第七章免疫組織化學(xué)技術(shù)

1、免疫組織化學(xué)技術(shù)Albert Hewett Coons（19121978）20世紀(jì)40年代Coons利用FITC標(biāo)記抗體成功地檢測(cè)了小鼠肺臟組織內(nèi)存在的肺炎雙球菌多糖抗原，標(biāo)志著免疫組化技術(shù)的誕生。 免疫組織化學(xué)技術(shù)（Immunohistochemistry） 免疫學(xué)技術(shù)與組織化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，它以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)，并結(jié)合化學(xué)的呈色反應(yīng)，最后在組織/細(xì)胞層面原位顯示跟蹤物質(zhì)的位置，綜合反映了靜態(tài)的組織細(xì)胞形態(tài)和組成以及動(dòng)態(tài)的機(jī)體功能代謝生理狀態(tài)。第九章 免疫組織化學(xué)技術(shù)第一節(jié) 免疫組織化學(xué)技術(shù)的類型第二節(jié) 免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程第九章 免疫組織化學(xué)技術(shù)第一節(jié) 免疫組織化學(xué)技術(shù)的類

2、型第二節(jié) 免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程免疫組織化學(xué)技術(shù)的類型1. 按標(biāo)記物的不同分類2. 按反應(yīng)方式的不同分類3. 按應(yīng)用方式不同分類 1按標(biāo)記物的不同分類（1）免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)（immunofluorescence cytochemistry）（2）免疫酶組織化學(xué)技術(shù)（immunoenzymatic cytochemistry）（3）免疫鐵蛋白組織化學(xué)技術(shù)（immunoferritin cytochemistry）（4）免疫膠體金組織化學(xué)技術(shù)（immuno-colloidal gold cytochemistry）（5）放射免疫組織化學(xué)技術(shù)（radio-immunocytochemistry

3、） 按反應(yīng)方式的不同分類（1）直接標(biāo)記法（direct labeling）（2）間接標(biāo)記法（indirect labeling）（3）抗體橋聯(lián)法（immunobridge）（4）抗酶抗體法（peroxidase - antiperoxidase）（5）半抗原夾心法（hapten sandwich）（6）葡萄球菌蛋白介導(dǎo)的免疫組織化學(xué)方法（protein A immunocytochemistry）（7）生物素-親合素系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫組織化學(xué)方法（biotin-avidin system cytochemistry）3按應(yīng)用方式不同分類（1）免疫電鏡組化技術(shù)（immunoelectromicros

4、copy cytochemistry）（2）雙標(biāo)記或多重染色組化技術(shù)（double labeling cytochemistry）（3）定量免疫組化技術(shù)（quantitative immunocytochemistry）（4）原位雜交與免疫組化技術(shù)（in site hybridization and immunocytochemistry）第九章 免疫組織化學(xué)技術(shù)第一節(jié) 免疫組織化學(xué)技術(shù)的類型第二節(jié) 免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程一、樣品的制備二、抗原抗體反應(yīng)三、化學(xué)呈色反應(yīng)四、免疫組織化學(xué)結(jié)果及其分析免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程一、樣品的制備二、抗原抗體反應(yīng)三、化學(xué)呈色反應(yīng)四、

5、免疫組織化學(xué)結(jié)果及其分析組織的取材 動(dòng)物標(biāo)本 手術(shù)活檢標(biāo)本 尸體解剖標(biāo)本 細(xì)胞標(biāo)本動(dòng)物的處死 空氣栓塞法 麻醉法 斷頭法 頸椎脫臼 股/頸動(dòng)脈放血法取材注意事項(xiàng) 迅速 干脆 注意保持組織的完整性和代表性活檢標(biāo)本 注意區(qū)別病變組織、邊緣組織和正常組織 腎穿刺標(biāo)本 小標(biāo)本細(xì)胞的取材（Drawing materials） 印片 穿刺涂片 體液沉淀涂片 培養(yǎng)細(xì)胞組織切片技術(shù) 冰凍切片 石蠟切片取材 固定 洗滌和脫水 透明 浸蠟 包埋 切片與粘片 烤片 脫蠟 水化 染色 封片 固定（Fixation）將組織置于某些化學(xué)試劑中，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)盡量接近于原始狀態(tài)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置。組織細(xì)胞的固定（Fixati

