發(fā)酵工業(yè)菌種

1、第第2 2章章 發(fā)酵工業(yè)菌種發(fā)酵工業(yè)菌種北京科技大學(xué)北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院生物科學(xué)與工程系生物科學(xué)與工程系發(fā)酵工程2.1 2.1 發(fā)酵工業(yè)菌種概述發(fā)酵工業(yè)菌種概述常用的四大類可培養(yǎng)微生物常用的四大類可培養(yǎng)微生物細(xì)菌細(xì)菌 bacteria (枯草芽孢桿菌、醋酸桿菌、棒狀桿菌、短桿菌等枯草芽孢桿菌、醋酸桿菌、棒狀桿菌、短桿菌等)放線菌放線菌 actinomycetes (鏈霉菌、小單孢菌、諾卡菌等鏈霉菌、小單孢菌、諾卡菌等)酵母菌酵母菌 yeast (啤酒酵母、假絲酵母、類酵母等啤酒酵母、假絲酵母、類酵母等)霉菌霉菌 mould (根霉、毛酶、曲霉等根霉、毛酶、曲霉等)未

2、培養(yǎng)微生物未培養(yǎng)微生物（Uncultured microorganisms） 迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離及培養(yǎng)方法還未迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離及培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物。約占自然環(huán)境微生物群落的獲得純培養(yǎng)的微生物。約占自然環(huán)境微生物群落的99%。 （1）模擬自然培養(yǎng)法；（）模擬自然培養(yǎng)法；（2）宏基因組分析法）宏基因組分析法巨大的應(yīng)用潛力！巨大的應(yīng)用潛力！主要應(yīng)用于基因工程菌種方面主要應(yīng)用于基因工程菌種方面http:/ 2.2 發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選獲得適合工業(yè)發(fā)酵所需菌種的途徑：獲得適合工業(yè)發(fā)酵所需菌種的途徑：從菌種保存機(jī)構(gòu)直接購買從菌種保存機(jī)構(gòu)直接購買中國

3、微生物菌種保藏管理委員會(huì)（中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)（CCCCM）美國典型菌種保藏中心（美國典型菌種保藏中心（ATCC）英國國家典型菌種保藏所（英國國家典型菌種保藏所（NCTC）日本大阪發(fā)酵研究所（日本大阪發(fā)酵研究所（IFO）從自然界分離篩選從自然界分離篩選從生產(chǎn)過程中發(fā)酵水平高的批號中重新進(jìn)行分離從生產(chǎn)過程中發(fā)酵水平高的批號中重新進(jìn)行分離篩選篩選基因工程方法構(gòu)建基因工程方法構(gòu)建2.2 2.2 發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選2.2.1 樣品的采集樣品的采集產(chǎn)物是什么？產(chǎn)物是什么？ 培養(yǎng)底物條件、產(chǎn)物特性培養(yǎng)底物條件、產(chǎn)物特性什么類別的菌？什么類別的菌？生長環(huán)境、耐受性、營養(yǎng)條件

4、生長環(huán)境、耐受性、營養(yǎng)條件2.2 2.2 發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選海底黑煙囪1、樣品的來源：以采集土壤為主。一般耕地、菜園和近郊、樣品的來源：以采集土壤為主。一般耕地、菜園和近郊土壤中有機(jī)質(zhì)豐富，土壤通氣保水性好，以細(xì)菌和放線菌土壤中有機(jī)質(zhì)豐富，土壤通氣保水性好，以細(xì)菌和放線菌為主；山坡上的森林土壤含有大量腐爛的植物枝葉，有機(jī)為主；山坡上的森林土壤含有大量腐爛的植物枝葉，有機(jī)質(zhì)豐富，陰暗潮濕，酵母和霉菌較多。質(zhì)豐富，陰暗潮濕，酵母和霉菌較多。525cm土層的微土層的微生物數(shù)量最多。生物數(shù)量最多。2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的

5、秋初為好。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小鏟子除去表土，取、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小鏟子除去表土，取離地面離地面5-15cm處的土約處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。以備查考。2.2.2 樣品的預(yù)處理樣品的預(yù)處理（1）物理方法）物理方法熱處理、膜過濾法和離心法熱處理、膜過濾法和離心法熱處理減少細(xì)菌數(shù)，以分離耐熱的放線菌繁殖體、孢子和菌絲片段。熱處理減少細(xì)菌數(shù)，以分離耐熱的放線菌繁殖體、孢子和菌絲片段。膜過濾法和離心法用于濃縮水中微生物細(xì)胞。膜

6、過濾法和離心法用于濃縮水中微生物細(xì)胞。（2）化學(xué)方法）化學(xué)方法 添加某些化學(xué)成分以增加特定微生物的數(shù)量。添加某些化學(xué)成分以增加特定微生物的數(shù)量。 如：添加幾丁質(zhì)的培養(yǎng)基用來分離放線菌；添加碳酸鈣穩(wěn)定培養(yǎng)基如：添加幾丁質(zhì)的培養(yǎng)基用來分離放線菌；添加碳酸鈣穩(wěn)定培養(yǎng)基的的pH來分離嗜堿性的放線菌。來分離嗜堿性的放線菌。（3）誘餌法）誘餌法 將某些固體物質(zhì)，如石蠟、花粉、蛇皮、毛發(fā)等，加到待分離的土將某些固體物質(zhì)，如石蠟、花粉、蛇皮、毛發(fā)等，加到待分離的土壤或水中做成誘餌富集目的菌，待菌落長出后再進(jìn)行平板分離。壤或水中做成誘餌富集目的菌，待菌落長出后再進(jìn)行平板分離。2.2 2.2 發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩

