基因工程復(fù)習(xí)資料

1、基因工程名詞解釋?zhuān)旱谝徽?基因工程概論1、基因工程：是利用DNA體外重組或PCR擴(kuò)增技術(shù)從某種生物基因組中分離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經(jīng)過(guò)一系列切割，加工修飾，經(jīng)連接反應(yīng)形成重組DNA分子，再將其轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（轉(zhuǎn)化），以期獲得基因表達(dá)的過(guò)程。第二章 分子克隆工具酶 1、限制性?xún)?nèi)切酶：指一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶。2、粘性末端：粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)。3、同尾酶：許多不同的限制酶切割 DNA 產(chǎn)生的末端是相同的，且是對(duì)稱(chēng)的，即它們可產(chǎn)生相同的粘性突

2、出末端。4、星號(hào)活性：非特異性切割在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱(chēng)星星活性。5、DNA連接酶：可使一段DNA的3羥基末端和5磷酸末端形成3，5- 磷酸二酯鍵，把兩個(gè)DNA片段連在一起，封閉DNA雙鏈上形成的切口的酶。6、Klenow DNA 聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)蛋白酶裂解而從全酶中除去具53外切酶活性的肽段，也稱(chēng)Klenow 片段。它具有53的DNA聚合酶活性，和很弱的35的外切核酸酶活性。第三章 分子克隆載體1、載體：將外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞并能自我復(fù)制的工具稱(chēng)為載體2、質(zhì)粒：質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)攜帶的染色體外的能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的環(huán)狀DN

3、A分子3、噬菌粒：帶有絲狀噬菌體大間隔區(qū)的質(zhì)粒載體，是集質(zhì)粒和絲狀噬菌體的有利特征于一體的載體，具有ColE1復(fù)制起點(diǎn)及抗生素抗性選擇標(biāo)記，以及絲狀噬菌體的間隔區(qū)4、科斯質(zhì)粒（柯斯質(zhì)粒，cosmid, cos sitecarring plasmid)：人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列（含兩側(cè)與包裝有關(guān)的序列）的質(zhì)粒載體第四章 人工染色體載體1、人工染色體載體：利用染色體的復(fù)制元件來(lái)驅(qū)動(dòng)外源DNA片段復(fù)制的載體。2、酵母人工染色體載體：就是模擬酵母菌染色體的復(fù)制而構(gòu)建的載體，是第一個(gè)可保持為線(xiàn)性分子的載體，從而模擬了染色體。這樣的載體稱(chēng)為酵母人工染色體 。當(dāng)裝載外源DNA片段后，在酵母菌中可像酵

4、母的染色體一樣復(fù)制，從而達(dá)到克隆大片段DNA的目的。 3、BAC載體：細(xì)菌人工染色體是基于大腸桿菌的F質(zhì)粒構(gòu)建的高容量低拷貝質(zhì)粒載體。第五章 表達(dá)載體1、表達(dá)載體（Expression vectors）：就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件（如啟動(dòng)子、RBS、終止子等），是目的基因能夠表達(dá)的載體。（是用于表達(dá)原核或真核細(xì)胞中某個(gè)特定基因所編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的載體，其克隆位點(diǎn)的上游含有強(qiáng)啟動(dòng)子、下游含有轉(zhuǎn)錄終止序列，適用于表達(dá)某特定蛋白質(zhì)。）2、融合蛋白：即編碼原核多肽DNA序列與編碼真核多肽cDNA（目的片段）融合成一體后表達(dá)出來(lái)的一種蛋白。N端由原核DNA序列編碼，C端由真核基因完整序列

5、cDNA編碼。 3、穿梭載體（Shuttle vector）：是能夠在兩類(lèi)不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體。如有些載體既能在原核細(xì)胞中復(fù)制又能在真核細(xì)胞中復(fù)制，或能在 E.coli 中復(fù)制又能在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中復(fù)制。這類(lèi)載體主要是質(zhì)粒載體。第六章 基因工程中大分子的分離與檢測(cè)1、分子雜交：有一定同源性的兩條核酸單鏈，在適宜的溫度和離子濃度等條件下，通過(guò)堿基互補(bǔ)退火形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過(guò)程 。是在分子克隆中的一類(lèi)核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用于檢測(cè)混合樣品中特定核酸分子或蛋白質(zhì)分子是否存在，以及其分子量大小。2、印跡（bloting）：將DNA、RNA或蛋白質(zhì)固定到固體支持物上的過(guò)程。根據(jù)其固定物分為