6、on） 要求：完整性、天然性、抗原性、便于后期操作 策略：快速脫水、阻斷酶活、保持抗原性 試劑：醛、醇、酮、酸 方法：浸泡法、灌流法、微波固定法抗原分類 不穩(wěn)定抗原細(xì)胞表面標(biāo)志 半穩(wěn)定抗原B細(xì)胞表面IgG 較穩(wěn)定抗原小分子蛋白，多肽類常用固定液 簡(jiǎn)單固定液福爾馬林（4%甲醛）、乙醇（80-95%）、氯化汞（5-7%）、苦味酸（0.9-1.2%）、重鉻酸鉀（1-3%）、鉻酸（0.5-1%）、鋨酸（1-2%）、丙酮混合固定液中性甲醛、乙醇甲醛、4%多聚甲醛-磷酸緩沖液、 4%多聚甲醛-氫氧化鈉、Carnoy液（冰醋酸、氯仿、乙醇）、Bouin液（苦味酸、甲醛、冰醋酸）、Zenker液（升汞、重鉻酸

7、鉀、蒸餾水、冰醋酸）、PLP（過(guò)碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛）固定劑選擇 血涂片：丙酮，福爾馬林（胞質(zhì)蛋白，BCR） 細(xì)胞涂片：95%乙醇、carbowax. 冰凍切片：乙醇、丙酮、多聚甲醛 石蠟切片：福爾馬林（需抗原修復(fù)）、氯化汞（胞漿蛋白）PLP/PLDP（糖類、脂類）、乙醇、丙酮固定方法 浸泡法 蒸汽法 注射、灌注法 微波固定注意事項(xiàng) 固定液的量 固定的條件（溫度、濃度、時(shí)間） 組織提取 組織塊的體積 固定后的清洗組織的脫水 目的：去除組織中的水分，便于后期的有機(jī)溶劑處理。 方法：有機(jī)溶劑逐級(jí)吸收 試劑：乙醇、丙酮、正丁醇、叔丁醇、環(huán)己酮、松脂醇組織的透明 目的：便于浸蠟包埋 方法：逐級(jí)浸泡

8、 試劑：二甲苯、甲苯、氯仿、香柏油、苯甲酸甲酯、苯胺油浸蠟、包埋 一般光學(xué)顯微鏡觀察的切片，用石蠟、火棉膠、炭蠟、明膠等作包埋劑； 電子顯微鏡則用環(huán)氧樹(shù)脂、聚苯乙烯樹(shù)脂、異丁烯樹(shù)脂及水溶性樹(shù)脂組織切片 載玻片處理 黏片劑明礬-明膠、多聚賴氨酸、樹(shù)脂、甲醛-明膠等免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程一、樣品的制備二、抗原抗體反應(yīng)三、化學(xué)呈色反應(yīng)四、免疫組織化學(xué)結(jié)果及其分析抗原抗體反應(yīng) 抗原的暴露和修復(fù) 酶消化技術(shù) 熱誘導(dǎo)修復(fù)技術(shù) 抗體孵育抗原修復(fù) 抗原修復(fù)緩沖液 0.01M TRIS-HCL Ph 1/10 胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶（細(xì)胞間抗原）、鏈霉蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶熱誘導(dǎo)修復(fù) 微波、滅菌鍋、蒸汽、

9、壓力鍋、水浴 70-100度（10-60min） 注意事項(xiàng)： 自然冷卻、避免蒸干、條件統(tǒng)一，結(jié)構(gòu)改變，適當(dāng)加入螯合劑免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程一、樣品的制備二、抗原抗體反應(yīng)三、化學(xué)呈色反應(yīng)四、免疫組織化學(xué)結(jié)果及其分析染色策略ABC PROCEDURE UTILIZING CATALYZED SIGNAL AMPLIFICATION (CSA)biotinyl-tyramide顯色系統(tǒng) DAB顯色液 AEC顯色液（顯色為紅色） Hanker-yater試劑（藍(lán)黑色） TMB顯色液（脂溶性，顯色為藍(lán)色）顯色效果的提高 蛋白酶消化 抗原修復(fù) 高敏感顯色方法的使用放射免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)

