低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯的制備和其化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

1、低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯的低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯的制備和其化學(xué)結(jié)構(gòu)分析制備和其化學(xué)結(jié)構(gòu)分析答辯人：薛霖答辯人：薛霖專專 業(yè)：食品科學(xué)與工程業(yè)：食品科學(xué)與工程導(dǎo)導(dǎo) 師：趙雪師：趙雪 教授教授 2013年6月6日研究背景研究背景海帶海帶紅外光譜紅外光譜分析分析硫酸根硫酸根含量含量相對(duì)分相對(duì)分子質(zhì)量子質(zhì)量總糖總糖研究背景研究背景海帶海帶活性活性抗凝血抗凝血抗病毒抗病毒增強(qiáng)免疫增強(qiáng)免疫抗腫瘤抗腫瘤抗血栓抗血栓研究現(xiàn)狀研究現(xiàn)狀2 對(duì)低分子量的巖藻聚糖硫酸酯的消化吸收、免疫活性和抗流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制作用的比較研究很少3 加工的海帶中含有豐富的褐藻酸鈉、碘以及甘露醇，而加工隨之產(chǎn)生大量巖藻聚糖硫酸

2、酯，往往都作為廢棄物丟棄，造成了很大的資源浪費(fèi)1 目前低分子量的巖藻聚糖硫酸酯的制備和應(yīng)用的研究還相對(duì)較少，尤其是分子量對(duì)消化吸收及活性的比較研究鮮有報(bào)道研究意義研究意義 熟悉海帶巖藻聚糖硫酸酯的提取工藝熟悉海帶巖藻聚糖硫酸酯的提取工藝1 對(duì)提取的粗糖進(jìn)行化學(xué)分析對(duì)提取的粗糖進(jìn)行化學(xué)分析2分離純化提取的粗糖，再對(duì)其做比較分析分離純化提取的粗糖，再對(duì)其做比較分析3 巖藻聚糖硫酸酯氧化降解，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備巖藻聚糖硫酸酯氧化降解，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備4 巖藻聚糖硫酸酯分離純化、結(jié)構(gòu)分析巖藻聚糖硫酸酯分離純化、結(jié)構(gòu)分析 用冷水浸提法從海帶中提用冷水浸提法從海帶中提取巖藻聚糖硫酸酯，為后面的取巖藻聚糖硫酸

3、酯，為后面的分離純化做好準(zhǔn)備。分離純化做好準(zhǔn)備。 對(duì)提出來的巖藻聚糖硫酸對(duì)提出來的巖藻聚糖硫酸酯測(cè)定其總糖含量，單糖組成，酯測(cè)定其總糖含量，單糖組成，硫酸根含量，紅外光譜分析，硫酸根含量，紅外光譜分析，相對(duì)分子質(zhì)量和蛋白質(zhì)含量。相對(duì)分子質(zhì)量和蛋白質(zhì)含量。 對(duì)分離純化后的巖藻聚糖對(duì)分離純化后的巖藻聚糖硫酸酯測(cè)定其總糖含量，單糖硫酸酯測(cè)定其總糖含量，單糖組成，硫酸根含量，紅外光譜組成，硫酸根含量，紅外光譜分析，相對(duì)分子質(zhì)量和蛋白質(zhì)分析，相對(duì)分子質(zhì)量和蛋白質(zhì)含量。含量。 對(duì)其進(jìn)行自由基氧化降解，對(duì)其進(jìn)行自由基氧化降解，為安全、高效的抗血栓活性的為安全、高效的抗血栓活性的巖藻聚糖硫酸酯的研究奠定基巖藻

4、聚糖硫酸酯的研究奠定基礎(chǔ)。礎(chǔ)。海帶海帶化學(xué)結(jié)構(gòu)分析化學(xué)結(jié)構(gòu)分析研究?jī)?nèi)容研究?jī)?nèi)容巖藻聚糖硫酸酯的制備巖藻聚糖硫酸酯的制備大分子量的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析大分子量的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析氧化降解制備低分子量氧化降解制備低分子量1.海帶巖藻聚糖硫酸酯提取工藝海帶巖藻聚糖硫酸酯提取工藝1235462.海帶化學(xué)結(jié)構(gòu)分析海帶化學(xué)結(jié)構(gòu)分析總糖含量總糖含量苯酚苯酚硫酸法硫酸法相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量凱高效液相色譜法凱高效液相色譜法硫酸根含量硫酸根含量離子色譜法離子色譜法單糖組成單糖組成柱前衍生高效液相色譜法柱前衍生高效液相色譜法紅外光譜分析紅外光譜分析Nicolet-Nexus 470傅立葉變換紅外光譜儀傅立葉變換紅外光譜儀蛋白

