版藥典無菌檢查法與微生物鑒定

1、2015版藥典無菌檢查法與微生物鑒定方法抗生素室1無菌 是指某一物體或某一環(huán)境中不含有活的微生物。無菌檢查法 用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。 無菌操作 是指在無菌環(huán)境條件下，在對無菌制品或無菌器械等 進行檢驗的過程中，能防止微生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。2 無菌技術 是指在微生物試驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關措施，其中包括無菌環(huán)境設施、無菌試驗器材及無菌操作。 無菌檢查法的局限性 由于無菌是一個相對的概念，因此，對無菌檢查的結果應該有一個正確的認識即產(chǎn)品通過無菌檢查僅僅意味著在該檢驗條件下，供

2、試品未發(fā)現(xiàn)有微生物污染，并不表示所有的產(chǎn)品都是無菌的。反之，當供試品中檢出微生物污染，則可以認為批產(chǎn)品的微生物污染風險相當高。3從理論上來說，要確定某批產(chǎn)品的無菌性，應對每個容器進行無菌檢查。但是無菌試驗對樣品是破壞性的，因此不可能對每一最小包裝的產(chǎn)品進行檢查。統(tǒng)計概率的局限性 ：對于低污染水平的產(chǎn)品，其局限性在統(tǒng)計學上更為明顯。檢驗條件的局限： 樣品中污染的微生物的檢出受多種因數(shù)的影響，只有在各檢驗條件符合污染微生物的修復和生長時，才能保證被檢樣品的無菌檢驗結果的準確性。 污染的檢出率要比實際產(chǎn)品的污染率低。4無菌檢查存在檢查失誤的可能性：這可能是因為污染菌濃度太低，或是污染菌生長太慢，或是

3、因為培養(yǎng)基不良等原因，在培養(yǎng)期間污染菌根本就不生長。產(chǎn)品的染菌率愈小，錯判合格的可能性就愈大。所以在評價某個無菌制品的某個批的無菌狀態(tài)時，僅依靠最終產(chǎn)品的無菌檢查是不充分的，局限性較大。對無菌制品來說，生產(chǎn)最終產(chǎn)品的所有系統(tǒng)的工藝才是最重要的。52015版中國藥典無菌檢查法2015版中國藥典無菌檢查法的修訂無菌檢查法的方法適用性試驗無菌檢查法的注意事項62015版中國藥典無菌檢查法的修訂實驗環(huán)境的修訂檢查用培養(yǎng)基的修訂具體修訂內(nèi)容7實驗環(huán)境的修訂2010年版2015年版無菌檢查： 應在潔凈度10000級背景下的局部100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行。 無菌檢查： 應在潔凈度B級背景下的局

4、部A級單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行。 微生物限度檢查： 應在潔凈度10000級背景下的局部100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。 微生物限度檢查： 應在受控潔凈環(huán)境下（不低于D級）的局部不低于B級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。8修訂的依據(jù)修訂依據(jù)及意義：2010版GMP附錄一無菌藥品和附錄三生物制品中均規(guī)定，非最終滅菌產(chǎn)品各工序關鍵操作環(huán)境應為B級背景下的A級。無菌檢查的潔凈環(huán)境不得低于生產(chǎn)關鍵區(qū)的潔凈環(huán)境要求！ICH：檢查方法中要求“試驗應在無菌條件下進行，防止微生物污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出”。92015版中國藥典通則9203 藥品微生物實驗室質量管理指導原則9205 藥品潔凈實驗室微生物

5、監(jiān)測和控制指導原則9206 無菌檢查用隔離系統(tǒng)驗證指導原則10GMP2010年版對潔凈度的規(guī)定及確認標準50100200不作規(guī)定不作規(guī)定29000D級2550100290002900352000C級555102900352000293520B級111500個的規(guī)格為1ml的注射液，表1規(guī)定接種每種培養(yǎng)基的最少檢驗數(shù)量為20個或2（取較少者），表3規(guī)定全量接種。 直接接種法 每管培養(yǎng)基接種樣品的量6驗證（一次） 薄膜過濾法 每株菌20瓶，6株菌120瓶 直接接種法 40瓶+陽性無菌檢查 薄膜過濾法 40瓶+ 20瓶（陽性）=60瓶 32方法適用性試驗結果的判斷：與對照管比較，如含供試品的各試驗管

