臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)第九章細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法

1、臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)第九章細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法細(xì)菌感染是致病菌或條件致病菌入侵機(jī)體，并在機(jī)體中生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒素或其他代謝產(chǎn)物所引起的全身性感染，臨床上以寒戰(zhàn)、高熱、關(guān)節(jié)疼痛等為特征，部分患者還可以出現(xiàn)煩躁、四肢厥冷、發(fā)紺、呼吸加速、血壓下降、感染性休克等臨床癥狀。傳統(tǒng)上對(duì)于細(xì)菌感染的病原體檢測(cè)主要采用免疫學(xué)、微生物學(xué)和血液學(xué)等相關(guān)技術(shù)，但這些技術(shù)方法受靈敏度和特異性的限制，不易達(dá)到早期診斷。利用分子生物學(xué)技術(shù)檢驗(yàn)感染性病原體自身遺傳物質(zhì)（RNA或DNA），從而達(dá)到早期、快速、敏感、特異地檢測(cè)已經(jīng)成為臨床檢驗(yàn)的主流技術(shù)之一。第一節(jié) 細(xì)菌感染的分子生物學(xué)檢驗(yàn)策略分子生物學(xué)檢驗(yàn)是以核酸（DN

2、A或RNA）或蛋白質(zhì)分子為檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，通過檢查人體內(nèi)源基因或外源（病原體）基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體狀態(tài)或疾病作出特異性診斷的方法和過程。機(jī)體感染細(xì)菌后，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)直接測(cè)定這些細(xì)菌病原體基因，不僅可以對(duì)微生物感染作出明確診斷，同時(shí)也能診斷出帶菌者或潛在性感染，還可以對(duì)感染性病原體進(jìn)行分型和耐藥性監(jiān)測(cè)。一、細(xì)菌感染的一般性檢出策略細(xì)菌感染性的分子生物學(xué)檢驗(yàn)的一般性檢出就是以感染病原體的特異核酸序列作為檢測(cè)目標(biāo)序列，利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行檢測(cè)，從而直接判斷有無細(xì)菌感染和是何種病原體感染。二、細(xì)菌感染的完整性檢出策略完整性檢出策略，即不僅對(duì)病原體作出快速準(zhǔn)確診斷，還需要對(duì)其進(jìn)

3、行分型（包括亞型）和耐藥性等方面的檢測(cè)，盡可能地為臨床診療提供更為詳盡的細(xì)菌病原體的相關(guān)信息。第二節(jié) 結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)結(jié)核分枝桿菌(TB)，簡(jiǎn)稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原體。隨著抗結(jié)核藥物的不斷發(fā)展和衛(wèi)生生活狀況的改善，結(jié)核的發(fā)病率和死亡率曾一度大幅下降。近年，由于艾滋病和結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)、免疫抑制劑的應(yīng)用、吸毒、貧困及人口廣泛流動(dòng)等因素，全球范圍內(nèi)結(jié)核病的疫情死灰復(fù)燃。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全世界約1/3的人感染了結(jié)核分枝桿菌，在某些發(fā)展中國(guó)家成年人中群中結(jié)核分枝桿菌攜帶率高達(dá)80%，其中的5%10%攜帶者可發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病。TB是一種革蘭氏陽性菌，G+C含量高，其細(xì)胞壁除

4、肽聚糖層外，還含有另外一層由特殊脂質(zhì)、糖脂和多糖組成的附加層。TB呈細(xì)長(zhǎng)略彎曲，常聚集成團(tuán)，用抗酸性染色被染成紅色。對(duì)養(yǎng)要培求特殊條件，一般要經(jīng)4-6周才出現(xiàn)肉眼可見的菌落。TB通過呼吸道、消化道和破損的皮膚粘膜侵入機(jī)體，它被吞噬后能在吞噬細(xì)胞內(nèi)繁殖，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞裂解，還可在細(xì)胞外繁殖。TB的培養(yǎng)特點(diǎn)：饞、懶、丑。饞-營(yíng)養(yǎng)要求較高，必須在含血清、卵黃、馬鈴薯、甘油以及含某些無機(jī)鹽類的特殊培養(yǎng)基（羅氏）上才能生長(zhǎng)良好。懶-生長(zhǎng)緩慢，1418h分裂1次，在固體培養(yǎng)基上25w才出現(xiàn)肉眼可見的菌落。丑-典型菌落為粗糙型，表面干燥呈顆粒狀，不透明，乳白色或淡黃色，如菜花樣。TB具有合成所有必需氨基酸、維

