ITC introduce(等溫滴定量熱)

1、Isothermal Titration Calorimetry 等溫滴定量熱ITC：測定分子相互作用的方法：測定分子相互作用的方法u在一次實驗中，在一次實驗中，ITC可以測定：可以測定：u結(jié)合的結(jié)合的親和力常數(shù)（親和力常數(shù)（K）；u結(jié)合反應(yīng)中的結(jié)合反應(yīng)中的焓變焓變和和熵熵變（變（H、S）；u結(jié)合位點結(jié)合位點數(shù)數(shù)（n）實驗也可以測定有多個結(jié)合位點的樣品實驗也可以測定有多個結(jié)合位點的樣品等溫等溫滴定量熱儀滴定量熱儀(ITC)神奇的微量熱控制功率補償Isothermal Titration Calorimetry實驗流程實驗流程u1) 樣品池中加入待測樣品池中加入待測大分子；大分子；u2) 參照池

2、中加入緩沖參照池中加入緩沖液；液；u3) 將待測配體吸入將待測配體吸入注射器中；注射器中；u4) 注射器置于樣品池注射器置于樣品池中；中；u5) 調(diào)整溫度、攪拌速度和每次注射調(diào)整溫度、攪拌速度和每次注射體積。體積。典型的典型的 ITC 數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)上半部分表示每次注射采集的上半部分表示每次注射采集的數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)；下下半部分表示每次注射的釋放的半部分表示每次注射的釋放的熱量；（熱量；（上圖中每個峰的面積積分）對滴定抗原與樣品池中抗體的摩爾比上圖中每個峰的面積積分）對滴定抗原與樣品池中抗體的摩爾比作圖作圖ITC 理論理論基礎(chǔ)基礎(chǔ)uG=-RT lnKBuG = H TS令人郁悶的公式說明了什么？令人郁悶的

3、公式說明了什么？1. 相同的相同的KD有著相同的有著相同的G；2. 相同的相同的G卻有著不同的卻有著不同的H與與S組合。組合。引發(fā)焓變和熵變的主要引發(fā)焓變和熵變的主要因素因素Enthalpy (-H) 焓變Hydrogen bonds氫鍵Ionic interactions離子作用特異性結(jié)合Entropy (+S)熵變Hydrophobic interactions疏水作用Conformational freedom構(gòu)象自由度非特異性結(jié)合ITC 技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域領(lǐng)域u分子相互作用分子相互作用：溶液溶液中的幾乎所有天然狀態(tài)分子：中的幾乎所有天然狀態(tài)分子： 包括蛋白質(zhì)、包括蛋白質(zhì)、核酸、多

4、肽核酸、多肽、藥物分子、藥物分子、脂、脂類、金屬離子、小類、金屬離子、小分子等等分子等等；u工藝工藝過程的開發(fā)和過程的開發(fā)和控制控制u酶動力學酶動力學u藥物研發(fā)藥物研發(fā)u非非生物系生物系統(tǒng)統(tǒng)抗生素抗性的菌種為什么能更好抗生素抗性的菌種為什么能更好的消滅抗生素的消滅抗生素DNA形成了三螺旋形成了三螺旋？藥物結(jié)合的熱動力學藥物結(jié)合的熱動力學特征特征一樣的親合力，不一樣的一樣的親合力，不一樣的微觀世界微觀世界HIVHIV蛋白酶抑制劑開發(fā)的蛋白酶抑制劑開發(fā)的“成長煩惱成長煩惱”ITCITC在小分子藥物結(jié)構(gòu)方面的在小分子藥物結(jié)構(gòu)方面的優(yōu)化優(yōu)化u抗瘧疾新藥就這樣放棄嗎抗瘧疾新藥就這樣放棄嗎？Kd = 76

5、 nMH = -6.0 kcal/molH = -4.8 kcal/mol-TS = 5.7 kcal/molKd = 0.5 nMH = -5.5 kcal/molH = -4.3 kcal/mol-TS = 2.2 kcal/mol酶反應(yīng)動力學的酶反應(yīng)動力學的研究研究u傳統(tǒng)酶分析法的傳統(tǒng)酶分析法的局限性局限性（連續(xù)（連續(xù)分析法，不連續(xù)分析法，分析法，不連續(xù)分析法，偶合分析偶合分析法）法）1. 1. 溶劑不透明或有混濁并對光譜溶劑不透明或有混濁并對光譜檢測檢測有干擾；有干擾；2. 2. 天然的、重組的或突變的天然的、重組的或突變的酶活酶活性低于性低于分析方法的檢測限；分析方法的檢測限；3.

6、3. 產(chǎn)物或底物沒有光譜基團或產(chǎn)物或底物沒有光譜基團或熒熒光基團光基團，或者標記的成本太高或太，或者標記的成本太高或太耗時；耗時；4. 4. 不連續(xù)分析要求多步進行；不連續(xù)分析要求多步進行；5. 5. 不存在直接的偶合反應(yīng)；不存在直接的偶合反應(yīng)；6. 6. 偶合分析不精確；偶合分析不精確；7. 7. 底物或酶活性不清楚；底物或酶活性不清楚；8. 8. 蛋白質(zhì)功能不清楚。蛋白質(zhì)功能不清楚。uITCITC的優(yōu)點的優(yōu)點1. 1. 方法開發(fā)簡單；方法開發(fā)簡單；2. 2. 只要反應(yīng)過程中有熱量變化，只要反應(yīng)過程中有熱量變化， ITC即即可作為普適的方法；可作為普適的方法；3. 3. 是一項靈敏的技術(shù)是一

7、項靈敏的技術(shù)-噪音水平噪音水平0.01cal/sec，利用現(xiàn)在的先進，利用現(xiàn)在的先進儀器儀器可可以獲得很高的信噪比；以獲得很高的信噪比；4. 4. 無需帶熒光或光譜特征的底物無需帶熒光或光譜特征的底物參與反參與反應(yīng)應(yīng)；5. 5. 單次實驗即可獲得數(shù)據(jù)；單次實驗即可獲得數(shù)據(jù)；6. 6. 適用于研究多種類型的酶適用于研究多種類型的酶;7. 7. 可以用于不透明的樣品可以用于不透明的樣品;8. 8. 所得數(shù)據(jù)可以與其它方法進行比較；所得數(shù)據(jù)可以與其它方法進行比較；9. 9. 除了獲得熱力學數(shù)據(jù)外還可以除了獲得熱力學數(shù)據(jù)外還可以獲得動獲得動力學數(shù)據(jù)。力學數(shù)據(jù)。酶反應(yīng)動力學的酶反應(yīng)動力學的研究研究(不一般的不一般的ITC曲線曲線）酶反應(yīng)動力學酶反應(yīng)動力學應(yīng)用應(yīng)用ITC ApplicationsITC ApplicationsEnzyme KineticsEnz