6、 Southern bloting (DNA)、Northern bloting (RNA)和 Western bloting (蛋白質(zhì))。Southern bloting即目標(biāo) DNA 經(jīng)過(guò)限制性酶切并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳以后，堿性條件下變性處理，并保持DNA為單鏈，然后通過(guò)毛細(xì)管滲吸或電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移的方式，將凝膠上的 DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對(duì)象為DNA，探針為DNA或RNA。Northern blotting是指DNA-RNA分子雜交，應(yīng)用特異性基因探針?lè)治龌虻霓D(zhuǎn)錄水平，檢測(cè)RNA（主要是mRNA）的方法。主要用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞或組織樣品中是否存在與探針同

7、源的 mRNA 分子，從而判斷在轉(zhuǎn)錄水平上某基因是否表達(dá)，在有合適對(duì)照的情況下，通過(guò)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱可比較基因表達(dá)的強(qiáng)弱。Western blotting將蛋白質(zhì)樣品從 SDS-PAGE 凝膠通過(guò)電轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)移到濾膜的方法3、原位雜交：就是將細(xì)菌菌落影印到濾膜上，或?qū)⒕N點(diǎn)種在濾膜上然后再生長(zhǎng)出可見(jiàn)的菌落，對(duì)濾膜上的菌體進(jìn)行原位裂解使 DNA 釋放出來(lái)，并使之固定在濾膜上。然后通過(guò)分子雜交，判斷哪個(gè)或哪些菌落含有與探針同源的 DNA 。4、探針（probe）：核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段。5、轉(zhuǎn)化：一生物品系吸收了

8、來(lái)自另一生物品系的DNA并得到其遺傳性狀的現(xiàn)象。第七章 PCR技術(shù)原理1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：又稱(chēng)體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。是利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過(guò)變性-退火-延伸循環(huán)操作，在體外特異地?cái)U(kuò)增所需要的DNA片段的一種技術(shù)。 第八章 DNA序列分析1引物步移：引物依次推進(jìn)法是從目的片段的一端開(kāi)始，利用載體上的序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)第一次反應(yīng)的反應(yīng)引物進(jìn)行測(cè)序，然后依次根據(jù)前一次測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)下一次反應(yīng)引物，遞進(jìn)測(cè)序，直至完成。第九章 文庫(kù)的構(gòu)建1、 基因文庫(kù)：某個(gè)生物的基因組 DNA 或 cDNA 片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外通過(guò)重組后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并通過(guò)一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽(yáng)性菌落（或噬菌體）

9、，所有菌落或噬菌體的集合。2、基因組 DNA 文庫(kù)：指將某生物體的全部基因組 DNA 用限制性?xún)?nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度范圍的 DNA 片段，與合適的載體體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽(yáng)性菌落。3、cDNA文庫(kù)：以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體常用噬菌體或質(zhì)粒載體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱(chēng)為該組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。4、表型篩選法：根據(jù)目的基因編碼比較特殊的功能，并且其與載體作用可以在宿主菌（如大腸桿菌）中表達(dá)該基因，表現(xiàn)出其特殊的功能所決定的表型性狀來(lái)，這樣就

10、很容易通過(guò)導(dǎo)入的基因帶來(lái)新的功能或恢復(fù)其缺失的功能來(lái)確定目的基因。5、雜交篩選：當(dāng)把基因文庫(kù)轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜之后，就可以同特異性的核酸探針進(jìn)行菌落或噬菌班雜交，以便篩選出具有目的基因的陽(yáng)性克隆。這個(gè)過(guò)程叫做克隆基因的分離或篩選。應(yīng)用核酸探針?lè)蛛x目的基因的方法叫做核酸雜交篩選法。6、免疫篩選：免疫篩選法和核酸雜交的方法類(lèi)似，只是其使用的探針?lè)呛怂?，而是特異性的抗體；或用放射性同位素標(biāo)記、帶有特定蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的DNA片段作探針篩選cDNA表達(dá)文庫(kù)，從中鑒定出能夠表達(dá)出與它發(fā)生特異性結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的陽(yáng)性克隆。適合免疫雜交法篩選的外源基因首先要在宿主細(xì)胞中存在抗原蛋白的表達(dá)，用于篩選的

11、 DNA 文庫(kù)必須是表達(dá)文庫(kù)。第十章 DNA誘變1、體外隨機(jī)誘變： 指隨機(jī)地在克隆化DNA中引入堿基置換突變。2、DNA體外重組技術(shù) 主要是指依賴(lài)序列同源性的DNA體外重組，包括經(jīng)典的DNA洗牌法（DNA shuffling)以及在此基礎(chǔ)上發(fā)展出來(lái)的交錯(cuò)延伸(staggered extension process，StEP)、隨機(jī)引發(fā)重組（random-priming recombination，RPR)等技術(shù)。3、嵌套缺失 逐步從感興趣的DNA的一端或兩端刪除多個(gè)寡核苷酸，得到一套終末端長(zhǎng)短不同的嵌套缺失突變體，這個(gè)突變體群體也稱(chēng)漸次截短文庫(kù)（incremental truncation l

