苷；DNA在在同樣條件下則不受影響。這種水解性能上的差同樣條件下則不受影響。這種水解性能上的差別，與別，與RNA核糖基上核糖基上2-OH參與作用有很大的參與作用有很大的關(guān)系。在關(guān)系。在RNA水解時，水解

2、時，2-OH首先進(jìn)攻磷酸基，首先進(jìn)攻磷酸基，在斷開磷酯鍵的同時形成環(huán)狀磷酸二酯，再在在斷開磷酯鍵的同時形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用下形成水解產(chǎn)物。堿的作用下形成水解產(chǎn)物。酸易水解酸易水解N-糖苷鍵糖苷鍵，嘌呤堿基比嘧啶堿，嘌呤堿基比嘧啶堿基易被酸水解，脫氧核糖比核糖的糖苷基易被酸水解，脫氧核糖比核糖的糖苷鍵易水解，鍵易水解，DNA的嘌呤堿在的嘌呤堿在pH2以下即以下即脫落而成嘌呤酸。脫落而成嘌呤酸。堿易水解堿易水解磷酸酯鍵磷酸酯鍵，RNA在在0.3N堿中即堿中即被水解，被水解，DNA對堿相對穩(wěn)定。對堿相對穩(wěn)定。 酶水解酶水解生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶。這些酶可以催化水解生物體內(nèi)存在多種核酸水

3、解酶。這些酶可以催化水解多聚核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵。多聚核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵。核酸酶的分類核酸酶的分類按底物專一性分：以按底物專一性分：以DNA為底物的為底物的DNA水解酶水解酶（DNases）和以和以RNA為底物的為底物的RNA水解酶（水解酶（RNases）。）。按作用方式分：按作用方式分：核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。 核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（3-端或端或5-端）開始，逐個水解切除核苷酸；核酸內(nèi)切酶端）開始，逐個水解切除核苷酸；核酸內(nèi)切酶的作用方式剛好和外切酶相反，它從多聚核苷酸鏈中的作用方式剛好和外切酶相

4、反，它從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個位點切斷磷酸二酯鍵。間開始，在某個位點切斷磷酸二酯鍵。按作用鍵分：水解按作用鍵分：水解3-磷酸酯鍵和磷酸酯鍵和5-磷酸酯鍵的核酸酶，磷酸酯鍵的核酸酶，產(chǎn)物分別是產(chǎn)物分別是5-磷酸核苷和磷酸核苷和3-磷酸核苷磷酸核苷 核糖核酸酶舉例核糖核酸酶舉例牛胰核糖核酸酶（牛胰核糖核酸酶（RNase I）,內(nèi)切酶，水解嘧內(nèi)切酶，水解嘧啶啶3-磷酸和其他核苷酸磷酸和其他核苷酸5 -OH形成的酯鍵，產(chǎn)形成的酯鍵，產(chǎn)生生3 -磷酸核苷。磷酸核苷。核糖核酸酶核糖核酸酶T1，內(nèi)切酶，發(fā)現(xiàn)于米曲霉，水解內(nèi)切酶，發(fā)現(xiàn)于米曲霉，水解3 -鳥苷酸與其他核酸鳥苷酸與其他核酸5 -OH形成的酯

5、鍵，形成的酯鍵，產(chǎn)物為產(chǎn)物為3 -鳥苷酸為末端的寡核苷酸。鳥苷酸為末端的寡核苷酸。脫氧核糖核酸酶舉例脫氧核糖核酸酶舉例1.牛胰脫氧核糖核酸酶（牛胰脫氧核糖核酸酶（DNase I），內(nèi)切酶，水解內(nèi)切酶，水解DNA 3 -磷酸酯鍵，產(chǎn)生磷酸酯鍵，產(chǎn)生5 -磷酸的寡核苷酸，平均長磷酸的寡核苷酸，平均長度為度為4個核苷酸。個核苷酸。2.牛脾脫氧核糖核酸酶（牛脾脫氧核糖核酸酶（DNase II），內(nèi)切酶，水解內(nèi)切酶，水解DNA 5 -磷酸酯鍵，產(chǎn)生磷酸酯鍵，產(chǎn)生3 -磷酸的寡核苷酸，平均長磷酸的寡核苷酸，平均長度為度為6個。個。3.限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶，可識別特異的堿基序列并水解斷開，產(chǎn)，可識別特異