7、選發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選2.2.3 富集培養(yǎng)富集培養(yǎng) 為提高分離效率，可以根據(jù)微生物的生長繁殖對環(huán)境和營養(yǎng)要求為提高分離效率，可以根據(jù)微生物的生長繁殖對環(huán)境和營養(yǎng)要求（溫度、（溫度、pH、滲透壓、碳源和氮源類型及濃度等）的不同，使目的微、滲透壓、碳源和氮源類型及濃度等）的不同，使目的微生物在最適條件下迅速生長繁殖，數(shù)量增加，成為人工環(huán)境下的優(yōu)勢生物在最適條件下迅速生長繁殖，數(shù)量增加，成為人工環(huán)境下的優(yōu)勢菌種。菌種。（1）控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分）控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分 可加入相應(yīng)底物作為唯一碳源或氮源可加入相應(yīng)底物作為唯一碳源或氮源 能在同一富集培養(yǎng)基上長的菌并非單一菌種，而是營養(yǎng)類型相同的能在同一

8、富集培養(yǎng)基上長的菌并非單一菌種，而是營養(yǎng)類型相同的微生物群體，需進(jìn)一步分離。微生物群體，需進(jìn)一步分離。（2）控制培養(yǎng)條件）控制培養(yǎng)條件 控制溶解氧濃度分離好氧或厭氧菌；高溫培養(yǎng)分離嗜熱菌；控制控制溶解氧濃度分離好氧或厭氧菌；高溫培養(yǎng)分離嗜熱菌；控制pH分離嗜酸或嗜堿菌；高糖或高鹽培養(yǎng)基以分離耐高滲菌種；抗生素分離嗜酸或嗜堿菌；高糖或高鹽培養(yǎng)基以分離耐高滲菌種；抗生素以篩選具有相應(yīng)抗性的菌株。以篩選具有相應(yīng)抗性的菌株。2.2 2.2 發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選 分批培養(yǎng)分批培養(yǎng) 所選條件對目的菌較適宜。目的菌的生長可能改變培養(yǎng)基的性質(zhì)，所選條件對目的菌較適宜。目的菌的生長可能改

9、變培養(yǎng)基的性質(zhì)，使其他菌也能生長，可轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基中重建選擇壓力，進(jìn)行多次使其他菌也能生長，可轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基中重建選擇壓力，進(jìn)行多次富集培養(yǎng)。富集培養(yǎng)。 連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng) 利用比生長速率進(jìn)行富集利用比生長速率進(jìn)行富集 Monod方程方程SKSsmax基質(zhì)濃度SS0比生長速率 Chemostat 恒化培養(yǎng)器2.2.4 菌種分離菌種分離（1）平板劃線分離法）平板劃線分離法分離得到單個(gè)細(xì)胞長成的菌落分離得到單個(gè)細(xì)胞長成的菌落簡單、較快簡單、較快2.2 2.2 發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選（a）扇形劃線法 （b）連續(xù)劃線法 （c）方格劃線法 （d）平行劃線法（2）稀釋分離法）稀釋分離法

10、 單菌落分布均勻，獲得純種概率大，特別適合分離具單菌落分布均勻，獲得純種概率大，特別適合分離具有蔓延性的微生物。有蔓延性的微生物。無菌水10-110-210-610-510-410-3固體培養(yǎng)各種微生物形成的菌落特征固體培養(yǎng)各種微生物形成的菌落特征 http:/ 2.2.5 菌種初篩和復(fù)篩菌種初篩和復(fù)篩初篩初篩（1）平板篩選）平板篩選 將復(fù)雜而費(fèi)時(shí)的化學(xué)測定轉(zhuǎn)變?yōu)槠矫笊先庋劭梢姷娘@色將復(fù)雜而費(fèi)時(shí)的化學(xué)測定轉(zhuǎn)變?yōu)槠矫笊先庋劭梢姷娘@色反應(yīng)，能大幅提高篩選效率，減少工作量。反應(yīng)，能大幅提高篩選效率，減少工作量。（2）搖瓶發(fā)酵篩選）搖瓶發(fā)酵篩選 搖瓶培養(yǎng)更接近發(fā)酵罐培養(yǎng)條件，因此篩選出的菌株易搖瓶培養(yǎng)

11、更接近發(fā)酵罐培養(yǎng)條件，因此篩選出的菌株易于擴(kuò)大培養(yǎng)。于擴(kuò)大培養(yǎng)。2.2 2.2 發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選http:/ tubeMicro well culture plateShaking flaskGraphs from web2.2.5 菌種初篩和復(fù)篩菌種初篩和復(fù)篩復(fù)篩復(fù)篩 在初篩的基礎(chǔ)上進(jìn)一步鑒定菌株生產(chǎn)能力，一般采用在初篩的基礎(chǔ)上進(jìn)一步鑒定菌株生產(chǎn)能力，一般采用搖瓶培養(yǎng)，一個(gè)菌株重復(fù)搖瓶培養(yǎng)，一個(gè)菌株重復(fù)35瓶。瓶。 需采用精確的分析方法測定（定性和定量）。需采用精確的分析方法測定（定性和定量）。 2.2 2.2 發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選樣品重復(fù)

12、平均值定量定性分析，如HPLC，GC，MS，NMR2.2.5 2.2.5 菌種初篩和復(fù)篩菌種初篩和復(fù)篩2.2 2.2 發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選菌落菌落自動(dòng)挑取、培養(yǎng)、檢測自動(dòng)挑取、培養(yǎng)、檢測http:/ and picks up to 30000 microbial colonies per dayThis robot is used to pick colonies from agar plates into 96 or 384 well culture plates. http:/www.icr.ac.uk/ncri/coreresources/cancer_gene_

13、cloning.htmlhttp:/ microfluidic technology for single-cell high-throughput screeningMutagenesisMutant librarySpecially designed chipdropletsFor further cultivation and screeningDroplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screeningBrouzesa et al. cgidoi10.1073pnas.0903

14、542106Edwards et al. Analyst, 2013, 138, 339345Teh et al. BIOMICROFLUIDICS 5, 044113 (2011)Agresti et al. PNAS, 2010, 107(9):4004-4009Guo et al. Lab Chip, 2012, 12, 21462155Ultra-high-throughput screening2.3.1 2.3.1 經(jīng)典的分類鑒定方法經(jīng)典的分類鑒定方法（1 1）形態(tài)學(xué)特征）形態(tài)學(xué)特征 菌落特征、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞大小、細(xì)胞排列、特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、染色菌落特征、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞大小、細(xì)胞排列