12、ibrary,ITL）第十一章 基因操作中的核酸分析技術(shù)1、RNA干擾：RNA干擾（RNA interference, RNAi）是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。簡(jiǎn)答題：第一章 基因工程概論1、基因工程的基本程序獲得外源DNA片段; 外源DNA片段與載體連接; 重組DNA分子轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞；重組細(xì)胞擴(kuò)增;重組子的篩選與鑒定;目的基因的確認(rèn)與分析第二章 分子克隆工具酶1、什么是細(xì)菌的限制與修飾系統(tǒng)？限制：細(xì)菌為防御外來(lái)DNA入侵而將其降解的現(xiàn)象。（一般由限制酶來(lái)降解外源DNA)修飾：細(xì)菌為防止自身DNA被降解而修飾自身DNA。 (一般

13、由甲基化酶進(jìn)行修飾） 限制與修飾往往成對(duì)存在，它們的識(shí)別序列往往相同。2、限制酶命名法的原則限制酶來(lái)源菌，第一個(gè)字母屬名，（從分離的菌株屬名取第一個(gè)字母,大寫(xiě)）；種名前兩個(gè)字母（從分離的菌株種名取前兩個(gè)字母,小寫(xiě)）；菌株代號(hào)或生物型號(hào)；不同限制酶：如第三個(gè)限制酶（序號(hào) 羅馬字）比如 HindIII 組法： 3、第二型限制酶的特點(diǎn)底物專(zhuān)一性：其底物只能是雙鏈DNA分子，對(duì)單鏈RNA及雙鏈DNA-RNA雜交分子均不起作用；位點(diǎn)專(zhuān)一性：它的識(shí)別位點(diǎn)為4-8核苷酸序列，甲基化位點(diǎn)就是識(shí)別位點(diǎn)，識(shí)別位點(diǎn)也切割部位，產(chǎn)生特異性的片段；位點(diǎn)上核苷酸順序通常呈雙重螺旋結(jié)構(gòu)。4、大腸桿菌 DNA 聚合酶 發(fā)揮生

14、物學(xué)活性的條件（1）DNA模板（可以是單鏈或雙鏈）（2）帶有3-端游離羥基的引物鏈（3）底物和激活劑注：對(duì)雙鏈DNA，當(dāng)有dNTP存在時(shí)， 35降解活性會(huì)被53方向的聚合活性所抑制。第三章 分子克隆載體1、載體的特征自主復(fù)制，具備復(fù)制原點(diǎn)必須具備合適的酶切位點(diǎn)供外源DNA片段插入，同時(shí)不影響其復(fù)制有一定的選擇標(biāo)記，用于篩選有較高的拷貝數(shù)，便于載體的制備可容納較大的外源基因片段；具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性；具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移2、質(zhì)粒的三大基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性：質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制。質(zhì)粒的不相容性：任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞

15、中。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性：在自然條件下，很多質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)稱(chēng)為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)。3、質(zhì)粒分子三種存在形式共價(jià)閉合超螺旋形式：（covalently closed circular，簡(jiǎn)寫(xiě)cccDNA）（SC）開(kāi)放環(huán)結(jié)構(gòu)：一條保持著完整的環(huán)結(jié)構(gòu)，另一條有一個(gè)或數(shù)個(gè)切刻。（OC)線(xiàn)性結(jié)構(gòu)：質(zhì)粒在限制性酶作用下，雙鏈斷裂，形成線(xiàn)性，又叫L型。4、幾種標(biāo)記基因的篩選原理標(biāo)記基因按用途可分為兩類(lèi)：選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因用于鑒別目標(biāo) DNA （載體）的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來(lái)；篩選標(biāo)記基因用于鑒別重組子和非重組子。也可用于將特殊表型的重組子挑選出來(lái)選擇標(biāo)記基因氨芐青霉素抗性基

16、因（Ampicillin resistance gene,ampr） 氨芐青霉素（Ampicillin）是殺菌劑，可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類(lèi)的活性，干擾細(xì)胞分裂，殺死細(xì)胞。 Ampr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，能催化內(nèi)酰胺環(huán)的水解，使氨芐青霉素失活。四環(huán)素抗性基因（tetracycline resistance gene, tetr） 四環(huán)素是抑菌劑，可結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過(guò)程。抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞停止生長(zhǎng)。 四環(huán)素抗性基因編碼一種399個(gè)氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。氯霉素抗性基因（c