6、的堿基序列并水解斷開，產(chǎn)物帶物帶5 -磷酸基，已發(fā)現(xiàn)數(shù)千種，是基因工程的重要磷酸基，已發(fā)現(xiàn)數(shù)千種，是基因工程的重要工具酶。工具酶。N-糖苷酶糖苷酶 水解糖苷鍵，產(chǎn)物為含氮堿基和無堿基末湍的寡核苷酸水解糖苷鍵，產(chǎn)物為含氮堿基和無堿基末湍的寡核苷酸 二二.核酸的酸堿性質(zhì)核酸的酸堿性質(zhì)兩性解離兩性解離：DNA無，只有酸解無，只有酸解，堿基被屏蔽堿基被屏蔽（在分子內(nèi)部形成了氫鍵）。（在分子內(nèi)部形成了氫鍵）。RNA有兩性解離，有兩性解離，有有pI。核酸的堿基核酸的堿基、核苷核苷、核苷酸均能發(fā)生解核苷酸均能發(fā)生解離，因此核酸是兩性電解質(zhì)離，因此核酸是兩性電解質(zhì)堿基的解離堿基的解離：嘧啶和嘌呤環(huán)上的：嘧啶和

7、嘌呤環(huán)上的N及各取代基及各取代基具有結(jié)合和釋放質(zhì)子的能力。具有結(jié)合和釋放質(zhì)子的能力。核苷的解離核苷的解離：堿基和核糖具有結(jié)合和釋放質(zhì)子：堿基和核糖具有結(jié)合和釋放質(zhì)子的能力的能力核酸的解離核酸的解離：磷酸基具有較強的酸性，核酸的：磷酸基具有較強的酸性，核酸的兩性解離主要決定于兩性解離主要決定于磷酸基和含氮堿基磷酸基和含氮堿基。 三三. .核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收在核酸分子中，由于嘌呤堿在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨特的紫外線吸收因而具有獨特的紫外線吸收光譜，一般在光譜，一般在260nm左右有左右有最大吸收峰，可以作為核酸最大吸收峰，可以

8、作為核酸及其組分定性和定量測定的及其組分定性和定量測定的依據(jù)。依據(jù)。以以A260/A280進(jìn)行定性、定量進(jìn)行定性、定量DNA和和RNA溶液中加入溶液中加入溴化溴化乙錠（乙錠（EB），在紫外線下發(fā)在紫外線下發(fā)出熒光。出熒光。用用A260/A280還可用來表示還可用來表示核酸的純度：核酸的純度： 大于大于1.8，DNA很純；很純； 大于大于2， RNA很純。很純。樣品中如含有雜蛋白及苯酚，比值明顯樣品中如含有雜蛋白及苯酚，比值明顯降低降低。對于純的樣品，只要讀出對于純的樣品，只要讀出260nm的的A值即值即可算出含量。通常以可算出含量。通常以A值為值為1相當(dāng)于相當(dāng)于50g/ml 雙螺旋雙螺旋DNA

9、，或或40 g/ml單鏈單鏈DNA（或或RNA），或或20 g/ml寡核苷酸寡核苷酸計算。計算。有時核酸的紫外吸收以有時核酸的紫外吸收以摩爾磷的吸光度摩爾磷的吸光度來表示，來表示，摩爾摩爾磷即相當(dāng)于摩爾核苷酸磷即相當(dāng)于摩爾核苷酸。先測定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出先測定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩爾磷吸光系數(shù)摩爾磷吸光系數(shù)(P) 。 (P)=A/cLA為吸收值，為吸收值，c為每升溶液中磷的摩爾數(shù)，為每升溶液中磷的摩爾數(shù)，L為比色杯內(nèi)徑。為比色杯內(nèi)徑。 c=每升中磷的重量（克）每升中磷的重量（克）W/磷的原子量（磷的原子量（30.98） (P)=30.98 A/WL一般

