sdspage測定蛋白質(zhì)的相對分子量

1、SDS - PAGE測定蛋白質(zhì)的相對分子量1一、實驗目的 了解SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理，并學會用這種方法測定蛋白質(zhì)的相對分子量。2二、實驗原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳之所以能將不同的大分子化合物分開，是由于這些大分子化合物所帶電荷的差異和分子大小不同之故，如果將電荷差異這一因素除去或減小到可以忽略不計的程度，這些化合物在凝膠上的遷移率則完全取決于相對分子質(zhì)量。 SDS是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate）的簡稱，它是一種陰離子去污劑，它能按一定比例與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成帶負電荷的復合物，其負電荷遠遠超過了蛋白質(zhì)原有的電荷，也就消除或降低了不同蛋白質(zhì)之間原有的電荷差別，

2、這樣就使電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，就可根據(jù)標準蛋白質(zhì)的相對分子量的對數(shù)對遷移率所作的標準曲線求得未知蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。本實驗用目前常用的垂直平板電泳，樣品的起點一致，便于比較。3三、實驗器材直流穩(wěn)壓電泳儀 垂直平板電泳槽（含玻璃板、夾條、梳齒、夾子等）移液器（1.0ml、200l、20l）微量注射器（20l）燒杯、培養(yǎng)皿、試管、滴管、直尺 脫色搖床4四、實驗試劑1. 凝膠貯備液：丙烯酰胺（Acr）29.2g和亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水溶 解后，定容至100ml，棕色試劑瓶4保存，30天內(nèi)使用。 2. 分離膠緩沖液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。 1

3、8.15 Tris（三羥甲基氨基甲烷），少許重蒸水溶解，用1M HCl調(diào)pH8.8，重蒸水定容至100ml，4保存。3. 濃縮膠緩沖液：0.5mol/LHCl，pH6.8。6gTris, 少許重蒸水溶解，用1M HCl調(diào)pH6.8，重蒸水定容至100ml，4保存。4. 10%SDS，室溫保存。5. 兩類樣品緩沖液： 2倍還原緩沖液（2reducing buffer） 0.5mol/L HCl，pH6.8 2.5 ml 甘油 2.0 ml 質(zhì)量濃度10%SDS 4.0ml 質(zhì)量濃度0.1%溴酚藍 0.5ml -巰基乙醇 1.0 ml 總體積10 ml 5四、實驗試劑6. 電極緩沖液，pH8.3。

4、 Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4保存。7. 低分子量標準蛋白質(zhì)（上海產(chǎn)）。 開封后溶于200l重蒸水，加200l 2倍樣品緩沖液（還原緩沖液），分裝20小管，-20保存。臨用前沸水浴35min，其相對分子量（Mr）如下： 兔磷酸化酶B 97 400 牛血清白蛋白 66 200 兔肌動蛋白 43 000 牛碳酸酐酶 31 000 胰蛋白酶抑制劑 20 100 雞蛋清溶菌酶 14 4008. 質(zhì)量濃度為10%過硫酸銨： （臨用前配制）9. 染色液： 0.25g考馬斯亮藍R250，加入40ml甲醇，10ml冰醋酸,蒸餾水定容至100ml，過濾。10.

5、 脫色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸與875 ml重蒸水混合。11. 待測蛋白樣品。 12. 1%瓊脂糖（最好用電極液配）13. TEMED 6五、實驗步驟1、洗凈晾干電泳槽、玻璃板、夾條、梳齒等。安裝后用1%瓊脂糖封玻璃板兩側(cè)及底部。2、分離膠的選擇和配置方法 1）按照待分離蛋白質(zhì)的大致分子量選用不同濃度的膠。 2）分離膠和濃縮膠的配制方法7五、實驗步驟3、分離膠的灌制 按照上表左邊操作。因加入TEMED后凝膠就開始聚合，故應立即混勻混合液，然后用滴管吸取分離膠，在電泳槽的兩玻璃之間灌注，避免氣泡。留出梳齒的齒高加1cm空間以便灌注濃縮膠。用滴管小心地在溶液上覆蓋一層重蒸水，將電泳槽垂直靜

6、置于室溫下約4060min，待分離膠聚合完全后，除去覆蓋的重蒸水。4、濃縮膠的灌制 （等分離膠聚合后配制） 按照上表右邊操作?；靹蚝蠊嘧⒃诜蛛x膠上。小心插入梳齒，避免混入氣泡，將電泳槽垂直靜置于室溫下至濃縮膠完全聚合（約40min）。5、樣品的制備 1）標準蛋白樣品的制備 （樣品約5-10g，最好離心取上清加樣） 取分裝好的20l低相對分子質(zhì)量標準蛋白質(zhì)，放入沸水浴中加熱35min，取出冷卻。 2）待測樣品的制備 （同標準蛋白質(zhì)樣品處理）6、 電泳 1）待濃縮膠完全聚合后，標記好加樣孔位置，將電泳槽注滿電極緩沖液，小心拔出梳齒，用電極緩沖液沖洗加樣孔數(shù)次。 2）用微量注射器按次序向加樣孔內(nèi)加樣。 3）接上電泳儀，上電極接電源負極，下極接正極。打開電源，調(diào)節(jié)電流至2030mA并保持電流強度恒定。待藍色的溴酚藍條帶遷移至距凝膠下端約1cm時，停止電泳。 8五、實驗步驟7、 染色與脫色 小心將膠取出，置于一大培養(yǎng)皿中。加染色液染色30min，傾出染色液，加入脫色液，數(shù)小時更換一次脫色液，直至背景清晰。8、相對分子量的計算 用直尺分別量出標準蛋白質(zhì)、待測蛋白質(zhì)區(qū)帶中心以及溴酚藍前沿距分離膠頂端的距離，按下式計算相對遷移率（R）： 相對遷移率 = 樣