5、生素和酶輔助因子的潛在能力。該菌具有代謝各種各樣碳水化合物、乙醇、酮和羧酸的能力。此外，還具有許多涉及脂代謝、糖酵解、磷酸戊糖途徑、三羧酸和乙醛酸循環(huán)所必須的酶分子。 結(jié)核分枝桿菌天然地對(duì)很多抗生素有抵抗力，使得治療極其困難。該菌的藥物抵抗力主要由于其具有高度疏水的細(xì)胞壁充當(dāng)滲透屏障。同時(shí)，在基因組中還發(fā)現(xiàn)有許多藥物抗性決定因子的編碼序列，包括水解酶或者藥物修飾酶，例如乙酰轉(zhuǎn)移酶和很多藥物外排泵系統(tǒng)。抵抗力特點(diǎn)：“三耐四敏” 耐干燥、耐酸堿、耐孔雀綠（1：13000） 對(duì)濕熱、70乙醇、紫外線、常用抗結(jié)核藥物（但長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生耐藥性）變異性 典型形態(tài)多形性 R型菌落S型菌落 有毒無毒（用于制備

6、疫苗） 抗結(jié)核藥敏感耐藥目前結(jié)核桿菌常規(guī)檢測(cè)方法痰涂片法陽性率低，且易受非結(jié)核桿菌的污染。培養(yǎng)法目前認(rèn)為是診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”但結(jié)核桿菌生長(zhǎng)緩慢，不利于臨床上的及時(shí)診斷和治療。血清學(xué)試驗(yàn)由于分枝桿菌屬各菌之間抗原有著廣泛的交叉，特異性不強(qiáng)。TB H37Rv 全基因組為環(huán)狀雙鏈DNA，長(zhǎng)約4 411 529bp，共有4000基因， G+C平均值65.6%，其基因序列高度保守。H37Rv 基因組中有50 個(gè)編碼功能RNA 的基因，其中 45 個(gè) tRNA基因，3 個(gè) rRNA 基因和 2 個(gè)核穩(wěn)定（stable）RNA基因，這些 RNA分子是由特異的核糖體RNA 操縱子產(chǎn)生的。一、結(jié)核分枝桿菌的基因組

7、結(jié)構(gòu)特征在H37Rv 全基因組中有16個(gè)拷貝的IS6110插入序列和6個(gè)拷貝的IS1018，大多數(shù)插入序列位于基因間或非編碼區(qū)，通?？拷黷RNA基因聚集成串，插入序列在染色體中主要分布在重復(fù)區(qū)。TB H37Rv 基因組中共有3924個(gè)開放閱讀框，其中91%有潛在的編碼能力，ORF中最常見的起始密碼子61%為ATG，35%為GTG。187個(gè)ORF參與脂類代謝、細(xì)胞壁合成，360個(gè)參與細(xì)胞壁代謝， 66個(gè)參與脂類合成，287個(gè)參與能量代謝， 95個(gè)參與氨基酸合成， 38個(gè)與細(xì)菌毒力相關(guān)， 69個(gè)參與DNA合成。所編碼的蛋白約有40%的為功能性蛋白，44%的與已知蛋白有相似性信息，16%的則為未知蛋

8、白。TB不同菌株之間存在多個(gè)差異基因?；蚪M中有3個(gè)毒力因子：mce、過氧化氫酶-過氧化物酶和sigA。除了這些單基因毒力因子，細(xì)菌的胞壁也對(duì)致病性起著重要的作用。二、結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容（一）結(jié)核分枝桿菌核酸的檢測(cè)可采用PCR、real-time PCR、PCR-RFLP、線性探針雜交、鏈替代擴(kuò)增技術(shù)、擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌直接試驗(yàn)、基因芯片技術(shù)、全自動(dòng)結(jié)核檢測(cè)平臺(tái)等方法檢測(cè)標(biāo)本中的TB DNA。1、 PCR PCR擴(kuò)增所選靶序列主要有65kD抗原基因、MPB蛋白基因、rRNA基因、TB IS6110插入序列、染色體DNA的重復(fù)序列等。常規(guī)PCR的不足：產(chǎn)物的交叉污染、假陽性、假陰性、