10、天然一般天然DNA的的(P)為為6 600，RNA為為7 700-7 800。核。核酸的酸的(P)值較所含核苷酸單體的值較所含核苷酸單體的(P)要低要低40%-45%。單鏈多核苷酸的單鏈多核苷酸的(P)值比雙螺旋結(jié)構(gòu)多核苷酸的值比雙螺旋結(jié)構(gòu)多核苷酸的(P)要要高，所以核酸發(fā)生變性時，高，所以核酸發(fā)生變性時， (P)升高約升高約25%，此現(xiàn)象，此現(xiàn)象稱為稱為增色效應(yīng)（增色效應(yīng)（hyperchromic effect）。復(fù)性后復(fù)性后(P)又又降低，這現(xiàn)象稱降低，這現(xiàn)象稱減色效應(yīng)減色效應(yīng)(hypochromic effect)。四四. .核酸的變性，復(fù)性及雜交核酸的變性，復(fù)性及雜交( (一一) )

11、變性變性穩(wěn)定核酸雙螺旋的次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變穩(wěn)定核酸雙螺旋的次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。核酸的一級結(jié)構(gòu)核酸的一級結(jié)構(gòu)(核苷酸順序核苷酸順序)保保持不變。持不變。變性表征變性表征 生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效應(yīng)）外吸收增加（增色效應(yīng)）變性因素變性因素 pH（11.3或或5.0） 變性劑（脲、甲酰胺、甲醛）變性劑（脲、甲酰胺、甲醛） 低離子強度低離子強度 加熱加熱 熱變性與熱變性與TmDNA的變性過程的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此

12、，通常將紫外吸收的增加量區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將紫外吸收的增加量達(dá)最大量一半時的溫度稱達(dá)最大量一半時的溫度稱熔解溫度熔解溫度，用，用Tm表示。表示。（或者把加熱變性使（或者把加熱變性使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度稱為該半時的溫度稱為該 DNA的熔點或熔解溫度）。的熔點或熔解溫度）。一般一般DNA的的Tm值在值在82-95 C之間。之間。DNA的的Tm值大小與下列因素有關(guān)：值大小與下列因素有關(guān)：（1）DNA的均一性。均質(zhì)的均一性。均質(zhì)DNA，如一些病毒的如一些病毒的DNA，人工合成的人工合成的poly d(A-T),poly d(G-C)熔熔解過程發(fā)生在一個較小的范圍內(nèi)。

13、異質(zhì)解過程發(fā)生在一個較小的范圍內(nèi)。異質(zhì)DNA熔熔解的過程發(fā)生在一個較寬的范圍內(nèi)。所以解的過程發(fā)生在一個較寬的范圍內(nèi)。所以Tm 值可作為衡量值可作為衡量DNA樣品均一性的標(biāo)準(zhǔn)。樣品均一性的標(biāo)準(zhǔn)。（2）分子中）分子中G和和C的含量。的含量。 G和和C的含量高，的含量高，Tm值高值高。因而測定。因而測定Tm值，可值，可反映反映DNA分子中分子中G, C含量，可通過經(jīng)驗公式計含量，可通過經(jīng)驗公式計算：算：（G+C)%=(Tm -69.3) 2.44（3）介質(zhì)的離子強度。一般離子強度較低的介）介質(zhì)的離子強度。一般離子強度較低的介質(zhì)中，質(zhì)中，DNA的熔解溫度較低，而且溶解溫度的的熔解溫度較低，而且溶解溫度

14、的范圍較寬。范圍較寬。RNA的變性的變性：RNA也具有螺旋也具有螺旋 線團(tuán)線團(tuán)之間的轉(zhuǎn)變。但這種較變不如之間的轉(zhuǎn)變。但這種較變不如DNA明顯。明顯。變性曲線不陡，變性曲線不陡， Tm值較低。值較低。tRNA具有較具有較多的雙螺旋區(qū)，所以具有較高的多的雙螺旋區(qū)，所以具有較高的Tm值，值，變性曲線也較陡。變性曲線也較陡。 （二）復(fù)性（二）復(fù)性變性核酸的互補鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙變性核酸的互補鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性復(fù)性。DNADNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)，