15、、特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、染色反應(yīng)等。反應(yīng)等。（2 2）生理生化特征）生理生化特征 營養(yǎng)類型、對氮源的利用能力、對碳源的利用能力、對生長因子的需營養(yǎng)類型、對氮源的利用能力、對碳源的利用能力、對生長因子的需要、需氧性；對溫度、要、需氧性；對溫度、pHpH、滲透壓的適應(yīng)性；對抗生素及抑菌劑的敏感性；代、滲透壓的適應(yīng)性；對抗生素及抑菌劑的敏感性；代謝產(chǎn)物及其與宿主的關(guān)系等。謝產(chǎn)物及其與宿主的關(guān)系等。（3 3）血清學(xué)試驗(yàn)與噬菌體分型）血清學(xué)試驗(yàn)與噬菌體分型 不同細(xì)菌和病毒帶有不同的蛋白質(zhì)、脂蛋白、脂多糖等抗原性物質(zhì)，不同細(xì)菌和病毒帶有不同的蛋白質(zhì)、脂蛋白、脂多糖等抗原性物質(zhì)，可在生物體外進(jìn)行不同微生物之間抗原

16、和抗體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)可在生物體外進(jìn)行不同微生物之間抗原和抗體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)來進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)來進(jìn)行微生物的分類和鑒定。微生物的分類和鑒定。（4 4）氨基酸順序和蛋白質(zhì)分析）氨基酸順序和蛋白質(zhì)分析 通過對某些同源蛋白質(zhì)氨基酸序列的比較來分析不同生物系統(tǒng)發(fā)育的通過對某些同源蛋白質(zhì)氨基酸序列的比較來分析不同生物系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系，序列相似性越高，其親緣關(guān)系越近。關(guān)系，序列相似性越高，其親緣關(guān)系越近。2.3 2.3 發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定http:/ 現(xiàn)代分類鑒定方法現(xiàn)代分類鑒定方法微生物遺傳型的鑒定微生物遺傳型的鑒定（1）DNA的堿基組成的堿基組成 DNA堿基組成是各種生物一個(gè)穩(wěn)定的特征，不受菌齡

17、堿基組成是各種生物一個(gè)穩(wěn)定的特征，不受菌齡以及突變因素以外的外界因素的影響，即使個(gè)別基因突變，以及突變因素以外的外界因素的影響，即使個(gè)別基因突變，也不會(huì)有明顯變化。也不會(huì)有明顯變化。 用（用（G+C） 占全部堿基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（占全部堿基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（G+C）%來表示來表示（2）核酸的分子雜交）核酸的分子雜交（3）遺傳重組特性分析）遺傳重組特性分析2.3 2.3 發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定2.3.2 現(xiàn)代分類鑒定方法現(xiàn)代分類鑒定方法微生物遺傳型的鑒定微生物遺傳型的鑒定（4）rRNA序列分析序列分析 通過比較原核生物通過比較原核生物16SrRNA和真核生物的和真核生物的18SrRNA的的基因序列

18、，從序列差異計(jì)算它們之間的進(jìn)化距離，可以繪基因序列，從序列差異計(jì)算它們之間的進(jìn)化距離，可以繪出生物進(jìn)化樹。出生物進(jìn)化樹。2.3 2.3 發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定sequencing16SrRNA amplification by PCR2.3.2 現(xiàn)代分類鑒定方法現(xiàn)代分類鑒定方法細(xì)胞化學(xué)成分特征分類法細(xì)胞化學(xué)成分特征分類法常用于細(xì)菌分類的細(xì)胞成分常用于細(xì)菌分類的細(xì)胞成分細(xì)胞壁的化學(xué)組分及分枝菌酸分析細(xì)胞壁的化學(xué)組分及分枝菌酸分析全細(xì)胞水解液的糖型全細(xì)胞水解液的糖型脂肪酸組成及磷脂成分分析脂肪酸組成及磷脂成分分析醌類及多胺類的分析醌類及多胺類的分析可溶性蛋白的質(zhì)譜分析可溶性蛋白的質(zhì)譜分析

19、數(shù)值分類法（統(tǒng)計(jì)分類法）數(shù)值分類法（統(tǒng)計(jì)分類法）2.3 2.3 發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定2.3.3 將菌種直接送到權(quán)威鑒定機(jī)構(gòu)鑒定將菌種直接送到權(quán)威鑒定機(jī)構(gòu)鑒定中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)（China Committee of Culture Collection for Microorganisms, CCCCM), http:/ ）中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)中國典型培養(yǎng)物保藏中心中國典型培養(yǎng)物保藏中心中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 /美國典型培

20、養(yǎng)物保藏中心（美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）/英國國家典型培養(yǎng)物保藏中心英國國家典型培養(yǎng)物保藏中心法國巴斯德研究所菌種保藏中心法國巴斯德研究所菌種保藏中心德國科赫研究所菌種保藏中心德國科赫研究所菌種保藏中心 細(xì)菌學(xué)期刊（細(xì)菌學(xué)期刊（Journal of Bacteriology）是國際公認(rèn)的微是國際公認(rèn)的微生物分類學(xué)方面的權(quán)威期刊，所有新鑒定的微生物菌種必生物分類學(xué)方面的權(quán)威期刊，所有新鑒定的微生物菌種必須在此期刊發(fā)表才能被認(rèn)可。須在此期刊發(fā)表才能被認(rèn)可。2.3 2.3 發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定菌種選育改良的具體目標(biāo)菌種選育改良的具體目標(biāo)提高目標(biāo)