6、的實驗菌均生長良好，可照此檢查法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一試驗管的實驗菌生長微弱、緩慢或不生長，可采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基用量、使用中和劑、更換濾器品種等方法，重新進行方法驗證。33無菌檢查法的注意事項培養(yǎng)基的要求：靈敏度檢查符合規(guī)定。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基氧化層： 接種前：培養(yǎng)基氧化層的高度不超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則須經(jīng)100水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止過程中污染。 培養(yǎng)后：裝量與容器高度的比例應符合培養(yǎng)結束后培養(yǎng)基氧化層不超過培養(yǎng)基的1/2。34檢驗方法的選擇薄膜過濾法：一般采用封閉式濾器。只要供試品性質允許，應采用薄膜過

7、濾法。直接接種法：適用于無法用薄膜過濾法進行實驗的品種。35供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應與方法適用性試驗確認的方法相同。無菌試驗過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性，且對微生物無毒性。36常用中和劑比例0.1大豆卵磷脂0.11吐溫80卵磷脂、吐溫80及L組胺酸用于中和醛類及酚類化合物卵磷脂及吐溫80中和季銨鹽卵磷脂中和氯己定吐溫80中和雙三氯酚及汞化合物37薄膜過濾法水溶性供試液過濾前應先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后

8、，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml，且總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。38直接接種法除另有規(guī)定外，每個容器中培養(yǎng)基的用量應符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。供試品檢查時，培養(yǎng)基的用量和高度同方法適用性試驗。接種生物制品供試品的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的容器應分成兩等份，一份置3035培養(yǎng)，一份置2025培養(yǎng)。39供試品的無菌檢查陽性對照 應根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰

9、性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同方法適用性試驗，加菌量小于100CFU，供試品用量同供試品無菌檢查時每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)72 小時應生長良好。40供試品的無菌檢查陰性對照供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。41培養(yǎng)和觀察硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置3035，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置2025，培養(yǎng)14天。逐日觀察記錄。陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長。無菌檢查一次檢出！培養(yǎng)基渾濁，培養(yǎng)14天后不能判斷： 轉種至同種

10、新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)三天，或取培養(yǎng)液涂片，染色鏡檢。42結果判斷陽性（+）陰性（-） 供試品管渾濁，即判不合格 除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含的微生物。設備，環(huán)境的微生物監(jiān)控結果超標。 回顧實驗過程，發(fā)現(xiàn)污染因素。鑒定微生物，確認是操作引入的。無菌試驗經(jīng)確認無效，可重試。43實驗過程監(jiān)控表面監(jiān)控環(huán)境菌監(jiān)控手部監(jiān)控44環(huán)境微生物歸屬： 約大于50的革蘭氏陽性菌來自人員；30的革蘭氏陽性芽孢桿菌來自產(chǎn)品外包裝；酒精對革蘭氏陽性芽孢桿菌無效；革蘭氏陰性假單胞菌存在于新潔爾滅中；丁基膠塞會因負壓而將消毒劑中的污染菌引入樣品。45無菌程序保障無菌檢查樣品前處理：分批消毒、實驗（混合

11、） 統(tǒng)一消毒，統(tǒng)一實驗嚴格遵守外表面消毒程序：一般環(huán)境酚類 ，潔凈環(huán)境過氧乙酸+75%乙醇（無菌級）增加過程監(jiān)控力度：表面菌采樣、手部采樣（每批）、動態(tài)浮游菌采樣（下風口）46微生物鑒定微生物鑒定指導原則(通 則 9204)：為非無菌藥品微生物限度控制菌檢查中疑似 菌的鑒定，以及藥物原料、輔料、制藥用水、中間體、終產(chǎn)品和環(huán)境中檢出微生物的鑒定提供指導。當微生物的鑒定結果有爭議時，以 伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊 Bergey s Manual of Systematic Bacteriology現(xiàn)行版的鑒定結果 為準。47微生物鑒定 微生物鑒定是指借助現(xiàn)有的分類系統(tǒng)，通過對未知微生物的特征測定，對其進

12、行細菌、酵母菌和霉菌大類的區(qū)分， 或屬、種及菌株水平確定的過程，它是藥品微生物檢驗中的 重要環(huán)節(jié)，藥典通則相應章節(jié)中對檢出微生物的鑒定做了明 確規(guī)定，如 “非無菌產(chǎn)品的微生物檢查：控制菌檢査（通則 1106) ” 中選擇培養(yǎng)基或指示培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)的疑似菌落需進 行鑒定；對 “無菌檢查法(通 則 1101) ” 的陽性實驗結果中分離的微生物進行鑒定，以判定試驗是否重試；“藥品潔凈實 驗室微生物監(jiān)測和控制指導原則（通 則 9205) ” 中建議對潔 凈室和其他受控環(huán)境分離到的微生物進行鑒定，以掌握環(huán)境 微生物污染情況，有助于污染調(diào)查。48微生物分類界 （Kingdom） (Regnum)門 （Phy

