第4講新品種培育技術(shù) 2

1、第三篇 新品種培育技術(shù)第7章 細(xì)胞融合與體細(xì)胞雜交騾子：雄驢和雌馬交配所產(chǎn)的雜種叫驢騾。雌驢和雄馬交配所產(chǎn)的雜種叫馬騾。狼狗：狗與狼的雜交后代。雜交斑馬：由斑馬和馬科動物雜交產(chǎn)物獅虎：獅子和老虎的雜交產(chǎn)物。豹獅：美洲豹與獅子的后代。不親和性不親和性：在有性生殖過程中，由于生物個(gè)體的細(xì)胞或組織水平上的不協(xié)調(diào)而使受精或接合不能正常進(jìn)行，或是受精后不能產(chǎn)生后代的現(xiàn)象。例如：生殖細(xì)胞不能融合，或受精卵不能發(fā)育，或子代無繁殖能力等。不親和性是穩(wěn)定物種的重要機(jī)理之。種間不親和性：異種、異屬生物個(gè)體之間的生殖不親和現(xiàn)象常由染色體組的不同所造成種內(nèi)不親和性：種內(nèi)個(gè)體間的不親和現(xiàn)象往往是受不親和基因所制約。雜交

2、雜交：通過不同的基因型的個(gè)體之間的交配而取得某些雙親基因重新組合的個(gè)體。雜交優(yōu)勢：兩個(gè)遺傳基礎(chǔ)不同的植物或動物進(jìn)行雜交，其雜交后代所表現(xiàn)出的各種性狀均優(yōu)于雜交雙親，比如抗逆性強(qiáng)、早熟高產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良等一般情況下，種間、種內(nèi)雜交通過生殖細(xì)胞相互融合而達(dá)到。由體細(xì)胞相互融合達(dá)到這一結(jié)果的過程稱為體細(xì)胞雜交。遠(yuǎn)源雜交 遠(yuǎn)緣雜交：不同種屬之間，或是地理上遠(yuǎn)緣的種內(nèi)亞種之間個(gè)體的交配稱為遠(yuǎn)緣雜交。 由于種屬間存在著隔離機(jī)制，致使遠(yuǎn)緣雜交常表現(xiàn)不親和或獲得的遠(yuǎn)緣雜種表現(xiàn)不育。 體細(xì)胞雜交是解決遠(yuǎn)源雜交不親和性的有力手段之一，更好地利用自然界基因資源，培育新物種。部分野生品種的塊莖、果實(shí)雖不能食用，但它們的植

3、株具有較強(qiáng)的抗病蟲害、抗鹽堿性和耐寒能力。因此，用野生馬鈴薯和番茄分別與馬鈴薯、番茄作物雜交，培育出了生存能力較強(qiáng)的雜交系植物。雜交玉米等雜交植物比它們的親本更為健壯，產(chǎn)量更高。自然（Nature）2008年11月23日：中美科學(xué)家發(fā)現(xiàn)雜交植物比其親本生長更好的一個(gè)原因：負(fù)責(zé)光合作用和淀粉代謝的基因在白天要更為活躍。雜交擬南芥（中間）比其親本（左和右）要大 問題：有沒有可能培育出地下結(jié)土豆，地上結(jié)番茄的超級植物？1978年德國科學(xué)家梅歇爾斯將番茄與馬鈴薯進(jìn)行體細(xì)胞雜交育成薯番茄“泡馬豆”（po(tato)(to)mato）。馬鈴薯與番茄兩種原生質(zhì)體的融合率達(dá)4050。本節(jié)主要內(nèi)容1.細(xì)胞融合2

4、.體細(xì)胞雜交及其在育種中的應(yīng)用關(guān)鍵問題：細(xì)胞融合的原理、方法與關(guān)鍵環(huán)節(jié)第一部分 細(xì)胞融合一 定義與意義 細(xì)胞融合（Cell fusion）是指使用人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。 對于植物也叫“原生質(zhì)體融合”。親本細(xì)胞是體細(xì)胞，也叫“體細(xì)胞雜交（somatic cellhybridization）”。 由于它不僅能產(chǎn)生同種細(xì)胞融合，也能產(chǎn)生種間細(xì)胞的融合，因此細(xì)胞融合技術(shù)在創(chuàng)造新細(xì)胞、培育新品種方面意義重大。植物：體細(xì)胞雜交培育新品種動物：單克隆抗體生產(chǎn)（動物細(xì)胞生物制藥講授）二 細(xì)胞融合的分類1.材料：原生質(zhì)體（去除了細(xì)胞壁的裸露的細(xì)胞）、動物細(xì)胞2.從親本來源：（1）