21、產(chǎn)物的產(chǎn)量提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量 生產(chǎn)效率和效益！生產(chǎn)效率和效益！提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物 可有效降低產(chǎn)物分離成本?？捎行Ы档彤a(chǎn)物分離成本。改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程 改變和擴(kuò)大菌種所利用的原料范圍、提高菌種生長速率、改變和擴(kuò)大菌種所利用的原料范圍、提高菌種生長速率、保持菌株生產(chǎn)性狀穩(wěn)定、提高斜面孢子產(chǎn)量、改善對氧保持菌株生產(chǎn)性狀穩(wěn)定、提高斜面孢子產(chǎn)量、改善對氧的攝取條件并降低需氧量及能耗、增強(qiáng)耐不良環(huán)境的能的攝取條件并降低需氧量及能耗、增強(qiáng)耐不良環(huán)境的能力（如耐高溫、耐酸堿、耐自身所積累的過量代謝產(chǎn)力（如耐高溫、耐酸堿、耐自身所積累的

22、過量代謝產(chǎn)物）、改善細(xì)胞透性以提高產(chǎn)物的分泌能力等。物）、改善細(xì)胞透性以提高產(chǎn)物的分泌能力等。改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品2.4 2.4 發(fā)酵工業(yè)菌種改良發(fā)酵工業(yè)菌種改良2.4.1 菌種代謝生理與分子生物學(xué)菌種代謝生理與分子生物學(xué) 育種的目的就是采用各種手段獲得代謝調(diào)節(jié)機(jī)制不育種的目的就是采用各種手段獲得代謝調(diào)節(jié)機(jī)制不完善的高產(chǎn)菌株，使之過量積累人們所需的目標(biāo)產(chǎn)物。完善的高產(chǎn)菌株，使之過量積累人們所需的目標(biāo)產(chǎn)物。2.4 2.4 發(fā)酵工業(yè)菌種改良發(fā)酵工業(yè)菌種改良鵝肥肝 http:/ PHB占細(xì)胞干重 90%www.answersingenesis.or

23、g/articles/am/v3/n3/matrix 普通大腸桿菌形態(tài)2.4.1 菌種代謝生理與分子生物學(xué)菌種代謝生理與分子生物學(xué)初級代謝：微生物產(chǎn)生的對自身生長和繁殖必需的初級代謝：微生物產(chǎn)生的對自身生長和繁殖必需的物質(zhì)。物質(zhì)。次級代謝：非生長所必需，但可能對菌的生存有作次級代謝：非生長所必需，但可能對菌的生存有作用，其合成與初級代謝產(chǎn)物合成途徑密切用，其合成與初級代謝產(chǎn)物合成途徑密切相關(guān)。相關(guān)。2.4 2.4 發(fā)酵工業(yè)菌種改良發(fā)酵工業(yè)菌種改良（1 1）酶合成的調(diào)節(jié)）酶合成的調(diào)節(jié)通過調(diào)節(jié)酶的合成量進(jìn)而調(diào)節(jié)代謝速率的機(jī)制。通過調(diào)節(jié)酶的合成量進(jìn)而調(diào)節(jié)代謝速率的機(jī)制。 誘導(dǎo)誘導(dǎo)：初次代謝產(chǎn)物合成與

24、組成型酶的活性有關(guān)，次級代：初次代謝產(chǎn)物合成與組成型酶的活性有關(guān)，次級代謝產(chǎn)物則與誘導(dǎo)型酶的表達(dá)有關(guān)謝產(chǎn)物則與誘導(dǎo)型酶的表達(dá)有關(guān) 阻遏阻遏：有利于生物體節(jié)省有限養(yǎng)料和能量。葡萄糖效應(yīng)：有利于生物體節(jié)省有限養(yǎng)料和能量。葡萄糖效應(yīng)（2 2）酶活性的調(diào)節(jié)）酶活性的調(diào)節(jié)以酶分子的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，在酶分子水平上進(jìn)行的代謝調(diào)節(jié)。以酶分子的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，在酶分子水平上進(jìn)行的代謝調(diào)節(jié)。前體激活前體激活：分解代謝途徑中，后面的反應(yīng)可被前面的中間：分解代謝途徑中，后面的反應(yīng)可被前面的中間產(chǎn)物所促進(jìn)產(chǎn)物所促進(jìn) 反饋抑制反饋抑制：代謝途徑的末端產(chǎn)物過量時(shí)，該產(chǎn)物可反過來：代謝途徑的末端產(chǎn)物過量時(shí)，該產(chǎn)物可反過來直接抑制該途

25、徑和分支途徑中第一個(gè)酶的活性，促使整個(gè)直接抑制該途徑和分支途徑中第一個(gè)酶的活性，促使整個(gè)反應(yīng)過程減慢甚至停止反應(yīng)過程減慢甚至停止代謝調(diào)控機(jī)制代謝調(diào)控機(jī)制2.4.2 2.4.2 常規(guī)育種常規(guī)育種 包括誘變和篩選，是最常用的菌種改良手段。其理論基礎(chǔ)包括誘變和篩選，是最常用的菌種改良手段。其理論基礎(chǔ)是基因突變。關(guān)鍵是用物理、化學(xué)或生物的方法修改目的是基因突變。關(guān)鍵是用物理、化學(xué)或生物的方法修改目的微生物的基因組（微生物的基因組（genomegenome），產(chǎn)生突變型。微生物的自發(fā)），產(chǎn)生突變型。微生物的自發(fā)突變頻率在突變頻率在1010-8-81010-5-5之間，經(jīng)誘變劑處理微生物細(xì)胞后，之間，經(jīng)誘

26、變劑處理微生物細(xì)胞后，可達(dá)到可達(dá)到1010-6-61010-3-3。常用誘變劑常用誘變劑物理：紫外線、微波物理：紫外線、微波化學(xué)：化學(xué)：NTGNTG（N-N-甲基甲基-N-N- -硝基硝基-N-N-亞硝基胍）、氯化鋰、羥亞硝基胍）、氯化鋰、羥胺（胺（NHNH2 2OHOH）生物：噬菌體、質(zhì)粒、生物：噬菌體、質(zhì)粒、DNADNA轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子2.4 2.4 發(fā)酵工業(yè)菌種改良發(fā)酵工業(yè)菌種改良2.4.2 2.4.2 常規(guī)育種常規(guī)育種誘變育種中需考慮的因素誘變育種中需考慮的因素（1 1）選擇合適的出發(fā)菌株）選擇合適的出發(fā)菌株產(chǎn)量高、對誘變劑敏感性大、變異幅度廣。產(chǎn)量高、對誘變劑敏感性大、變異幅度廣。需對其

