分子生物學實驗：實驗一 實驗準備與試劑配置

1、分子生物學實驗2015年3月2課程介紹實驗課名稱：分子生物學實驗 36學時 2學分參考教材：分子生物學實驗指導魏群 主編，高等教育出版社參考資料：分子克隆 實驗指南【美】J.薩姆布魯克 E.F.弗里奇 T.曼尼阿蒂斯 著 科學出版社精編分子生物學實驗指南F.奧斯伯等 科學出版社成績評定：平時成績+操作考試成績 +筆試成績2015年3月32015年3月4實驗一 實驗準備與試劑配置2015年3月5具體的實驗準備工作清洗玻璃器皿等并烘干燒杯量筒試劑瓶錐形瓶10mL移液管玻璃涂棒培養(yǎng)皿玻璃棒容量瓶整理和打掃實驗室清洗烘干包扎、滅菌烘干備用潔凈保存2015年3月6具體的實驗準備工作包扎需要滅菌的器具和耗

2、材1.5mL小離心管、100mL離心管、吸頭、10mL移液管、玻璃涂棒、培養(yǎng)皿使用TOMY全自動滅菌鍋，121高溫濕熱滅菌20min1.5mL小離心管、100mL離心管、吸頭、10mL移液管、玻璃涂棒、培養(yǎng)皿取出滅菌完畢的物品置烘箱中烘干備用制作與錐形瓶配套使用的棉塞制備酒精棉球（75%酒精）2015年3月7TOMY全自動滅菌鍋的使用（1）檢查排放蒸汽的水壺，腔體內(nèi)的水位與托板齊平。（2）SET鍵設(shè)置溫度和時間（121，20min）（3）關(guān)閉排氣閥，Start機器開始運行，Check Heat檢查設(shè)置的溫度，Stop鍵終止機器運行。（4）程序運行結(jié)束，旋開排氣閥或機器自行排氣至壓力為0。溫度降

3、至80以下壓力為0時方可開蓋。運行過程中勿接觸蓋子。（5）腔體內(nèi)經(jīng)常清潔。2015年3月8LB液體/固體培養(yǎng)基的配制及質(zhì)粒提取試劑的配制2015年3月9實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗，掌握常用LB液體/固體培養(yǎng)基和質(zhì)粒提取試劑的配制方法和技術(shù)，為接下來的實驗作準備。2015年3月10實驗儀器電子天平臺式天平分析天平磁力攪拌器TOMY SS-325自動蒸汽消毒柜 pH酸度計 2015年3月11磁力攪拌器2015年3月12試劑配制LB液體培養(yǎng)基（1000mL）將胰蛋白胨（bacto-typtone）10g，酵母提取物（bacto-yeast extract）5g，氯化鈉10g完全溶解在950mL去離子水中，用

4、NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，加入去離子水至總體積為1000mL，121濕熱滅菌20min。冷卻后4保存?zhèn)溆?。滅菌前，分裝LB液體培養(yǎng)基50mL/瓶分裝8瓶，剩余的600mL制備固體LB培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基分裝成200mL/瓶分裝3瓶，每瓶加入3g瓊脂粉，沸水浴溶解，包扎滅菌。注意2015年3月13試劑配制固體LB培養(yǎng)基：每升LB培養(yǎng)基中加15g瓊脂。LB液體培養(yǎng)基200mL/瓶中加瓊脂3g，包扎滅菌。滅菌結(jié)束后，要趁熱將融化的固體LB培養(yǎng)基搖勻，冷卻后4保存?zhèn)溆?。注?015年3月14試劑配制溶液(pH8.0)(100mL）50mmol/L葡萄糖25mmol/L TrisHCl(pH8.0)1

5、0mmol/L EDTA(pH8.0)稱量溶解調(diào)節(jié)pH值定容滅菌溶液0.4mol/L NaOH (50mL)2%SDS (50mL)用前等體積混合。注意：兩種試劑分開配制。稱量溶解定容溶液 (100mL)5mol/L 乙酸鉀 60mL冰乙酸 11.5mL水 28.5mL2015年3月15試劑配制70%乙醇（200mL,100mL/瓶分裝）放置于20冰箱保存，用后即放回。0.5mol/L EDTA(pH8.0)（200mL）50TAE（500mL）121g Tris堿28.55mL 冰乙酸50mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)注意：0.5mol/L EDTA(pH8.0)已經(jīng)配好。2

6、015年3月16試劑瓶標簽示意圖試劑名稱試劑濃度配制日期個性標簽例：周二413晚上2015年3月17試劑配制分工LB液體/固體培養(yǎng)基溶液(100mL)溶液溶液(pH4.8) (100mL)70%乙醇0.5mol/L EDTA(pH8.0)（200mL）50TAE（500mL）2015年3月18高壓滅菌LB液體/固體培養(yǎng)基溶液溶液2015年3月19思考題為什么在實驗前要做詳細的準備工作?TOMY全自動滅菌鍋的正確使用步驟是什么?分子實驗準備中，為什么要對器具和耗材等進行清洗和高溫濕熱滅菌?如果不滅菌，可能會對實驗產(chǎn)生什么樣的影響?結(jié)合堿裂解法提取質(zhì)粒的原理，思考在配制溶液時，為什么要使用pH酸度計調(diào)節(jié)溶液的pH值？怎樣配制LB液體/固體培養(yǎng)基？2015年3月20板書實驗?zāi)康牧私夥肿由飳W實驗中使用的儀器、耗材、試劑等準備工學習質(zhì)粒DNA提取試劑的配制方法。實驗原理無菌概念酶（DNA酶、RNA酶）的影響質(zhì)粒DNA實驗步驟耗材：清洗烘干包扎滅菌烘干（備用）試劑：稱量溶解定容分裝滅菌調(diào)pH2015年3月21準備清單直徑9cm培養(yǎng)皿（50塊/班）100mL藍蓋螺口試劑瓶（