5、同核體（Homokaryon）：基因型相同的細(xì)胞融合成的融合細(xì)胞稱為。（2）異核體（Heterokaryon）：來自不同基因型的融合細(xì)胞。3.從融合效果：（1）對稱融合（Symmetric fusion）：兩個(gè)完整的細(xì)胞間的融合（2）不對稱融合（Asymmetric fusion）：利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再與另外一個(gè)完整細(xì)胞進(jìn)行融合。三 發(fā)展歷史自發(fā)融合現(xiàn)象最初在動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。1858年發(fā)現(xiàn)正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞情況。動物體內(nèi)的破骨細(xì)胞也是自發(fā)融合形成的多核細(xì)胞。1962年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)一種叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞的

6、現(xiàn)象。20世紀(jì)70年代初，華裔加籍科學(xué)家高國楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)能促使植物原生質(zhì)體融合，開拓了植物細(xì)胞融合的研究。20世紀(jì)80年代，齊默曼（Zimmerman）等建立電場誘導(dǎo)細(xì)胞融合方法。四 細(xì)胞融合原理細(xì)胞膜磷脂分子擾動出現(xiàn)通道細(xì)胞橋主要環(huán)節(jié)（1）親本選擇（單細(xì)胞或原生質(zhì)體制備）（2）兩原生質(zhì)體或細(xì)胞互相靠近，粘附（3）質(zhì)膜融合形成細(xì)胞橋（4）胞質(zhì)滲透（5）細(xì)胞核融合（6）融合細(xì)胞篩選原生質(zhì)體及其制備（1）定義：去除細(xì)胞壁后裸露的細(xì)胞稱之為原生質(zhì)體（protoplast）。（2）特點(diǎn)：無細(xì)胞壁，可以方便地進(jìn)行遺傳操作、人工誘變、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移、細(xì)胞融合等操作。具有全能性，能再生細(xì)胞壁。（3）

7、制備與純化酶解法的建立1960年，英國科金第一次采用酶方法從番茄幼苗大量制備出原生質(zhì)體。使植物細(xì)胞融合技術(shù)得以建立。植物細(xì)胞的細(xì)胞壁主要成分是纖維素（纖維素微纖絲Cellulose microfibrils ）、果膠（pectin）、多糖（glycan）。果膠酶、纖維素酶等處理植物組織，可以破壞胞間層和去掉細(xì)胞的纖維素外壁，得到游離的裸露原生質(zhì)體。4 分離、鑒定與活力分析（1）分離飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖、Percoll、Ficoll等。 Percoll是經(jīng)過聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl pyrolidone, PVP) 處理的硅膠顆?；鞈乙海瑢?xì)胞無毒性和刺激性。Percoll混懸

8、液的硅膠顆粒大小不一，經(jīng)過高速離心后，可形成一個(gè)連續(xù)密度梯度，將比重不同的細(xì)胞分離純化。 離心法：低速離心，收集沉淀。（2）鑒定與活力分析低滲爆破：爆破后是無形的。滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。染色發(fā)法：有活力的原生質(zhì)體吸收不同染料顯示與死亡細(xì)胞不同的顏色來分析。FDA（二乙酸熒光素）能自由地穿越細(xì)胞質(zhì)膜，在活細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素），由于熒光素不能自由通過質(zhì)膜，因而可以在熒光顯微鏡下通過具熒光的細(xì)胞的觀察確定細(xì)胞活性。關(guān)鍵：細(xì)胞核的融合若是沒發(fā)生細(xì)胞核的融合，僅發(fā)生了細(xì)胞質(zhì)的融合，則可能成為嵌合細(xì)胞。含有多個(gè)核的異核細(xì)胞合并后形成的單核細(xì)胞稱為合核細(xì)胞。細(xì)胞核的合