27、產(chǎn)量、形態(tài)、生理等有足夠了解。需對其產(chǎn)量、形態(tài)、生理等有足夠了解。（2 2）復(fù)合誘變劑的使用）復(fù)合誘變劑的使用不同誘變劑致變機(jī)理不同。尤其對已經(jīng)誘變過的老菌種可考慮。不同誘變劑致變機(jī)理不同。尤其對已經(jīng)誘變過的老菌種可考慮。（3 3）誘變劑量的選擇）誘變劑量的選擇致死率與誘變率之間有一定關(guān)系。致死率與誘變率之間有一定關(guān)系。（4 4）變異菌株的篩選）變異菌株的篩選從菌落形態(tài)變異類型著手，發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)量和其他優(yōu)良特性相關(guān)的特征。從菌落形態(tài)變異類型著手，發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)量和其他優(yōu)良特性相關(guān)的特征。2.4 2.4 發(fā)酵工業(yè)菌種改良發(fā)酵工業(yè)菌種改良2.4.2 2.4.2 常規(guī)育種常規(guī)育種篩選方法篩選方法 至關(guān)重要！至

28、關(guān)重要?。? 1）平皿快速檢測法）平皿快速檢測法 肉眼可觀察的變化。顯色法、變色圈法、透明圈法、肉眼可觀察的變化。顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法生長圈法和抑制圈法（2 2）形態(tài)變異的利用）形態(tài)變異的利用（3 3）高通量篩選）高通量篩選(high throughput screening)(high throughput screening)2.4 2.4 發(fā)酵工業(yè)菌種改良發(fā)酵工業(yè)菌種改良2.4.3 2.4.3 細(xì)胞工程育種細(xì)胞工程育種 包括雜交育種和原生質(zhì)體融合育種，其特點(diǎn)是在細(xì)胞水平包括雜交育種和原生質(zhì)體融合育種，其特點(diǎn)是在細(xì)胞水平上對菌種進(jìn)行操作，采用雜交、接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)

29、等遺傳上對菌種進(jìn)行操作，采用雜交、接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等遺傳學(xué)方法，將不同菌種的遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換、重組，使不同學(xué)方法，將不同菌種的遺傳物質(zhì)進(jìn)行交換、重組，使不同菌種的優(yōu)良性狀集中在重組體中，從而提高產(chǎn)量。菌種的優(yōu)良性狀集中在重組體中，從而提高產(chǎn)量。雜交育種雜交育種 應(yīng)有適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記（如營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、抗性標(biāo)記、應(yīng)有適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記（如營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、抗性標(biāo)記、溫度敏感型標(biāo)記等）以篩選重組體。溫度敏感型標(biāo)記等）以篩選重組體。原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合 細(xì)胞壁的處理細(xì)胞壁的處理2.4 2.4 發(fā)酵工業(yè)菌種改良發(fā)酵工業(yè)菌種改良2.4.4 2.4.4 基于代謝調(diào)節(jié)的育種技術(shù)基于代謝調(diào)節(jié)的育種技術(shù) 通過對特定

30、突變型的選育，達(dá)到改變代謝通路、降低支路通過對特定突變型的選育，達(dá)到改變代謝通路、降低支路代謝終產(chǎn)物的生產(chǎn)或切斷支路代謝途徑以及提高細(xì)胞膜的代謝終產(chǎn)物的生產(chǎn)或切斷支路代謝途徑以及提高細(xì)胞膜的透性，使代謝流向目的產(chǎn)物積累的方向進(jìn)行。透性，使代謝流向目的產(chǎn)物積累的方向進(jìn)行。組成型突變株的選育組成型突變株的選育抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育營養(yǎng)缺陷型突變株的選育與應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型突變株的選育與應(yīng)用抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育細(xì)胞膜透性突變株的選育細(xì)胞膜透性突變株的選育2.4 2.4 發(fā)酵工業(yè)菌種改良發(fā)酵工業(yè)菌種改良2.4.5 2.4.5 基因工程育種基因工程育種（蛋白質(zhì)工

31、程育種、組合生物（蛋白質(zhì)工程育種、組合生物合成育種、反向生物工程育種）合成育種、反向生物工程育種） 以細(xì)胞外進(jìn)行以細(xì)胞外進(jìn)行DNADNA拼接、重組技術(shù)為基礎(chǔ)的基因工程，拼接、重組技術(shù)為基礎(chǔ)的基因工程，是以人們可控制的方式來分離和操作特定的基因?？梢詣?chuàng)是以人們可控制的方式來分離和操作特定的基因?？梢詣?chuàng)造新的物種，能賦予微生物新的機(jī)能，使其生產(chǎn)出原本不造新的物種，能賦予微生物新的機(jī)能，使其生產(chǎn)出原本不能合成的新物質(zhì)，或增強(qiáng)其原有的合成能力。能合成的新物質(zhì)，或增強(qiáng)其原有的合成能力。2.4 2.4 發(fā)酵工業(yè)菌種改良發(fā)酵工業(yè)菌種改良人造細(xì)胞的出現(xiàn)人造細(xì)胞的出現(xiàn)

32、/wiki/Mycoplasma_laboratorium/wiki/Craig_VenterJohn Craig Venter 大腸桿菌代謝工程大腸桿菌代謝工程 基因敲入基因敲入knock in 基因敲除基因敲除knockout 啟動(dòng)子改造啟動(dòng)子改造 RNA聚合酶改造聚合酶改造 MIT Stephanopoulos groupReferenceAlper H and Stephanopoulos G. Metab Eng 2007Nevoigt E, & Stephanopoulos G. Biotechnol Bioeng 2007Alper H