17、hloramphenicol resistance gene , Cmr） 氯霉素是抑菌劑，可結(jié)合在核糖體50S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。 Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙?；瑢?dǎo)致乙?；穆让顾夭荒芙Y(jié)合在核糖體上。 篩選標(biāo)記基因-互補(bǔ)（藍(lán)白斑試驗(yàn)，又稱(chēng)IPTG-Xgal試驗(yàn)）：pUC質(zhì)粒系列含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和復(fù)制起始點(diǎn)。去除了pBR322的tetr區(qū)段，換用了M13噬菌體的476bp片段，含LacZ基因及其啟動(dòng)子的操縱基因、M13的多聚接頭polylinker。自然狀態(tài)下，LacZ基因編碼的半乳糖苷酶可以分解乳糖，以IPTG為誘導(dǎo)劑代替乳糖，X-gal

18、為顯色劑，質(zhì)粒載體上存在的LacZ基因片段當(dāng)被外源DNA片段插入時(shí)，會(huì)產(chǎn)生白色的克隆，不含插入片段的質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞生成藍(lán)色菌落。插入失活：pBR322 質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標(biāo)記。當(dāng)外源 DNA 片段插入四環(huán)素抗性基因tetr基因后，導(dǎo)致 tetr基因失活，變成只對(duì)氨芐青霉素ampr有抗性。這樣就可通過(guò)對(duì)抗生素是雙抗還是單抗來(lái)篩選是否有外源片段插入到載體中。5、噬菌體克隆外源目的基因步驟通過(guò)裂解過(guò)程增殖載體，回收、純化載體載體與外源DNA的酶切載體與外源DNA連接重組噬菌體的體外包裝包裝噬菌體的感染infect篩選6、M13噬菌體載體優(yōu)缺點(diǎn)

19、優(yōu)點(diǎn)：復(fù)制以雙鏈DNA(RF DNA）為媒介，如同質(zhì)粒，易于純化和操作。RF DNA和ss DNA均能轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌，形成侵染的菌落或產(chǎn)生噬菌斑?？煞奖愕孬@得單鏈DNA(正鏈DNA)。無(wú)包裝限制問(wèn)題，曾成功包裝了長(zhǎng)度為M13 DNA6倍的DNA分子。具有多克隆位點(diǎn)成對(duì)構(gòu)建，是有效顆粒雙鏈中的任何一條鏈。缺點(diǎn)：外源DNA不穩(wěn)定，在液體培養(yǎng)過(guò)程中，尤其易產(chǎn)生缺失，液體培養(yǎng)液不易作再次培養(yǎng)的種子液。缺失突變體具選擇優(yōu)勢(shì)，經(jīng)幾次連續(xù)傳代后,原始重組體可能喪失殆盡。外源DNA往往是單向插入，另一方向的插入可能干擾了基因間隔區(qū)的功能，強(qiáng)制插入將導(dǎo)致外源DNA重組或缺失，不可取。第四章 人工染色體載體1

20、、YAC的構(gòu)建應(yīng)含有的元件酵母染色體的端粒序列酵母染色體的復(fù)制子 酵母染色體的中心粒序列酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記 大腸桿菌的復(fù)制子 大腸桿菌的選擇標(biāo)記裝載量：350-400kb2、 YAC載體的工作原理（YAC 載體主要是用來(lái)構(gòu)建大片段 DNA 文庫(kù)，特別用來(lái)構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫(kù)，并不用作常規(guī)的基因克隆。）當(dāng)用 BamH切割成線(xiàn)狀后，就形成了一個(gè)微型酵母染色體，包含染色體復(fù)制的必要順式元件，如自主復(fù)制序列、著絲粒和位于兩端的端粒。這些元件在酵母菌中可以驅(qū)動(dòng)染色體的復(fù)制和分配，從而決定這個(gè)微型染色體可以攜帶酵母染色體大小的 DNA 片段。對(duì)于 BamH切割后形成的微型酵母染色體，當(dāng)用 EcoR

21、或 Sma 切割抑制基因 sup4 內(nèi)部的位點(diǎn)后形成染色體的兩條臂。與外源大片段 DNA 在該切點(diǎn)相連就形成一個(gè)大型人工酵母染色體，通過(guò)轉(zhuǎn)化進(jìn)入到酵母菌后可象染色體一樣復(fù)制，并隨細(xì)胞分裂分配到子細(xì)胞中去，達(dá)到克隆大片段DNA 的目的。第五章 表達(dá)載體1、大腸桿菌表達(dá)載體應(yīng)有的結(jié)構(gòu)成分大腸桿菌表達(dá)載體都是質(zhì)粒載體。作為表達(dá)載體首先必須滿(mǎn)足克隆載體的基本要求，即能將外源基因運(yùn)載到大腸桿菌細(xì)胞中。在基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件，就構(gòu)成了表達(dá)載體。各種表達(dá)載體的不同之處在于其表達(dá)元件的差異。表達(dá)系統(tǒng)元件：(1)啟動(dòng)子：大腸桿菌表達(dá)載體中常用的啟動(dòng)子：trp-lac啟動(dòng)子（又稱(chēng)tac啟動(dòng)子）；噬菌體PL

