Chapter 4 離子交換和體積排除色譜1

1、2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 2 離子交換色譜（IEC） 原理 保留的影響因素 例子 體積排除色譜（SEC） 原理 校正曲線 凝膠過濾與凝膠滲透 影響保留的因素 例子2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 32009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 42009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENT

2、IAL 5強弱強交換劑在pH 2 至12的范圍內(nèi)保持離子狀態(tài)弱交換劑在pH 改變時可能會變?yōu)榉请x子化狀態(tài)2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 6優(yōu)點高柱效小顆粒沒有收縮或膨脹機械穩(wěn)定性好能耐受有機溶劑價格低缺點2 pH 7低容量（meg/g）2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 7聚苯乙烯二乙烯基苯的合成（聚苯乙烯二乙烯基苯的合成（PSDVB）其他聚合物基礎(chǔ)上的離子交換例, 甲基丙烯酸酯2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 82

3、009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 9優(yōu)點 1 pH Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg2+Mn2+Ag2+Cs2+Rb2+K+NH4+Na+H+Li+ Li是最弱的 陰離子交換劑檸檬酸鹽3-SO22-草酸鹽2-I-NO3-CrO4-Br-SCN-Cl-醋酸鹽-OH-F- 氟化物是最弱的2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 16 流動相：1M KH2PO4，pH 3.8 柱溫：60 流速：4ml/min 色譜柱：Silica SCX4050602009 Wa

4、ters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 17 氨基酸 典型的應(yīng)用，由Moore 和Stein在上世紀(jì)50年代末發(fā)展而來 蛋白質(zhì) 無機離子 也稱離子色譜2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 182009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 19色譜柱：陽離子交換柱洗脫劑A：0.2 N Na+ pH=3.0洗脫劑B：0.2 N Na+ pH=9.8梯度：0-100% B in 48 min流速：0.4 ml/min2009 Waters Corporati

5、on | COMPANY CONFIDENTIAL 20 可應(yīng)用于多有的蛋白質(zhì) 對生物活性有非常好的重現(xiàn)性 對電荷差別特別小的蛋白質(zhì)分離能力非常強 對濃度小體積大的樣品分離能力很好 是可分離的質(zhì)量數(shù)最高 可有多種途徑改善分離效果2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 21pl，等電點陽離子交換劑陰離子交換劑pH蛋白質(zhì)電荷是pH的函數(shù)2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 22填料粒徑：5-40m色譜柱內(nèi)徑：5-50mm 長度 5-30cm類型陰離子陽離子強季胺磺酸磺酸鹽弱二乙基氨乙基 (

6、Diethylamine,DEAE)羧甲基(Carboxymethyl ,CM)2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 23凈電荷數(shù)2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 24問題：你認(rèn)為這三問題：你認(rèn)為這三種蛋白質(zhì)哪一種會種蛋白質(zhì)哪一種會最后一個被洗脫出最后一個被洗脫出來？來？注：這三種蛋白質(zhì)的凈電荷均等于12009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 25色譜柱：Protein Pak DEAE 8HR 10100mm（陰離子交換）流速

7、：1.5ml/min梯度：0-200mM NaCl緩沖鹽：20mM TRIS-HClC=Conalbumin （伴清蛋白）T=Transferrin （鐵傳遞蛋白）O=Ovalbumin （卵清蛋白）S=Soybean trypin inhibitor（大豆胰島素抑制劑）2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 26用于pH梯度的Waters Auto BlendTM 方法2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 27色譜柱：Protein Pak DEAE 8HR 10100mm(陰離子交

8、換)流速：1.5ml/min緩沖鹽：20mM TRIS-HCl pH 7.5梯度：0-200mM NaCl 0-200mM NaAcetateC=Conalbumin （伴清蛋白）T=Transferrin（鐵傳遞蛋白）O=Ovalbumin （卵清蛋白）S=Soybean trypin inhibitor（大豆胰島素抑制劑）NaClNaAcetateCTOSSCTO2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 28色譜柱：Protein Pak SP 8HR 10100mm(陰離子交換)流速：1.5ml/min梯度：0-300mM NaCl緩沖