33、, & Stephanopoulos G. Appl Microbiol Biotechnol 2006Alper H, & Stephanopoulos G. PNAS 2005 /Synthetic Biology is A) the design and construction of new biological parts, devices, and systems, andB) the re-design of existing, natural biological systems for useful purposes. 合成

34、生物學(xué)番茄紅素番茄紅素 lycopene酶的普遍特點(diǎn)酶的普遍特點(diǎn)1 1、催化效率高、催化效率高2 2、特異性高、特異性高3 3、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)條件溫和 水溶液中反應(yīng)，常溫，常壓，水溶液中反應(yīng)，常溫，常壓，pHpH中性中性基因工程菌生產(chǎn)重組酶基因工程菌生產(chǎn)重組酶如果對自然界中的酶還不滿意？如果對自然界中的酶還不滿意？Novozyme已有超過已有超過80%的酶是由基因工程菌株生產(chǎn)！的酶是由基因工程菌株生產(chǎn)！重組酶的制造過程 重組酶的表達(dá)重組酶的表達(dá)目的基因目的基因0.00.51.01.52.00102030? ? ( U/mL)? ?OD 600合適的宿主合適的宿主合適的質(zhì)粒合適的質(zhì)粒 +通過

35、基因的改變對酶分子進(jìn)行改造通過基因的改變對酶分子進(jìn)行改造酶分子的改造 理性設(shè)計(jì)理性設(shè)計(jì) 有針對性的改造有針對性的改造 定點(diǎn)突變、融合蛋白定點(diǎn)突變、融合蛋白 定向進(jìn)化定向進(jìn)化 隨機(jī)突變隨機(jī)突變+定向選擇定向選擇 易錯(cuò)易錯(cuò)PCR、DNA改組改組Directed evolutionRational designSite-directed mutagenesisError-prone PCR酶分子定向進(jìn)化技術(shù)酶分子定向進(jìn)化技術(shù)定向進(jìn)化定向進(jìn)化 自然進(jìn)化的模擬自然進(jìn)化的模擬隨機(jī)突變定向選擇隨機(jī)突變定向選擇酶酶 ？自然進(jìn)化自然進(jìn)化Molecular directed evolution編碼目標(biāo)酶的基因易錯(cuò)

36、PCR (Error-Prone PCR)構(gòu)建許多突變基因?qū)⑦@些混合基因轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主如E. coli選擇單菌落，每一菌落含有各不相同的突變基因測定酶活看特性是否有改進(jìn)選擇最佳者再進(jìn)行下一輪的突變過程改性酶易錯(cuò)易錯(cuò)PCR易錯(cuò)易錯(cuò)PCR易錯(cuò)易錯(cuò)PCR 是一種簡單、快速、廉價(jià)的隨機(jī)突變方法是一種簡單、快速、廉價(jià)的隨機(jī)突變方法 其宗旨就是使其宗旨就是使PCR過程易于出錯(cuò)！過程易于出錯(cuò)！ Taq DNA酶的聚合出錯(cuò)率較高（酶的聚合出錯(cuò)率較高（2.1X10-4），因?yàn)樗鼪]有），因?yàn)樗鼪]有35的的核的的核酸外切酶活性和校正功能。然而通過優(yōu)化反應(yīng)條件，可使酸外切酶活性和校正功能。然而通過優(yōu)化反應(yīng)條件，可使Ta

37、q酶的聚合酶的聚合出錯(cuò)率降低到原來的出錯(cuò)率降低到原來的1/3。Taq DNA聚合酶催化的聚合反應(yīng)的普遍錯(cuò)誤類聚合酶催化的聚合反應(yīng)的普遍錯(cuò)誤類型是由型是由AT轉(zhuǎn)換為轉(zhuǎn)換為GC；如果模板；如果模板DNA具有形成二級結(jié)構(gòu)的可能性，則具有形成二級結(jié)構(gòu)的可能性，則Taq DNA酶還常常導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的缺失突變。酶還常常導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的缺失突變。重組腈水解酶菌種的改造重組腈水解酶菌種的改造-催化腈化合物制備有機(jī)酸催化腈化合物制備有機(jī)酸腈水解酶腈水解酶 生物法優(yōu)點(diǎn)生物法優(yōu)點(diǎn): 轉(zhuǎn)化率高轉(zhuǎn)化率高 ( 100%) 條件溫和條件溫和 結(jié)構(gòu)選擇性結(jié)構(gòu)選擇性R C OHOR C N高溫酸、高溫酸、堿水解堿水解 化學(xué)法的問

38、題化學(xué)法的問題: :污染嚴(yán)重污染嚴(yán)重轉(zhuǎn)化率低轉(zhuǎn)化率低反應(yīng)條件苛刻反應(yīng)條件苛刻無結(jié)構(gòu)選擇性無結(jié)構(gòu)選擇性產(chǎn)腈水解酶菌株的選育產(chǎn)腈水解酶菌株的選育 篩選誘變得到菌株篩選誘變得到菌株Rhodococcus rhodochrous tg1-A6 丙烯腈作為唯一氮源丙烯腈作為唯一氮源 紫外紫外+氯化鋰誘變氯化鋰誘變 腈水解酶活力高腈水解酶活力高 (27U/mL) 能催化并積累高濃度丙烯酸能催化并積累高濃度丙烯酸 (414.2g/L)CH2CH CNCH2CH COOHR。rhodochrous tg1-A6丙烯腈丙烯腈丙烯酸丙烯酸012345678910 11010020030040002468 a c

39、rylic a c id concentration of acrylic acid g/LTime / hconcentration of acrylonitrile g/L a c rylo nitrile + NH3 腈水解酶的催化特性腈水解酶的催化特性丙烯腈為最適底物丙烯腈為最適底物對不同腈類，腈水解酶催化活力差異較大對不同腈類，腈水解酶催化活力差異較大12345020406080100亞氨基二乙腈3-氰基吡啶3-羥基丙腈氨基乙腈丙烯腈相對酶活(%) 底物不同底物的腈水解酶的活性不同底物的腈水解酶的活性對腈水解酶進(jìn)行改造！對腈水解酶進(jìn)行改造！CH2CH COOHCH2NH2COOHNC