9、并發(fā)生在有絲分裂過程中。但是這種有絲分裂只有當(dāng)兩個(gè)核的DNA合成基本同步時(shí)才能發(fā)生：兩個(gè)核同時(shí)進(jìn)行有絲分裂，形成一個(gè)紡錘體，全部染色體都排列在一個(gè)赤道板上，結(jié)果伴隨著細(xì)胞分裂就形成了單核的子細(xì)胞，其細(xì)胞核中含有雙親細(xì)胞的染色體。五 細(xì)胞融合方法1. 生物法病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合：研究最早的細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法。主要是由于病毒會與宿主細(xì)胞膜直接融合，同時(shí)進(jìn)入兩個(gè)細(xì)胞就會打破兩個(gè)細(xì)胞膜的隔閡，引發(fā)細(xì)胞質(zhì)的交流，進(jìn)而達(dá)到細(xì)胞融合的目的。原因可能是病毒的磷脂外衣與動物細(xì)胞膜相似，病毒外殼上的某些糖蛋白有促進(jìn)細(xì)胞融合的功能。仙臺病毒、皰疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙臺病毒（HAJ）是兩層磷脂組成的外膜包裹著R

10、NA與蛋白質(zhì)的復(fù)合體。因HAJ病毒毒力弱，易被滅活而常采用。缺點(diǎn)：要提前大量培養(yǎng)病毒，并且滅活后才能作為融合劑使用，操作繁瑣，而且一旦滅活不充分的話，病毒還可能感染操作者與親本細(xì)胞。因此，目前已經(jīng)很少使用病毒誘導(dǎo)法進(jìn)行細(xì)胞融合。（1）足夠量的病毒顆粒附著在細(xì)胞膜上起搭橋作用，使細(xì)胞聚集在一起。（2）通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間相滲透，胞質(zhì)互相融合。粘結(jié)部位質(zhì)膜被破壞，不同細(xì)胞間形成通道，細(xì)胞質(zhì)流通并融合（病毒也隨之進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)）。（3）有絲分裂，細(xì)胞核融合，形成雜種細(xì)胞。2 化學(xué)法 可以采用的化學(xué)誘導(dǎo)劑包括： NaNO3、高pH的高濃度Ca2+離子、聚乙二醇 （PEG）、溶菌酶

11、、明膠、抗體、植物凝血素伴刀豆球蛋白A等。 細(xì)胞膜電荷平衡被打破。離子、聚乙二醇（1）NaNO3誘導(dǎo)融合1909年，凱斯特（Kuster）發(fā)現(xiàn)機(jī)械分離的發(fā)生了質(zhì)壁分離的洋蔥表皮細(xì)胞原生質(zhì)體在NaNO3溶液中可以恢復(fù)并伴隨著細(xì)胞融合。1972年，卡爾森（Carlson）利用NaNO3誘導(dǎo)融合了粉蘭煙草和郎氏煙草原生質(zhì)體，培育出世界第一株體細(xì)胞雜種。NaNO3的鈉離子可以中和原生質(zhì)體表面負(fù)電荷，引起原生質(zhì)體聚集，促進(jìn)細(xì)胞融合。NaNO3對原生質(zhì)體無損害，但融合效率低，一般小于4%。（2）高pH的高濃度Ca2+離子誘導(dǎo)融合1973年，凱勒（Keller）和梅爾切斯（Melchers）發(fā)現(xiàn)采用強(qiáng)堿性（

12、例如pH10.5）的高濃度鈣離子溶液（50mmol/LCaCl22H2O）在37下處理兩個(gè)品系的煙草葉肉原生質(zhì)體，很容易促使融合，融合率可以達(dá)到10%。 鈣離子中和原生質(zhì)體膜或細(xì)胞膜表面電荷，使彼此緊密接觸，決定質(zhì)膜的穩(wěn)定性和可塑性；高pH能改變質(zhì)膜的表面電荷，利于細(xì)胞融合。（3）PEG誘導(dǎo)聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)是一種多聚化合物，分子式為H(OHCH2-CH2)nOH)。常用的PEG平均分子量在20020,000之間，分子量1,000以下者為液體，1,000以上者為固體。PEG分子具有輕微的負(fù)極性，可以與具有正極性基團(tuán)的水分子、蛋白質(zhì)、碳水化合物形成氫鍵，在