22、啟動(dòng)子。(2)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)：RBS由SD序列、核糖體識(shí)別序列和起始密碼（ATG）組成。但有時(shí)也將SD序列稱(chēng)為核糖體結(jié)合位點(diǎn)。(3)轉(zhuǎn)錄終止序列：一般由一段GC富集區(qū)組成的反向重復(fù)序列，具有回紋結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)區(qū)可行成“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)。2、GST融合表達(dá)蛋白純化原理GST表達(dá)載體在啟動(dòng)子tac和多克隆位點(diǎn)之間加入了兩個(gè)與分離純化有關(guān)的編碼序列，其一是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，其二是凝血蛋白酶（Thrombin）切割位點(diǎn)的編碼序列。當(dāng)外源基因插入到多克隆位點(diǎn)后，可表達(dá)出由三部分序列組成的融合蛋白。GST是來(lái)源于血吸蟲(chóng)的小分子酶（26kDa），在E.coli易表達(dá)，在融合蛋白狀態(tài)下保持酶學(xué)活性

23、，對(duì)谷胱甘肽有很強(qiáng)的結(jié)合能力。將谷胱甘肽固定在瓊脂糖樹(shù)脂上形成親和層析柱，當(dāng)表達(dá)融合蛋白的全細(xì)胞提取物通過(guò)層析柱時(shí)，融合蛋白將吸附在樹(shù)脂內(nèi)，其它細(xì)胞蛋白就被洗脫出來(lái)。然后再用含游離的還原型谷胱甘肽的緩沖液洗脫，可將融合蛋白釋放出來(lái)。再用凝血蛋白酶切割融合蛋白，便可獲得純化的目標(biāo)蛋白。除了凝血蛋白酶的切割位點(diǎn)外，其它還有 Xa 因子（Factor Xa）和腸激酶。3、融合蛋白表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)偽裝不易降解，其中真核蛋白由原核多肽偽裝，不易被細(xì)菌蛋白酶降解，穩(wěn)定；大多數(shù)以可溶性形式存在，不需切割就有生物活性；易酶切分離，如腸激酶或設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)切掉原核多肽，即可釋放出有活性的真核蛋白；易分離純化，如用原核多

24、肽/或融合蛋白免疫家兔產(chǎn)生相應(yīng)單抗親和，純化實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單；產(chǎn)生分泌性蛋白，若E.coli結(jié)構(gòu)基因是一段信號(hào)肽，可產(chǎn)生分泌性產(chǎn)物。4、大腸桿菌表達(dá)體系的優(yōu)缺點(diǎn) 特征：穩(wěn)定的遺傳和復(fù)制能力,在無(wú)選擇壓力下保存于E.coli細(xì)胞內(nèi)；具有顯性的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記；promotor是可以調(diào)控的，抑制時(shí)本底轉(zhuǎn)錄水平低；轉(zhuǎn)錄的mRNA能在合適位置終止,轉(zhuǎn)錄過(guò)程不影響表達(dá)載體復(fù)制；具備有適用外源基因插入的MCS。優(yōu)點(diǎn)：積累了充足經(jīng)驗(yàn)，有數(shù)不清的載體可供應(yīng)用； 可因不同載體而選擇不同菌種作宿主；操作安全，致病能力低；成本相對(duì)低得多；真核生物的基因先在原核體系上構(gòu)建克隆，稱(chēng)為亞克?。╯ubclone），然后采用其它方式

25、轉(zhuǎn)移至真核細(xì)胞上表達(dá)。缺點(diǎn)：原核生物載體構(gòu)建的重組體是無(wú)法進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)；沒(méi)有加工所需的酶系統(tǒng)；熱源、內(nèi)毒素不易除去；常會(huì)形成包涵體。第六章 基因工程中大分子的分離與檢測(cè)1、核酸分離提取的原則保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性排除其它分子的污染 核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子； 將其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類(lèi)分子的污染降到最低； 排除其它核酸分子的污染。 2、變性法提取質(zhì)粒DNA的原理在變性條件（堿性或高溫)下，線(xiàn)狀染色體DNA變性成為單鏈而完全分開(kāi)，而cccDNA (共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋DNA）雖然互補(bǔ)鏈之間的氫鍵斷裂，但雙螺旋主鏈骨架仍彼此纏繞在一起。當(dāng)變性

26、條件恢復(fù)時(shí)，質(zhì)粒DNA迅速?gòu)?fù)性恢復(fù)天然構(gòu)型，染色體DNA難以復(fù)性，交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與變性的蛋白質(zhì)和RNA纏繞在一起，通過(guò)離心沉淀下來(lái)，而質(zhì)粒DNA存在于上清液中。3、核酸電泳的基本原理核酸分子中的磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中將向正極移動(dòng)，通過(guò)凝膠的分子篩作用可以將不同大小和構(gòu)型的核酸分子分離，分子量小的DNA，具有較緊密的構(gòu)型，在凝膠中移動(dòng)快；反之，分子量大的DNA移動(dòng)慢。 4、毛細(xì)管虹吸印跡法利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過(guò)濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜

27、向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上。5、CaCl2轉(zhuǎn)化法原理（這個(gè)答案在ppt上沒(méi)找到，因此答案在網(wǎng)上找的，僅供參考）將快速生長(zhǎng)的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會(huì)造成細(xì)胞膨脹，同時(shí)Ca2+會(huì)使細(xì)胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開(kāi)來(lái)，離開(kāi)所在區(qū)域，誘導(dǎo)細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞。第七章 PCR技術(shù)原理1、PCR的基本步驟（1）高溫變性： 95左右35分鐘使雙鏈DNA變性形成單鏈DNA。（2）引物與模板結(jié)合（低溫退火）：降低溫度以后，引物在單鏈DNA與之互補(bǔ)的部位結(jié)合。溫度是 PCR 擴(kuò)增是否

28、順利的關(guān)鍵因素，退火通常在 50-60 之間，具體的溫度主要由引物的 Tm 值決定。（3）新鏈形成：在DNA聚合酶（常用Taq酶）的最適溫度（Taq酶為72）下，以dNTP為原料，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則，按照模板DNA的序列組成，從引物的 3開(kāi)始，逐一將dNTP聚合上去，合成一條新的DNA雙鏈（適溫延伸） 。延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定。2、PCR反應(yīng)的特點(diǎn)1.靈敏度高：（1）皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平。（2）能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞（3）病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU（空斑形成單位） （4）細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌 2. 簡(jiǎn)便、快速：（1）一次性加

29、好反應(yīng)液，24 h即可完成擴(kuò)增；（2）擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析 。3. 對(duì)標(biāo)本的純度要求低：血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA均可 。4. 高度的特異性： PCR擴(kuò)增的特異性由兩個(gè)引物的序列決定，具有高度的特異性。第八章 DNA序列分析1、Sanger氏酶學(xué)法的基本原理當(dāng)脫氧核糖3位置羥基缺失的雙脫氧核苷酸分子與其他正常核苷酸混合在同一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)體系中時(shí)，在DNA多聚酶的作用下雖然它也能夠象正常核苷酸一樣以其5位置的磷酸基與上位脫氧核苷酸的3位置的羥基結(jié)合，但是由于它自身3位置羥基的缺失，至使下位核苷酸的5磷酸基無(wú)法與之結(jié)合。2、Maxam-Gilbert 化學(xué)降解法的基

30、本原理將一個(gè) DNA 片段的 5 端磷酸基作放射性標(biāo)記，再分別采用不同的化學(xué)方法修飾和裂解特定堿基，從而產(chǎn)生一系列長(zhǎng)度不一而 5 端被標(biāo)記的 DNA 片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過(guò)凝膠電泳分離，再經(jīng)放射線(xiàn)自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的 DNA 的堿基序列。第九章 文庫(kù)的構(gòu)建1、一個(gè)理想的基因文庫(kù)應(yīng)具備的條件一個(gè)理想的基因文庫(kù)應(yīng)具備下列條件： 1、盡可能高的完備性 2、重組克隆的總數(shù)不宜過(guò)大，以減輕篩選工作的壓力 3、載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度，避免基因被分隔克隆4、克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域， 以利克隆排序 5、克隆片段易于從載體分子上完整卸下6、重組克隆能穩(wěn)

31、定保存、擴(kuò)增、篩選 2、基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較（1）基因組文庫(kù)優(yōu)點(diǎn)：基因組文庫(kù)可以含有基因組的編碼序列和間隔序列，用于研究基因編碼序列和編碼區(qū)外側(cè)調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能?；蚪M文庫(kù)可以含有所有的基因組DNA序列，受細(xì)胞來(lái)源和發(fā)育影響較小。缺點(diǎn)：基因組文庫(kù)篩選工作量大；有時(shí)假陽(yáng)性雜交信號(hào)沒(méi)有意義。（2）cDNA文庫(kù)主要優(yōu)點(diǎn)cDNA文庫(kù)以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒等的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的克隆分離。cDNA文庫(kù)的篩選比較簡(jiǎn)單易行。每一個(gè)cDNA文庫(kù)都含有一種mRNA序列，這樣在目的基因的選擇中出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率就會(huì)比較低，因此陽(yáng)性雜交信號(hào)一般都是有意義的，由此選擇出來(lái)的陽(yáng)性克