9、實(shí)驗(yàn)室污染。2、real-time PCR 與傳統(tǒng)PCR相比，具有敏感度、特異性高及方便快速等優(yōu)點(diǎn)，特別是對(duì)難以培養(yǎng)與生長(zhǎng)緩慢的結(jié)核桿菌的檢測(cè)更有優(yōu)勢(shì)。3、PCR-RFLP 通過PCR擴(kuò)增分枝桿菌染色體上一段DNA，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化（最常用的內(nèi)切酶是Pvu)，將消化的樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，不同分枝桿菌酶切片段的數(shù)量或大小不同，電泳圖譜呈現(xiàn)多態(tài)性。4、線性探針雜交 其原理是應(yīng)用生物素標(biāo)記的特異引物進(jìn)行靶核酸的擴(kuò)增，將產(chǎn)物變性后與固定在尼龍膜上的特異寡核苷酸探針雜交，通過酶免疫顯色法顯示結(jié)果，一次雜交可以檢測(cè)多種靶序列。簡(jiǎn)便、快速、敏感。5、鏈替代擴(kuò)增技術(shù) （ SDA） SDA是

10、一種基于酶促反應(yīng)的新的DNA體外等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)?；驹恚阂锱c靶DNA序列上對(duì)應(yīng)的DNA單鏈雜交，在聚合酶作用下產(chǎn)生帶Hinc識(shí)別位點(diǎn)含5和3端的靶DNA序列，該靶序列進(jìn)入DSA循環(huán)；Hinc限制性核酸內(nèi)切酶切割識(shí)別位點(diǎn)，依賴DNA聚合酶在切割處延伸3端，并替代另一條DNA鏈；該替代鏈與引物雜交后又依次作為另一擴(kuò)增反應(yīng)的靶源，這些步驟在反應(yīng)體系中不斷重復(fù)，使靶DNA序列呈指數(shù)性增長(zhǎng)；37 40進(jìn)行23次循環(huán)后，2h內(nèi)靶序列可得到108擴(kuò)增放大。SDA法以IS6110和16SrRNA基因?yàn)閿U(kuò)增靶點(diǎn)。6、擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌直接試驗(yàn)（ AMTDT）AMTDT以結(jié)核分枝桿菌的16SrRNA為擴(kuò)增模板，采

11、用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增，采用化學(xué)發(fā)光物吖啶酯標(biāo)記的cDNA探針與擴(kuò)增的靶基因雜交，探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后利用雜交保護(hù)試驗(yàn)除去未雜交的標(biāo)記探針，最后利用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)。AMTDT方法具有高度的敏感性特異性。對(duì)涂片陽性TB診斷的敏感性達(dá)到92%100%，對(duì)所有臨床標(biāo)本檢測(cè)的特異性均在95%以上，因此具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值。7、基因芯片技術(shù)、1999年 Troesch 等開發(fā)出首塊結(jié)核病相關(guān)芯片，包括兩部分，一部分是在結(jié)核分枝桿菌有種間的多態(tài)性的16SrRNA 基因片段，借以鑒別結(jié)核桿菌與非結(jié)核桿菌；另一部分則用于分析耐利福平菌株rpoB基因突變的發(fā)生情況，可用于結(jié)核分枝桿菌

12、對(duì)利福平耐藥性的快速檢測(cè)。8、GeneXpert全自動(dòng)結(jié)核檢測(cè)平臺(tái)將樣品前處理、核酸提取、PCR檢測(cè)和結(jié)果分析等全過程結(jié)合在一起，最大程度上提高檢測(cè)自動(dòng)化和靈敏度。XpertMTB/RIF，通過六重?zé)晒舛縋CR對(duì)結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥性進(jìn)行快速檢測(cè)。（二）結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥的分子機(jī)制是由于結(jié)核桿菌的特定基因某些堿基出現(xiàn)突變（插入、缺失、替換）而造成。1、結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制（1）耐利福平分子機(jī)制：是由于其作用靶標(biāo)結(jié)核桿菌DNA依賴RNA聚合酶亞單位的編碼基因（rpoB）突變所致。當(dāng)rpoB中507533位密碼子的核心區(qū)域耐利福平?jīng)Q定區(qū)(RRDR)發(fā)生突變時(shí)，使DNA