15、具有般只能得到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)減色效應(yīng)。將熱變性的將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復(fù)性。不可能復(fù)性。變性的變性的DNA緩慢冷卻時可復(fù)性，因此又稱為緩慢冷卻時可復(fù)性，因此又稱為“退火退火”。 退火溫度退火溫度Tm25復(fù)性影響因素復(fù)性影響因素 片段濃度片段濃度/ /片段大小片段大小/ /片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）/ / 溶液離子強度溶液離子強度將熱變性的將熱變性的DNA驟然冷卻時，驟然冷卻時，DNA不可能復(fù)不可能復(fù)性性DNA的片段越大，復(fù)性越慢的片段越大，復(fù)性越慢DNA的濃度越大，復(fù)性越快的濃度越大，復(fù)性越快在一定條件下，復(fù)性反應(yīng)的

16、速度用在一定條件下，復(fù)性反應(yīng)的速度用Cot 1/2來衡來衡量，量，Co為變性為變性DNA復(fù)性時的初始濃度，復(fù)性時的初始濃度，t為時為時間，間， Cot 表示復(fù)性一半時的表示復(fù)性一半時的DNA濃度。濃度。兩種濃度相同但來源不同的兩種濃度相同但來源不同的DNA，復(fù)性時間的復(fù)性時間的長短與基因組的大小有關(guān)長短與基因組的大小有關(guān)有很多重復(fù)序列的有很多重復(fù)序列的DNA復(fù)性也快復(fù)性也快 （三）核酸的雜交三）核酸的雜交DNA單鏈與在某些區(qū)域有互補序列的異源單鏈與在某些區(qū)域有互補序列的異源DNA單鏈或單鏈或RNA鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。這樣形成的新分子稱為這樣形成的新分子稱為雜交雜交D

17、NA分子分子。核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。有重要意義。Southern 雜交（雜交（Southern bolting）Northern 雜交（雜交（Northern bolting）Western 雜交雜交 （Western bolting）核酸的雜交核酸的雜交核酸分子雜交的意義：核酸分子雜交的意義：發(fā)現(xiàn)原核生物的基因是連續(xù)基因，而真核生物發(fā)現(xiàn)原核生物的基因是連續(xù)基因，而真核生物的基因是斷裂基因。的基因是斷裂基因。連續(xù)基因連續(xù)基因：基因中的：基因中的bp序列能夠連續(xù)的在成熟序列能夠連續(xù)的在成熟的蛋白質(zhì)中找到其相應(yīng)的的蛋白質(zhì)中找到其

18、相應(yīng)的AA，電鏡顯示這種電鏡顯示這種基因能夠和它的成熟基因能夠和它的成熟mRNA形成平滑的雜交分形成平滑的雜交分子。子。斷裂基因斷裂基因：基因中的：基因中的bp序列能夠斷續(xù)的在成熟序列能夠斷續(xù)的在成熟的蛋白質(zhì)中找到其相應(yīng)的的蛋白質(zhì)中找到其相應(yīng)的AA，電鏡顯示這種電鏡顯示這種基因和它的成熟基因和它的成熟mRNA只能形成帶泡的雜交分只能形成帶泡的雜交分子。子。發(fā)現(xiàn)癌基因的普遍性發(fā)現(xiàn)癌基因的普遍性：腫瘤病毒的：腫瘤病毒的RNA能夠與能夠與人類正常的人類正常的DNA分子形成帶泡的雜交分子形成帶泡的雜交分子。核酸分子雜交的技術(shù)核酸分子雜交的技術(shù)Southern Blotting（南印跡）南印跡）：用于釣基因，即用已知：用于釣基因，即用已知的的DNA單鏈或單鏈或RNA，釣取未知釣取未知DNA分子中的基因，方分子中的基因，方法如下：法如下：未知的未知的DNA -DNA限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 DNA片段片段 瓊脂糖電泳分離瓊脂糖電泳分離 堿液變性堿液變性 影印在硝酸纖維薄影印在硝酸纖維薄膜上膜上 與放射性標(biāo)記的已知與放射性標(biāo)記的已知DNA單鏈或單鏈或RNA雜交雜交 放射自顯影放射自顯影Northern Blotting（北印跡）北印跡）：用已知的：用已知的D