32、隆將會(huì)含有目的基因。cDNA文庫(kù)可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表達(dá)的基因的克隆，直接應(yīng)用于基因工程操作。cDNA克隆還可用于真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)和功能研究。主要的缺點(diǎn)1、cDNA文庫(kù)所包含的遺傳信息要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于基因組DNA文庫(kù)，并且受細(xì)胞來(lái)源或發(fā)育時(shí)期的影響。2、cDNA文庫(kù)雖能反映mRNA的分子結(jié)構(gòu)和功能信息，但不能直接獲得基因內(nèi)含子序列和基因編碼區(qū)外大量調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能方面信息。3、在cDNA文庫(kù)中，相應(yīng)于高豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例比較高，分離起來(lái)比較容易，而相應(yīng)于低豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例則比較低，因此分離也就比較困難。 第十章 DNA誘變1、DNA 洗牌法的優(yōu)點(diǎn)可在短

33、時(shí)間內(nèi)通過(guò)重組有效的突變體發(fā)掘所有可能的重組體與突變序列，從而大大加快進(jìn)化速度；而且對(duì)可操作的靶序列沒(méi)有任何要求，長(zhǎng)度可達(dá)幾十kb;通過(guò)多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導(dǎo)致功能的明顯提高；從表型上早期進(jìn)行選擇，而不必了解DNA片段上序列的信息，簡(jiǎn)化了操作程序；比隨機(jī)突變顯著提高了良性突變的概率。2、寡核苷酸介導(dǎo)定點(diǎn)誘變的基本流程首先,化學(xué)合成能與野生型DNA模板的靶區(qū)退火、并攜帶所需突變的寡核苷酸,作為體外合成DNA的引物。其次,由DNA聚合酶根據(jù)模板序列延伸寡核苷酸,產(chǎn)生含有預(yù)定突變的雙鏈DNA。最后,對(duì)突變體DNA測(cè)序,驗(yàn)證靶點(diǎn)的突變,并確保其他區(qū)域沒(méi)有發(fā)生額外的突變。3、誘變寡核

34、苷酸的設(shè)計(jì)原則1.與靶DNA的適當(dāng)鏈互補(bǔ)，并注意與模板的其他區(qū)域不能錯(cuò)誤雜交。2.錯(cuò)配堿基位于中央位置， 1-2個(gè)核苷酸突變時(shí)，使每側(cè)有10-15個(gè)堿基與模板鏈完全匹配。有效引入多于3個(gè)核苷酸突變時(shí)，要求引物在誘變點(diǎn)的每側(cè)有30個(gè)核苷酸互補(bǔ)于模板。3.足夠的長(zhǎng)度與靶序列特異地結(jié)合。1 2個(gè)堿基改變的引物要求至少25個(gè)堿基長(zhǎng)度。4.含有與模板完全雜交的5端區(qū)，這樣從上游引物起始的DNA合成不至于取代誘變寡核苷酸引物。DNA聚合酶的5 3，外切核酸酶活性是造成上游DNA合成取代5核苷酸的原因。5.誘變寡核苷酸引物3，區(qū)域有10-15個(gè)堿基與模板鏈完全匹配，形成足夠穩(wěn)定的雜交分子，以有效地從誘變寡核

35、苷酸引物3端引發(fā)DNA的合成。6.無(wú)回文，如果有重復(fù)或自身互補(bǔ)序列，這樣的序列會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，具有穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的誘變寡核苷酸與模板上靶序列的雜交率降低，可能導(dǎo)致得不到突變體。7.必要時(shí)可在誘變寡核苷酸上加入新的酶切位點(diǎn)，或消除靠近誘變點(diǎn)的已有酶切位點(diǎn)，便于誘變后通過(guò)限制性酶消化篩選候選突變子。4、PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)1.突變體的回收率高。一些改進(jìn)的方案可使得回收率達(dá)到近100。2.快速簡(jiǎn)便，能用雙鏈DNA為模板，不需制備單鏈模板，因而不需將目的DNA亞克隆到單鏈?zhǔn)删w載體上。3.高溫度的利用，可降低模板DNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的幾率。4.所有的反應(yīng)可以在同一只試管中進(jìn)行.缺點(diǎn)1.PCR擴(kuò)

36、增DNA時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定程度的堿基錯(cuò)配2.在擴(kuò)增DNA的3末端加上非預(yù)設(shè)堿基3.對(duì)每套引物和模板,PCR反應(yīng)的條件都需要優(yōu)化4.標(biāo)準(zhǔn)PCR不能有效擴(kuò)增大于3kb的DNA片段第十一章 基因操作中的核酸分析技術(shù)1、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)原理：是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡(jiǎn)單、快捷等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前被選作鑒定特定DNA或RNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實(shí)驗(yàn)方法。 原理：DNA/RNA分子與蛋白的結(jié)合導(dǎo)致了電泳時(shí)遷移率的降低。 實(shí)驗(yàn)步驟：1、首先制備細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物（理論上其中含有某種特殊的轉(zhuǎn)錄因子）2、用放射性同位素標(biāo)記待檢測(cè)的DNA片段（含有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位