13、相鄰的原生質(zhì)體間起到分子橋的作用，使原生質(zhì)體接觸。當(dāng)PEG分子被洗脫時(shí)，膜電荷發(fā)生紊亂而重新分配。此時(shí)，一種原生質(zhì)體上帶正電的基團(tuán)可能與另外一個(gè)原生質(zhì)體中帶負(fù)電的基團(tuán)相連，導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。（4）高Ca2+和pH誘導(dǎo)PEG結(jié)合誘導(dǎo) 在高Ca2+和pH溶液的作用下，將與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，將進(jìn)一步加劇電荷平衡失調(diào)，從而提高融合的幾率。因此，PEG結(jié)合高pH的高濃度Ca2+離子誘導(dǎo)融合方法成為一種較常用的細(xì)胞融合方法 優(yōu)點(diǎn)：基于PEG的誘導(dǎo)融合優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。 缺點(diǎn)：是融合過程繁瑣，PEG可能對細(xì)胞有毒害。細(xì)胞融合例子1甘藍(lán)與大白

14、菜的化學(xué)誘導(dǎo)融合3 物理法電融合誘導(dǎo)法（Electrofusion）：利用電場來誘導(dǎo)細(xì)胞彼此連接成串，再施加瞬間強(qiáng)脈沖促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，促進(jìn)細(xì)胞融合的技術(shù)。原理：在直流電脈沖的刺激下，細(xì)胞膜或原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞或原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。優(yōu)點(diǎn)：融合率高、重復(fù)性與可控制性強(qiáng)。缺點(diǎn)：可能會造成不可恢復(fù)的細(xì)胞損傷。BLS細(xì)胞融合儀（1）聚集：在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，極化產(chǎn)生偶極子，彼此靠近，定向排列成串球狀。（2）細(xì)胞膜融合：在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體膜兩側(cè)產(chǎn)生電勢，正負(fù)電荷相吸，細(xì)胞膜變薄，觸發(fā)膜的穿孔（

15、質(zhì)膜瞬間破裂）。（3）異核體：膜之間形成通道，細(xì)胞質(zhì)等得以交換、融合。（4）融合細(xì)胞：細(xì)胞核融合。細(xì)胞融合舉例2薄荷的電誘導(dǎo)融合親本：E33、E47兩個(gè)薄荷親本原生質(zhì)體（5-9105），0.7M山梨醇。儀器：Eppendorf電轉(zhuǎn)儀、融合杯（-250微升，-50微升）觀察：DAPI染色：4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚是一種常用的熒光染料，與DNA的雙鏈緊密結(jié)合。結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團(tuán)的吸收峰是358 而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激發(fā)波長正好是356nm。染色標(biāo)記細(xì)胞核的位置。參數(shù)： 電壓：1.5-3V，超過2V破裂，選1.5V。脈沖電壓：0-300V。脈沖時(shí)間：30-60S，每次增加1

16、0S，40S最佳。六 融合細(xì)胞篩選 因融合的隨機(jī)性而成為細(xì)胞融合的關(guān)鍵而必需的技術(shù)。 1篩選的原因與必要性 細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的物理過程，經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)，需要通過培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細(xì)胞，分離出需要的雜種細(xì)胞，從而解決融合細(xì)胞的選擇問題。 問題：A與B融合過程中，你能預(yù)見有哪些 形式的細(xì)胞嗎？ A-B，A-A，B-B， A-A-A，B-B-B，A-A-B,B-B-A等多聚體。 未融合的A，B。2雜種細(xì)胞篩選方法（1）細(xì)胞形態(tài)大小差異（2）選擇性培養(yǎng)基篩選法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞的方法。例如：利用抗性標(biāo)記、酶缺陷型、激素需求差異等。親本原生質(zhì)體生長要求外源激素，而有的雜種細(xì)胞由于雙親互補(bǔ)作用會產(chǎn)生內(nèi)激素，從而使雜種細(xì)胞能在無激素的培養(yǎng)基上生長。（3）再生后雜種與親本形態(tài)、性質(zhì)差異細(xì)胞融合例子3：利用抗性標(biāo)記進(jìn)行第二部分體細(xì)胞雜交及其在育種中的應(yīng)用一 體細(xì)胞雜交育種的意義1利于克服有性不親和性，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)源遺傳重組。2問題：與基因工程改造相比有什么優(yōu)點(diǎn)？植物的抗逆性多為多基因控制，因此易于實(shí)現(xiàn)多基因控制性狀。 3利于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)遺傳形狀的重組。