13、lum） (Phylum)綱（Class） (Classis)目（Order） (Ordo)科（Family） (Familia)屬（Genus） (Genus)種（Species） (Species)49微生物分類每一分類單位之后可有亞門、亞綱、亞目、亞科.詞尾：門：-phyta，綱：-mycetes，目：-ales，科：-aceae，亞目：-ineae，亞科：-oideae。50種：是最基本的分類單位，一大群表型特征高度相似、親緣關系極其接近，與同屬內(nèi)其他種有明顯差別的菌株的總稱。 客觀存在，相對穩(wěn)定。來自共同祖先，有著相近的親緣關系。形態(tài)、生理特征上表現(xiàn)十分相似。存在差異和變異。變異發(fā)展

14、到一定程度，即形成新種或變種。51變種 ：種內(nèi)某一個體可能由于突變而發(fā)生變異，在自然選擇和人工選擇下，這種變異會在種內(nèi)不斷擴散，最后形成某些遺傳性不同于原種的一個群體。亞種：指某一明顯而穩(wěn)定的特征與模式種不同的種，有時稱小種。 在微生物學中，通常把實驗室所獲得的變異菌株稱之為亞種。型：同種微生物彼此之間的區(qū)別不如變種顯著，一般表現(xiàn)在菌體的化學組分上。如：結核桿菌人型、牛型和禽型。52菌株（strain）：又稱品系，指一種微生物的不同來源的純培養(yǎng)物，在微生物學的研究中運用最為廣泛。從自然界中分離到的每一個純培養(yǎng)物都可以稱為一個菌株或品系。自然界“種”有限，菌株無限。53 微生物鑒定需達到的水平視

15、情況而定，包括種、屬鑒定和菌株分型。大多數(shù)非無菌藥品生產(chǎn)過程和部分無菌生產(chǎn)環(huán) 境的風險評估中，對所檢出微生物的常規(guī)特征包括菌落形態(tài) 學、細胞形態(tài)學（ 桿狀、球狀、細胞群、孢子形成模式等）、革蘭染色或其他染色法、及某些能夠給出鑒定結論的關鍵生 化反應（如氧化酶、過氧化氫酶和凝固酶反應)進行分析，一 般即可滿足需要；非無菌產(chǎn)品的控制菌檢査一般應達到種 屬的水平；無菌試驗結果陽性和無菌生產(chǎn)模擬工藝（如培 養(yǎng)基灌裝） 失敗時，對檢出的微生物鑒定至少達到種屬水平 ，必要時需達到菌株水平。54菌株保藏中心美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC）美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心（NRRL）德國微生物菌種保藏中心（DS

16、MZ）荷蘭微生物菌種保藏中心（CBS）英國微生物菌種保藏中心（NCTC）中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心（CMCC）55微生物鑒定條件待鑒定的微生物必須是純種微生物，在鑒定前，需將菌株純化，獲得純培養(yǎng)物 。選取權威鑒定手冊。選擇適當鑒定方法，確定主要測試項目。56微生物鑒定程序待檢菌的分離純化初篩試驗表型微生物鑒定基因型微生物鑒定57經(jīng)典鑒定方法形態(tài)特征：大小，排列，分化，結構，染色等培養(yǎng)特征：營養(yǎng)要求，生長的物理環(huán)境（酸堿 度，溫濕度），菌落，菌苔，液體 培養(yǎng)特征。代謝特征：微生物生命活動的方式。如：I.M.Vit化學組成特征：細胞主要特征性化學成分的鑒定

17、 如：細胞壁成分、細胞內(nèi)含物抗原特征：抗原成為化學組成的一個特殊方面，微生物具有許多不同類型的抗原。生態(tài)特征：與其他生物的關系、自然界的分布、致病性等58待檢菌的分離純化 最常用 的分離純化方法是挑取待檢菌在適宜的固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃 線分離純化，以獲取待檢菌的純培養(yǎng)物（單個菌落）。59各類微生物的菌落特征微生物類別菌落特征單細胞微生物菌絲狀微生物細菌酵母菌放線菌霉菌主要特征細胞形態(tài)特征小而均勻、個別有芽孢大而分化細而均勻粗而分化相互關系單個分散或按一定方式排列單個分散或假絲狀絲狀交織絲狀交織菌落含水情況很濕或較濕較濕干燥或較干燥干燥外觀特征小而突起或大而平坦大而突起小而緊密大而疏松或大而致密參