37、點(diǎn)）3、這種被標(biāo)記的探針DNA同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物一起進(jìn)行溫育，于是產(chǎn)生DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物4、在控制使DNA-蛋白質(zhì)保持結(jié)合狀態(tài)的條件下，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳5、最后進(jìn)行放射自顯影，分析電泳結(jié)果凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的作用：1 . 鑒定在特殊類(lèi)型細(xì)胞的提取物中，是否存在與某一特定DNA片斷結(jié)合的蛋白質(zhì)分子 2. 研究發(fā)生此中結(jié)合之精確的DNA序列的特異性。（加入超量的非標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)DNA）3.可以間接的闡明體內(nèi)發(fā)生DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。 (1). 用具有已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)DNA，可檢測(cè)蛋白是否屬于此類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子 (2). 在競(jìng)爭(zhēng)DNA的已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上，引入突變可評(píng)估突變對(duì)競(jìng)爭(zhēng)D

38、NA性能及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的影響。2、DNase 足跡實(shí)驗(yàn)原理：是一類(lèi)用于檢測(cè)與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性的專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。足跡實(shí)驗(yàn)的一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)是，可以形象地展示出一種特殊的蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域。實(shí)驗(yàn)原理： 當(dāng)DNA分子中的某一區(qū)段同特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合之后便可以得到保護(hù)而免受DNaseI酶的切割作用，而不會(huì)產(chǎn)生出相應(yīng)的切割分子，結(jié)果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現(xiàn)了一個(gè)空白區(qū)，俗稱(chēng)為“足跡”。實(shí)驗(yàn)步驟：1、將待檢測(cè)的雙鏈DNA分子在體外用32P作5末端標(biāo)記。 2、并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶切出其中的一個(gè)末端，于是便得到了一條單鏈末端標(biāo)記的雙鏈DNA3、在

39、體外同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物（細(xì)胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體 4、在反應(yīng)混合物中加入少量的DNaseI，并控制用量使之達(dá)到平均每條DNA鏈，只發(fā)生一次磷酸二酯鍵的斷裂（1）如果蛋白質(zhì)提取物中不存在與DNA結(jié)合的特定蛋白質(zhì)，使DNaseI消化之后，便會(huì)產(chǎn)生出距離放射性標(biāo)記末端1個(gè)核苷酸，2個(gè)核苷酸，3個(gè)核苷酸-等等一系列前后長(zhǎng)度均相差一個(gè)核苷酸的不間斷的連續(xù)的DNA片段梯度群體.（2）如果DNA分子同蛋白質(zhì)提取物中的某種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，被結(jié)合部位的DNA就可以得到保護(hù)免受DNaseI酶的降解作用.5、除去蛋白，加樣在20%序列膠上進(jìn)行電泳分離，實(shí)驗(yàn)分兩組： 實(shí)驗(yàn)組：DNA+蛋白質(zhì)混合

40、物 對(duì)照組：只有DNA，未與蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行溫育6、最后進(jìn)行放射性自顯影，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果使用較大的DNA片段，通過(guò)足跡實(shí)驗(yàn)便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質(zhì)因子之間的結(jié)合單位的分布狀況。如同凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)一樣，我們也可以加入非標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)DNA序列，來(lái)消除特定的“足跡”，并據(jù)此測(cè)定其核苷酸序列的特異性。 3、RNAi作用機(jī)制（1）起始階段：病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常產(chǎn)生一些dsRNA。這些dsRNA被胞質(zhì)中的Dicer酶切割成多個(gè)具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA（大約2123 bp），即siRNA 。（dicer是RNase

41、 III家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴(lài)的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA）siRNA的特點(diǎn)：3端均有23個(gè)突出的核苷酸（2）效應(yīng)階段：siRNA雙鏈結(jié)合核酶復(fù)合物形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex, or RISC）。在ATP存在情況下，siRNA雙鏈展開(kāi)激活RISC，激活的RISC即可通過(guò)堿基互補(bǔ)與外源性基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點(diǎn)即是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。 被切割后的斷裂mRNA隨即降解，使與此m

42、RNA相應(yīng)的特定基因( targetgene)表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄默狀態(tài)。（3）擴(kuò)增擴(kuò)散階段：siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA。 依次循環(huán)：新合成的長(zhǎng)鏈dsRNA同樣可被Dicer切割、降解生成大量的次級(jí)siRNA。次級(jí)siRNA又可進(jìn)入合成一切割的循環(huán)過(guò)程，進(jìn)一步放大RNAi作用。4、RNAi現(xiàn)象的特征 RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制；靶基因內(nèi)源性序列不發(fā)生改變，即RNAi不引起穩(wěn)定的遺傳改變。 RNAi具有很高的特異性；siRNA的序列專(zhuān)一性要求