13、依賴RNA聚合酶亞單位酶結(jié)構(gòu)改變利福平不能與細(xì)菌的RNA聚合酶亞單位結(jié)合而表現(xiàn)為耐藥。其中以編碼531位氨基酸的堿基TCGTTG和編碼526位氨基酸的堿基CACTAC的突變最常見。（2）耐異煙肼分子機(jī)制：結(jié)核桿菌耐異煙肼與過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因(katG)、烯酰基還原酶編碼基因(inhA)、烷基過氧化氫酶還原酶編碼基因(ahpC)、2S酮酰基?；\(yùn)載蛋白合成酶編碼基因(kasA)有關(guān)。主要是katG基因的點(diǎn)突變、缺失、插入，完全缺失占異煙肼耐藥菌株的7%24%，主要出現(xiàn)于高水平耐異煙肼分離株中，隨機(jī)突變占50%70%，常見的點(diǎn)突變是315位AGCACC和463位CGGCTG。inhA基

14、因突變約占異煙肼臨床耐藥株的10%35%。耐藥的發(fā)生可由于inhA結(jié)構(gòu)基因突變?cè)斐僧悷熾屡cDADH的親和力下降，或是inhA啟動(dòng)子-15的CT的點(diǎn)突變可能創(chuàng)造一個(gè)強(qiáng)有力的啟動(dòng)，使inhA蛋白過度表達(dá)從而提高對(duì)異煙肼活性形式所需的濃度，引起對(duì)異煙肼耐藥， inhA基因的突變常出現(xiàn)低水平異煙肼耐藥性。（3）耐氨基糖苷類藥物分子機(jī)制：耐鏈霉菌的結(jié)核桿菌主要由于編碼核算糖體16S rRNA的rrs基因與編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因發(fā)生突變，從而降低了氨基糖苷類藥物結(jié)合到核糖體上的能力，形成耐藥。 rpsL基因中編碼第43位氨基酸的堿基AG的突變是常見的突變位點(diǎn)出。Rrs基因突變點(diǎn)為512、513

15、位的堿基插入，這些堿基突變均可導(dǎo)致高水平的耐藥。（4）耐吡嗪酰胺分子機(jī)制：吡嗪酰胺需經(jīng)結(jié)核分枝桿菌體內(nèi)的吡嗪酰胺酶催化才能轉(zhuǎn)變成具有活性的吡嗪酸。耐吡嗪酰胺主要由 pncA 基因突變所造成的吡嗪酰酶的蛋白結(jié)構(gòu)改變，失去了將吡嗪酰胺轉(zhuǎn)換成活性形式的能力，形成耐藥。（5）耐乙胺丁醇分子機(jī)制：耐乙胺丁醇主要與操縱子cmbB基因有關(guān)， cmbB突變導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)，影響乙胺丁醇和糖基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)合而產(chǎn)生耐藥，其中第306位密碼子的錯(cuò)義突變最為常見。（6）耐氟喹諾酮類藥物分子機(jī)制：氟喹諾酮類藥物主要靶位是結(jié)核桿菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶，該酶由gyrA和gyrB兩種基因編碼的兩個(gè)A亞單位和兩個(gè)亞單位組成。其中編碼

16、的gyrA基因發(fā)生突變則導(dǎo)致氟喹諾酮類藥物結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)象改變，從而產(chǎn)生耐藥性。突變大多數(shù)發(fā)生在gyrA基因保守區(qū)67106位密碼子區(qū)，常見有94位GACGCC或CAC或TAC，90位GCCGTG的突變。2、結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù)（1）DNA測(cè)序：該技術(shù)是檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，不僅可用于突變的篩選，而且能確定突變堿基的部位和分布。（2）PCR-SSCP（3）PCR-RFLP（4）PCR-ROB（5）基因芯片技術(shù)三、分子生物學(xué)檢驗(yàn)的臨床意義傳統(tǒng)的結(jié)核病的臨床診斷主要是根據(jù)病史、細(xì)菌培養(yǎng)、涂片抗酸染色找TB、免疫學(xué)方法檢測(cè)TB抗原或抗體、胸片等可對(duì)大多數(shù)患者做出正確的臨床診斷，但對(duì)部分