18、考特征菌落透明度透明或稍透明稍透明不透明不透明菌落與培養(yǎng)基結合度不結合不結合牢固結合較牢固結合菌落的顏色多樣單調(diào)十分多樣十分多樣菌落正反面顏色差別相同相同一般不同一般不同細胞生長速度一般很快較快慢一般較快氣味一般有臭味多帶酒香常有泥腥味霉味60初篩試驗常規(guī)的微生物鑒定，一般要先進行初篩試驗確定待檢菌的基本微生物特征，將待檢菌做初步分類。常見的初篩試驗包括革蘭染色、芽孢染色、鏡檢觀察染色結果和細胞形態(tài)、重要的生化反應等。61區(qū)分葡萄球菌(過氧化氫酶陽性）和鏈球菌(過氧化氫酶陰性）過氧化氫酶及過氧化物酶實驗： 2H2O2 過氧化氫酶 2H2O+O2 過氧化物酶：RH2+H2O2 過氧化物酶 R+2

19、H2O 陽性：細菌變?yōu)楹诤稚?，有氣泡產(chǎn)生； 陰性： 不變色。陽性陰性62區(qū)分不發(fā)酵的革蘭陰性桿菌（氧化酶陽性）和腸道菌（氧化酶陰性）細胞色素氧化酶實驗： 細胞色素C 細胞色素氧化酶 氧化型細胞色素C +對苯二胺 + -奈酚 靛酚蘭（藍色） 陽性： 2分鐘內(nèi)生成藍色為陽性； 陰性：無變化。陽性陰性63凝固酶實驗：區(qū)分凝固酶陰性葡萄球菌（ 可推測為非致病性）和凝固酶陽性葡萄球菌(很可能為致病玻片法性） 。試管法64檸檬酸鹽實驗（枸櫞酸鹽實驗）： 一些微生物可以以銨鹽作為唯一的氮源，以檸檬酸鹽作為唯一的碳源，在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長，分解檸檬酸鹽生成碳酸鹽，使培養(yǎng)基變成堿性，酸堿指示劑變色。陰性陽性6

20、5甲基紅實驗（MR實驗） ： 一些細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可被進一步分解為甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培養(yǎng)基的pH值下降到4.5以下，加入甲基紅指示劑出現(xiàn)紅色反應。陰性陽性66V-P實驗： 一些細菌分解葡萄糖為丙酮酸，進一步脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中的氧氧化成二乙酰丁二酮，進而與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中所含的精氨酸的胍基發(fā)生反應生成紅色化合物。陰性陽性67表型微生物鑒定68表型微生物鑒定 在表型鑒定時應注意采用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間和傳代次數(shù)對鑒定結果的影響。目前已有的基于碳源利用和生化反應特征的鑒定方法，如氣相色譜法分析微生物的脂肪酸特征、MALD1-TOF質譜法分析

21、微生物蛋白等微生物鑒定系統(tǒng)，在進行結果判斷時需借助于系統(tǒng)自身的鑒別數(shù)據(jù)庫，還依賴特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法以確保鑒定結果的一致性。69生長在固體培養(yǎng)基上的菌落全細胞 MALDI-TOF譜圖數(shù)據(jù)庫中參考譜圖輸出可信鑒定結果找到匹配度最可信的譜圖70各菌種代表性峰型分布存在顯著差異，有助于鑒定各個菌種！71基因型微生物鑒定與表型特征不同，微生物基因型通常不受生長培養(yǎng)基或分離物活性的影響，只需分離到純菌落便可用于分析。由于大部分微生物物種中核酸序列是高度保守的，所以 DNA- DNA雜交、聚合酶鏈反應、16S rRNA序 列 和 18S rRNA 序列、多位點序列分型、焦磷酸測序、DNA探針和核糖體分型分析等基因型微生物鑒定方法理論上更值得信賴?；蛐偷蔫b定可通過DNA雜交、限制性酶切片段圖譜 的比較和/ 或D NA探針完成，若 DNA -DNA的雜交親緣關系大于70%時，表明微生物是同一種屬。72基因型微生物鑒定 rRNAs記錄了微生物的進化歷史，對這些序列進行分析可以對微生物進行系統(tǒng)分類和鑒定。7316S rRNA被普遍公認為是一把好的譜系分析的“分子尺”，可以作為測量各類生物進化的工具。rRNA在細胞中含量大(約占細胞中RNA的80%)，也易于提取。rRNA具有重要且恒定的生理功能。