10、免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)免疫酶組織化學(xué)技術(shù)雙標(biāo)記或多重染色組化技術(shù)免疫電鏡組化技術(shù)原位雜交技術(shù)膀胱癌和癌旁組織上用ADAM12 T3反義探針檢測(cè)到陽(yáng)性雜交信號(hào)(C,D)，而正義探針在癌旁的正常組織中只見(jiàn)到很弱或陰性信號(hào)(E,F)。D和F分別是C和D的黑視野圖像。 免疫組化定量免疫組化技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程一、樣品的制備二、抗原抗體反應(yīng)三、化學(xué)呈色反應(yīng)四、免疫組織化學(xué)結(jié)果及其分析 染色對(duì)照 表達(dá)特異性 陰性結(jié)果判斷 出血、壞死、邊緣部位的判定 綜合評(píng)價(jià)染色結(jié)果四、免疫組織化學(xué)結(jié)果及其分析陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照陰性組織陰性試劑（無(wú)關(guān)抗體、反向吸收、抑制試驗(yàn)）自身對(duì)照對(duì)照的設(shè)定非特異性染色 組織內(nèi)源性干

11、擾 標(biāo)記物干擾 抗體干擾 組織處理不當(dāng)組織內(nèi)源性干擾 自發(fā)和誘發(fā)熒光 膠原纖維和彈力纖維藍(lán)綠色 軟骨和角蛋白呈黃綠色 脂褐素呈棕黃色 甲醛固定后的腎上腺素，5羥色胺組織內(nèi)源性干擾 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶 內(nèi)源性生物素標(biāo)記物干擾 熒光素（F/P2） HRP（RZ3） 親和素（優(yōu)先使用鏈霉親和素）抗體干擾 抗體的非特異吸附 免疫原的交叉反應(yīng) IgG之間的交叉反應(yīng) 天然抗體交叉反應(yīng)組織處理不當(dāng) 血清及分泌性抗原干擾 組織固定不及時(shí) 流程操作不規(guī)范非特異性熒光的消除 襯染法（伊文思藍(lán)抑制自發(fā)熒光） 熒光抗體（純化） 胰蛋白酶消化 吸收 血清孵育 雙重標(biāo)記 提高抗體質(zhì)量非特異性染色的消除 抗體特異性不好：提高

12、免疫抗原純度，組織吸收，采用單克隆抗體 連接抗體：提高二抗純度 酶標(biāo)抗體：避免Fc受體的結(jié)合，醛基的著色 DAB：含有雜質(zhì)及沉淀 抗體濃度： 結(jié)締組織假陰性結(jié)果 試劑缺少 二抗不匹配 抗體失效 抗體濃度過(guò)低 抗體干涸 抗原修復(fù)失敗 酶處理時(shí)間太長(zhǎng) 染色時(shí)間過(guò)短，酶活性小 疊氮化鈉抑制HRP 顯色液失效 顯色緩沖液沖突 陽(yáng)性對(duì)照錯(cuò)誤陽(yáng)性不強(qiáng) 固定不當(dāng) 抗體反復(fù)凍融 抗體濃度過(guò)低 緩沖液殘留過(guò)多 抗原修復(fù)不徹底 底物失效 顯色時(shí)間過(guò)短，疊氮化鈉干擾 緩沖液不匹配 復(fù)染、脫水、封片劑與顯色系統(tǒng)的干擾 抗原表達(dá)少 染色過(guò)強(qiáng) 抗體濃度過(guò)高 顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 組織封閉效果不好 洗滌時(shí)間及次數(shù)不夠 過(guò)氧化氫阻斷不足切片上的雜質(zhì) 洗滌不徹底 DAB析出 二甲苯不及時(shí)更換 固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 燃料沉淀抗原未按預(yù)期表達(dá) 封閉不當(dāng) 一抗過(guò)高 二抗交叉反應(yīng) 蛋白酶消化過(guò)度 抗原熱修復(fù)過(guò)度弱假陽(yáng)性 切片干涸 抗體過(guò)高 時(shí)間