40、OOHCH2CHNCH2COHOHOO丙烯酸丙烯酸亞氨基二乙酸亞氨基二乙酸 (IDA)煙酸煙酸甘氨酸甘氨酸414.2g/L178.5g/L35.96 g/L120 g/LCH2OHCOOH羥基乙酸羥基乙酸8.8 g/L腈水解酶基因克隆該腈水解酶基因的開放閱讀框?yàn)樵撾嫠饷富虻拈_放閱讀框?yàn)?101bp，基因序列已提交，基因序列已提交NCBI genebank數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫 (EF467367) 。PCR MarkerpET-Nit6.6 kbKanNitrilasef1 orilacIpBR322 oriT7 lacNde IHindIII97.4K31.0K43.0K20.1K66.2K42K

41、 Marker 誘導(dǎo)后 誘導(dǎo)前E.coli BL21(DE3)/pET-Nit 羥基乙腈羥基乙腈羥基乙酸羥基乙酸 + 氨氨 高通量篩選方法！高通量篩選方法！催化產(chǎn)物呈酸性，加入催化產(chǎn)物呈酸性，加入pH指示劑，菌液在培養(yǎng)催化過程中可指示劑，菌液在培養(yǎng)催化過程中可能會(huì)出現(xiàn)能會(huì)出現(xiàn)顏色變化顏色變化。pH指示劑法篩菌指示劑法篩菌 指示劑：指示劑： 溴甲酚紫溴甲酚紫 變色范圍：紫變色范圍：紫6.8 黃黃 5.2 易錯(cuò)易錯(cuò)PCR定向改造定向改造CH2OHCOOH腈水解酶的定向改造培養(yǎng)培養(yǎng)+催化催化0h 10h篩選方法篩選方法A1A2A5B 3B 10 C 10A8A10B 7C 3C 40.00.20.4

42、 酶酶活活 U U/ /m ml l樣樣 品品號號顏色顏色酶活的關(guān)聯(lián)酶活的關(guān)聯(lián)顏色變化顯著顏色變化顯著 顏色變化不明顯顏色變化不明顯510152025300.00.81.0酶活 U/ml樣 品號5101520250.00.81.01.82.0酶活 U/ml 樣 品號5101520250.00.51.01.52.02.53.0酶活 U/ml樣 品號3.23U/ml第二輪改造第二輪改造第三輪改造第三輪改造1.99U/ml0.995U/ml原始菌0.61U/ml原始菌原始菌0.61U/ml突變菌突變菌3.23U/ml第一輪改造第

43、一輪改造易錯(cuò)易錯(cuò)PCR定向改造定向改造蛋白質(zhì)組學(xué)方法改造菌種蛋白質(zhì)組學(xué)方法改造菌種 根據(jù)不同生長代謝階段的菌體的蛋白質(zhì)表達(dá)差異根據(jù)不同生長代謝階段的菌體的蛋白質(zhì)表達(dá)差異進(jìn)行分析，尋找對產(chǎn)物代謝關(guān)鍵的基因。進(jìn)行分析，尋找對產(chǎn)物代謝關(guān)鍵的基因。Photos from web反向生物工程反向生物工程2.5.1 2.5.1 菌種變異及退化機(jī)理菌種變異及退化機(jī)理菌種退化菌種退化：生產(chǎn)菌種或選育過程中篩選出來的較優(yōu)良菌株，：生產(chǎn)菌種或選育過程中篩選出來的較優(yōu)良菌株，由于進(jìn)行接種傳代或保藏之后，群體中某些生理特征和形由于進(jìn)行接種傳代或保藏之后，群體中某些生理特征和形態(tài)特征逐漸減退或完全喪失的現(xiàn)象。態(tài)特征逐漸

44、減退或完全喪失的現(xiàn)象?；蛲蛔兓蛲蛔兪蔷N退化的根本原因；是菌種退化的根本原因；連續(xù)傳代連續(xù)傳代是加速退化發(fā)生的直接原因。是加速退化發(fā)生的直接原因。2.5 2.5 發(fā)酵工業(yè)菌種保藏發(fā)酵工業(yè)菌種保藏/info/view.aspx?pageid=88中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 2.5.2 2.5.2 菌種保藏技術(shù)菌種保藏技術(shù)菌種保藏原理菌種保藏原理 根據(jù)微生物的生理、生化特點(diǎn)，人工地創(chuàng)造條件，根據(jù)微生物的生理、生化特點(diǎn)，人工地創(chuàng)造條件，使微生物的使微生物的代謝處于不活潑代謝處于不活潑、生長繁殖受抑制的休眠生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)狀態(tài)。 保藏時(shí)首

45、先要挑選保藏時(shí)首先要挑選優(yōu)良純種優(yōu)良純種，最好是休眠體（孢，最好是休眠體（孢子、芽孢等），其次是創(chuàng)造最子、芽孢等），其次是創(chuàng)造最有利于休眠的環(huán)境條件有利于休眠的環(huán)境條件，如低溫、干燥、缺氧和缺營養(yǎng)等，以達(dá)到降低其代謝如低溫、干燥、缺氧和缺營養(yǎng)等，以達(dá)到降低其代謝活動(dòng)，延長保存期的目的。另外，也應(yīng)考慮到保藏方活動(dòng)，延長保存期的目的。另外，也應(yīng)考慮到保藏方法的經(jīng)濟(jì)簡便。法的經(jīng)濟(jì)簡便。2.5 2.5 發(fā)酵工業(yè)菌種保藏發(fā)酵工業(yè)菌種保藏2.5.2 菌種保藏技術(shù)菌種保藏技術(shù)（1）斜面低溫保藏法）斜面低溫保藏法原理：低溫原理：低溫方法：將菌種接種在不同成分的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，方法：將菌種接種在