9、鹽： 20mM Na Phosphate pH 5.5 20mM Na Acetate pH 5.5A=Alpha Chymotrypsinogen(胰凝乳蛋白酶原)R=Ribonuclease A（核糖核酸酶）C=Cytochrome C（細(xì)胞色素)L=Lysozyme(溶解酵素)2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 29色譜柱：Water IC-Pak A HR洗脫：硼酸鹽/葡(萄)糖酸鹽流速：1.0ml/min檢測器：電導(dǎo)檢測器2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 30色譜柱：

10、Water IC-Pak C M/D洗脫：3.0 mM HNO3流速：1.0ml/min檢測器：電導(dǎo)檢測器1.鋰2. 鈉3. 氨4.鉀5.鎂6.鈣7.鍶8.鋇2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 31氣相色譜液相色譜吸附/分離液相色譜離子交換體積排除色譜凝膠滲透/凝膠過濾2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 32待測無經(jīng)過一個多孔凝膠固定相凝膠孔徑可能是一種也可能是幾種的混合，取決于所選用的柱子分離取決于在溶液中的大小而不是分子量大的先出，小的后出流向流向凝膠顆粒凝膠顆粒凝膠顆粒凝膠

11、顆粒2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 332009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 34 凝膠過濾（GFC） 此名詞原用于描述生物聚合物SEC，現(xiàn)在也指水相SEC。蛋白，多糖等，洗脫液常為水相。 凝膠滲透（GPC） 此名詞原用于描述有機聚合物SEC，現(xiàn)在也指有機相SEC。聚乙烯，聚丙烯等，洗脫液常為有機相，如THF或甲苯。常采用高溫90140（高溫GPC）2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 352009 Waters Corp

12、oration | COMPANY CONFIDENTIAL 36 交聯(lián)環(huán)氧丙氧基甲基丙烯酸酯 表面含有醇或二醇官能團(tuán) 親水性，阻止與極性化合物的反應(yīng) 表面通常有負(fù)電荷 疏水性待測組分可與反相填料發(fā)生作用 交聯(lián)聚乙烯醇2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 372009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 382009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 39 色譜柱類型/孔大小 粒徑 流速 離子強度（克服IEX與表面的負(fù)電荷的反應(yīng)） 有機溶劑（

13、克服與反相疏水填料的反應(yīng)） 柱溫2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 40 色譜柱：Protein Pak 60+125+300SW 洗脫液：100mM 磷酸鹽 pH 7.4 流速：2ml/min 樣品：5mg 酶混合樣2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 41 由Moore在上世紀(jì)60年代在Dow化學(xué)公司開發(fā)的 GPC 是塑料工業(yè)的官方認(rèn)可的方法，并被美國材料測試協(xié)會（ASTM）所采用，用于測聚合物分子量 聚乙烯（ Polyethene，PE） 塑料袋 聚丁二烯（Polybutad

14、iene ）橡膠輪胎 聚氯乙烯（ Polyvinychloride，PVC）合成革，水管 聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA）有機玻璃 聚碳酸酯（polycarbonate）CD光盤2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 42 聚合物科學(xué)家指出聚合物鏈的長度或大小作為其流體力學(xué)體積（hydrodynamic volume）與分子量大小相關(guān)。 分子量分布是組成一個聚合物的分子統(tǒng)計學(xué)的顯示。聚合物有一系列的鏈長度的分布，因而產(chǎn)生分子量。 分布的形狀是聚合過程（游離基、縮合等）的反映。 如果聚合物易于降解（熱解、氧化），聚合物鏈的側(cè)鏈斷裂，會導(dǎo)致分子量

15、分布的變化。 凝膠滲透色譜分析可以測定聚合物的平均分子量或其力矩與分布。2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 43洗脫曲線形狀可表達(dá)根據(jù)不同分子量相對含量所表示的聚合物分配洗脫體積洗脫體積 (保留時間保留時間)最大最大最小最小MnMwMzMpMz+1BigOnesComeOut First2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 442009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 452009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 462009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 47離子交換色譜根據(jù)化合物離子的差異進(jìn)行分離重要參數(shù)包括：1 流動相的離子強度（k）2 pH（k，）3 溫度（k， ）4 共存離子（ ）5 有機溶劑（ k， ）6 柱型號、IEX的強弱2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 48 SEC 分離溶液中大小/分子量不同的化合物 最重要的參數(shù)是填料的孔徑 分兩