5、質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量folin酚法酚法2.海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析v實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1. 總糖含量總糖含量 根據(jù)線性回歸方程測(cè)定所提取的海帶多糖總糖含量約為根據(jù)線性回歸方程測(cè)定所提取的海帶多糖總糖含量約為66.7%。以巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硫酸苯酚法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算所提取的海帶多糖總糖含量。2.海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析v 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.相對(duì)分子質(zhì)量上圖為海帶巖藻聚糖硫酸酯的液相色譜圖，分子量分布較廣，范圍為5.4K-735K，重均分子量為698.7KDa，分布系數(shù)為4.24。選用Agillent1100高效液

6、相色譜儀；色譜柱:TSK-gel G4000 PWxl（7.830cm）；檢測(cè)器:示差檢測(cè)器（G1362A RID）；流動(dòng)相:0.2 mol/L NaCl;流速:0.5mL/min；柱溫:0； v實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3. 硫酸根含量 以為標(biāo)準(zhǔn)品，配制溶液，采用離子色譜法，制作硫酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)線性回歸方程及離子色譜譜圖分析計(jì)算得樣品中硫酸根含量。根據(jù)線性回歸方程及離子色譜譜圖分析計(jì)算得到樣品中硫酸根含量約根據(jù)線性回歸方程及離子色譜譜圖分析計(jì)算得到樣品中硫酸根含量約13.27%。2.海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析2.海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分

7、析v實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 4. 單糖組成選用Agilent 1100 高效液相色譜儀，ZORBAX Eclipse色譜柱XDB-C18分離柱（4.6250mm，5m）；245nm紫外檢測(cè)器(DAD)；流速為1.0mL/min；保持柱溫為25；流動(dòng)相A：10% (V/V )乙腈+ 0.1 mol/L乙酸銨-乙酸緩沖液( pH 5.5)；流動(dòng)相B：25% (V/V )乙腈+ 0.1 mol/L乙酸銨-乙酸緩沖液( pH 5.5)；時(shí)間梯度：040 min，濃度梯度：40% 100%，流動(dòng)相B。每次的進(jìn)樣體積設(shè)定為10L。樣品樣品Man（%）GlcN（%）Rha（%）GalN（%）GlcUA（%）Glc

8、（%）Gal（%）Xyl（%） Fuc（%）海帶硫酸多糖4.681.341.510.3222.582.1915.812.9148.63v實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 5. 紅外光譜分析2.海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析 由圖分析得：在3447左右有很強(qiáng)的糖的羥基(O-H)伸縮振動(dòng)吸收峰，2924左右有C-H 的伸縮振動(dòng)吸收峰，1635處有C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰，1411處有C=O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，1259附近有較強(qiáng)的S=O的對(duì)稱吸收峰，819處的吸收峰是COS伸縮振動(dòng)峰，它的位置與硫酸根在糖上的位置有關(guān)，表明硫酸根主要連接于糖的C2和C3位。v實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 6. 蛋白質(zhì)含量2

9、.海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析海帶巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程計(jì)算出海帶多糖中蛋白質(zhì)含量約為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程計(jì)算出海帶多糖中蛋白質(zhì)含量約為15.28%15.28%0.52%0.52%。以牛血清白蛋白BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)方程計(jì)算海帶多糖中蛋白質(zhì)含量。12343.3.海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化及純化后的化海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化及純化后的化學(xué)分析學(xué)分析陰離子交換色譜分級(jí)純化陰離子交換色譜分級(jí)純化總糖含量總糖含量苯酚苯酚硫酸法硫酸法 硫酸根含量硫酸根含量離子色譜法法離子色譜法法單糖組成單糖組成柱前衍生高效液相色譜法柱前衍生高效液相色譜法v實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.

10、巖藻聚糖硫酸酯的梯度洗脫3.3.海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化及純化后的化海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化及純化后的化學(xué)分析學(xué)分析 在巖藻聚糖硫酸酯的各級(jí)洗脫液中，由在巖藻聚糖硫酸酯的各級(jí)洗脫液中，由1.5mol/L1.5mol/L氯化鈉溶液洗脫氯化鈉溶液洗脫得到的組分含糖量最高。得到的組分含糖量最高。將粗巖藻聚糖硫酸酯通過Q-Sepharose FF陰離子交換色譜（5.8*30cm），分別用0、0.5、1.0、1.5、2.0mol/L NaCl溶液分步洗脫，用硫酸苯酚法檢測(cè)洗脫液的含糖量直到糖完全洗脫完畢。棄去H2O洗脫部分，分別收集其余組分。用截留分子量為1kDa的中空纖維超濾膜進(jìn)行超濾脫鹽，然

11、后分別濃縮凍干，測(cè)定各組分的單糖組成、總糖含量和硫酸根含量。v實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2. 總糖含量3.3.海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化及純化后的化海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化及純化后的化學(xué)分析學(xué)分析Nacl濃度濃度（mol/L）00.51.01.52.0 總糖總糖（%）61.4562.6364.5665.4776.64v實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3. 硫酸根含量3.3.海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化及純化后的化海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化及純化后的化學(xué)分析學(xué)分析 巖藻聚糖硫酸酯各級(jí)洗脫組分巖藻聚糖硫酸酯各級(jí)洗脫組分Nacl濃度濃度（mol/L）00.51.01.52.0硫酸根硫酸根(%)8.540.576.