46、不同成分的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，置于置于4冰箱中保藏，每隔一定時(shí)間移植培養(yǎng)，再將新斜面繼續(xù)冰箱中保藏，每隔一定時(shí)間移植培養(yǎng)，再將新斜面繼續(xù)保藏。保藏。適用范圍：各類微生物。適用范圍：各類微生物。特點(diǎn)：特點(diǎn)：操作簡單操作簡單，不需特殊設(shè)備。，不需特殊設(shè)備。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：保存時(shí)間短保存時(shí)間短，傳代多，較易發(fā)生變異。，傳代多，較易發(fā)生變異。甘油管保藏法：甘油管保藏法：菌液和菌液和30-50%滅菌甘油滅菌甘油 1:1（v/v）混合，于）混合，于-20 冰箱中保藏冰箱中保藏操作簡單，但保存時(shí)間不長。操作簡單，但保存時(shí)間不長。常用于重組菌的短期保存。常用于重組菌的短期保存。2.5 2.5 發(fā)酵工業(yè)

47、菌種保藏發(fā)酵工業(yè)菌種保藏2.5.2 菌種保藏技術(shù)菌種保藏技術(shù)（2）礦油封藏法）礦油封藏法原理：低溫、缺氧、缺營養(yǎng)原理：低溫、缺氧、缺營養(yǎng)方法：將化學(xué)純的液體石蠟方法：將化學(xué)純的液體石蠟(礦油礦油)經(jīng)高壓蒸氣滅菌經(jīng)高壓蒸氣滅菌放在放在40恒溫箱恒溫箱中蒸發(fā)其中的水分中蒸發(fā)其中的水分然後注入斜面培養(yǎng)物中然後注入斜面培養(yǎng)物中使液面高出斜面約使液面高出斜面約 1厘米。將試管直立厘米。將試管直立放在放在1520室溫中保存。由于在斜面培養(yǎng)物室溫中保存。由于在斜面培養(yǎng)物上覆蓋一層液體上覆蓋一層液體既能隔絕空氣既能隔絕空氣又能防止培養(yǎng)基因水分蒸發(fā)而干又能防止培養(yǎng)基因水分蒸發(fā)而干燥燥可以延長菌種保藏的時(shí)間。但注

48、入的液體必須不與培養(yǎng)基混溶可以延長菌種保藏的時(shí)間。但注入的液體必須不與培養(yǎng)基混溶對菌種無毒對菌種無毒不易被利用和揮發(fā)。此法適用于酵母菌不易被利用和揮發(fā)。此法適用于酵母菌芽孢桿菌芽孢桿菌不適用于固氮菌不適用于固氮菌乳酸桿菌乳酸桿菌明串珠菌明串珠菌法門氏菌和毛黴目中的法門氏菌和毛黴目中的大多數(shù)屬種。此法簡便易行大多數(shù)屬種。此法簡便易行但必須注意防火和污染。但必須注意防火和污染。 http:/ 適用范圍：產(chǎn)孢子的微生物，如產(chǎn)芽孢的細(xì)菌、放線菌和霉菌。適用范圍：產(chǎn)孢子的微生物，如產(chǎn)芽孢的細(xì)菌、放線菌和霉菌。特點(diǎn)：簡單易行，不需特殊設(shè)備。特點(diǎn)：簡單易行，不需特殊設(shè)備。缺點(diǎn)：工作量大，費(fèi)人力。缺點(diǎn)：工作量

49、大，費(fèi)人力。2.5 2.5 發(fā)酵工業(yè)菌種保藏發(fā)酵工業(yè)菌種保藏2.5.2 菌種保藏技術(shù)菌種保藏技術(shù)（3）冷凍真空干燥法）冷凍真空干燥法原理：低溫、干燥、缺氧原理：低溫、干燥、缺氧方法：方法：（脫脂牛奶或血清，冷凍、真空干燥）（脫脂牛奶或血清，冷凍、真空干燥）適用范圍：各類微生物。適用范圍：各類微生物。特點(diǎn)：特點(diǎn)：保存時(shí)間長保存時(shí)間長，存活率高，變異率低。，存活率高，變異率低。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：手續(xù)較麻煩手續(xù)較麻煩，需要一定的設(shè)備，操作較嚴(yán)謹(jǐn)。，需要一定的設(shè)備，操作較嚴(yán)謹(jǐn)。2.5 2.5 發(fā)酵工業(yè)菌種保藏發(fā)酵工業(yè)菌種保藏2.5.2 菌種保藏技術(shù)菌種保藏技術(shù)（4）液氮超低溫保藏法）液氮超低溫保藏法原理：超

50、低溫，所有代謝活動(dòng)停止，不會(huì)發(fā)生變異原理：超低溫，所有代謝活動(dòng)停止，不會(huì)發(fā)生變異方法方法：（保護(hù)劑、逐步降溫、液氮保藏）：（保護(hù)劑、逐步降溫、液氮保藏）適用范圍：適用范圍：各類微生物各類微生物。特點(diǎn)：特點(diǎn)：目前最可靠的長期保持菌種的方法目前最可靠的長期保持菌種的方法。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：需特殊設(shè)備，操作較復(fù)雜需特殊設(shè)備，操作較復(fù)雜。2.5 2.5 發(fā)酵工業(yè)菌種保藏發(fā)酵工業(yè)菌種保藏/實(shí)驗(yàn)室常用的液氮罐和提盒實(shí)驗(yàn)室常用的液氮罐和提盒2.6 2.6 防止菌種衰退和退化菌種的復(fù)壯防止菌種衰退和退化菌種的復(fù)壯2.6.1 防止菌種衰退防止菌種衰退 防止菌種衰退的方法有：防止菌種衰退的方法有： （1）控制傳代次數(shù)）控制傳代次數(shù) 基因的變化往往發(fā)生在復(fù)制和繁殖過程中，繁殖越頗基因的變化往往發(fā)生在復(fù)制和繁殖過程中，繁殖越頗繁，復(fù)