12、770.469.980.8911.271.6518.411.95v實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 4. 不同分子量組分單糖組成的比較3.3.海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化及純化后的化海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化及純化后的化學(xué)分析學(xué)分析Nacl濃度濃度（mol/L）00.51.01.52.0Man1.01.423.813.011.2GlcN（D-(+)- 1.93.11.80.7Rha3.63.84.22.01.7GalN（D-(+)- 11.23.30.70.6GlcUA21.535.82.211.44.8Glc2.73.60.50.5Gal22.525.38.516.718.7Xyl2.62.25.01.2

13、3.2Fuc30.121.052.853.560.34. 巖藻聚糖硫酸酯氧化降解巖藻聚糖硫酸酯氧化降解14巖藻聚糖硫酸的氧化降解巖藻聚糖硫酸的氧化降解對(duì)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響對(duì)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響分子量的測(cè)定一高效液相色譜法（分子量的測(cè)定一高效液相色譜法（HPLC）的影響）的影響對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響4. 巖藻聚糖硫酸酯氧化降解巖藻聚糖硫酸酯氧化降解v 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1. 巖藻聚糖硫酸的氧化降解巖藻聚糖硫酸的氧化降解 采用2.5%過氧化氫降解高分子量巖藻聚糖硫酸酯，可以使巖藻聚糖硫酸酯的分子量迅速下降，分子量由原來的20萬左右，在1h、2h、3h的保留時(shí)間依

14、次為18.233,14.136,13.639min，其重均分子量分別為 42717Da、22484Da和10221Da。 其硫酸根含量由24.80%上升到33.2%。4. 巖藻聚糖硫酸酯氧化降解巖藻聚糖硫酸酯氧化降解v 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 低分子量巖藻聚糖硫酸酯的單糖組成分析組分組分fractionsFuc* *(%)Gal* *(%)Man* *(%)Rha* *(%)Glc* *(%)Xyl* *(%)GlcN* *(%)GlcUA* *(%)粗糖48.6315.814.681.512.192.910.8022.58DF60.2521.746.562.211.242.81.2 5.4* *所有單糖總

15、和為所有單糖總和為100%100%。4. 巖藻聚糖硫酸酯氧化降解巖藻聚糖硫酸酯氧化降解v實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2. 低分子量巖藻聚糖硫酸酯紅外光譜采用Agilent 1100 高效液相色譜儀，選用TSK-gel G3000 PWxl 色譜柱（Tosoh Bioscience）；用0.2mol/L的NaCl作為流動(dòng)相；洗脫速度為0.5mL/min；保持柱溫40，采用示差檢測(cè)器（G1362A）。4. 巖藻聚糖硫酸酯氧化降解巖藻聚糖硫酸酯氧化降解v 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 4. 巖藻聚糖硫酸酯氧化降解巖藻聚糖硫酸酯氧化降解v 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 比較紅外光譜分析圖4-1發(fā)現(xiàn)，中分子量巖藻聚糖硫酸酯組分F-1和F-2有共同的糖特征峰，在

16、3447cm-1處有強(qiáng)吸收，為O-H伸縮振動(dòng)峰；2942 cm-1為C-H伸縮振動(dòng)峰，圖中出現(xiàn)弱吸收，是巖藻糖甲基的吸收峰；1683 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，為結(jié)合水中的O-H 官能團(tuán)，1468 cm-1處的吸收峰表示C=O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，說明組分中含有一定量的糖醛酸；1252cm-1附近的強(qiáng)吸收峰是S=O對(duì)稱伸縮振動(dòng)特征峰，1055 cm-1附近是C-O彎曲振動(dòng)和O-H的變形振動(dòng)的強(qiáng)吸收峰，841 cm-1處的吸收峰表示C-O-S伸縮振動(dòng)，表明組分含有硫酸化多糖，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)這兩個(gè)組分均有硫酸基取代。v本章小結(jié)低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯的制備和其化學(xué)結(jié)低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯的制備和其化學(xué)結(jié)構(gòu)分析構(gòu)分析成功的從海帶中提取了海帶巖藻聚糖硫酸酯。成功的從海帶中提取了海帶巖藻聚糖硫酸酯。對(duì)沒有分離純化的海帶巖藻聚糖硫酸酯進(jìn)行了較詳細(xì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析。對(duì)沒有分離純化的海帶巖藻聚糖硫酸酯進(jìn)行了較詳細(xì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析。對(duì)提取的海帶巖藻聚糖硫酸酯進(jìn)行了分離純化，并檢測(cè)了各組分的總糖含量對(duì)提取的海帶巖藻聚糖硫酸酯進(jìn)行了分離純化，并檢測(cè)了各組分的總糖含量，硫酸根含量，相對(duì)分子量，紅外光譜分析和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。，硫酸