17、病人可造成誤診或漏診。分子生物學(xué)方法為TB的臨床診斷提供了一種快速、準(zhǔn)確的診斷方法，具有以下特點(diǎn)：1、在TB感染早期，特別是在 TB 病灶通過血源性外傳播時(shí)及在外周血中存在極少量的TB 時(shí)，分子生物學(xué)方法能通過體外擴(kuò)增進(jìn)行確診。而早期診斷在臨床診療中具有重要的指導(dǎo)意義，可以防止繼發(fā)性TB病灶的形成。 2、PCR檢測(cè)TB僅需24小時(shí)，克服了傳統(tǒng)TB培養(yǎng)方法需時(shí)間長(zhǎng)、痰涂片檢查陽性率低的缺點(diǎn)，提高了臨床檢測(cè)的敏感性和特異性。3、可以通過分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行結(jié)核耐藥的早期快速檢測(cè)，為臨床診療提供快速、準(zhǔn)確的結(jié)核耐藥信息，有效指導(dǎo)臨床抗結(jié)核用藥。4、有利于疾病的鑒別診斷，對(duì)于肺結(jié)核來說，其中的結(jié)核球和成

18、人原發(fā)型結(jié)核等經(jīng)常易于同肺癌的診斷相混淆。病灶中心經(jīng)常出現(xiàn)既未見TB又末見癌細(xì)胞的壞死區(qū)。此時(shí)涂片檢測(cè)常是陰性，利用分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)就能夠進(jìn)行鑒別診斷。5、抗結(jié)核治療的評(píng)價(jià)，通過分子生物學(xué)技術(shù)可以通過定期檢測(cè)，評(píng)價(jià)抗結(jié)核藥物的療效及殘存菌的數(shù)量和活性度。第三節(jié) 淋病奈瑟菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)淋球菌又名淋病奈瑟菌（NG），是淋病的病原菌。淋球菌革蘭染色陰性，是嚴(yán)格的人體寄生菌，常存在于急性尿道炎和陰道炎的膿性分泌物的白細(xì)胞中，形態(tài)染色類似于腦膜炎球菌。人類是淋球菌唯一的自然宿主，淋病主要由性接觸而傳播。淋球菌侵入泌尿生殖系統(tǒng)繁殖，男性發(fā)生尿道炎，女性引起尿道炎和子宮炎。如果治療不徹底，可擴(kuò)散至生殖

19、系統(tǒng)。女性出現(xiàn)前庭大腺炎和盆腔炎等，是導(dǎo)致不育原因之一.胎兒可經(jīng)產(chǎn)道感染造成新生兒淋病性急性結(jié)膜炎。人類對(duì)淋球菌直接涂片染色鏡檢 采取尿道膿性分泌物涂片，革蘭氏染色鏡檢，如在中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性雙球菌時(shí)，就有診斷價(jià)值。該方法敏感度和特異性差，尤其是在女性患者中檢出率僅為50%左右，不能用于確認(rèn)； 分離培養(yǎng)法 是臨床診斷淋病奈瑟菌(NG)感染的金標(biāo)準(zhǔn), 但該方法對(duì)標(biāo)本和培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求高，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，出臨床報(bào)告慢，難以滿足臨床需要。免疫學(xué)方法 由于分泌物標(biāo)本中的非特異性反應(yīng)嚴(yán)重以及抗體方法間的穩(wěn)定性和條件限制，使推廣應(yīng)用受限。淋球菌感染的確認(rèn)主要依靠實(shí)驗(yàn)室檢查。目前，實(shí)驗(yàn)室診斷淋球菌感染的方法

20、有：一、淋病奈瑟菌的基因組結(jié)構(gòu)特征淋病奈瑟菌FA1090菌株的染色體DNA長(zhǎng)度為2.15Mbp，其中G+C含量為52.68%。編碼區(qū)的DNA長(zhǎng)度占總長(zhǎng)度的78%。包括2002個(gè)具有編碼功能的基因和67個(gè)編碼結(jié)構(gòu)性RNAS基因。NCCP11945菌株的染色體DNA長(zhǎng)度為，據(jù)估計(jì)可以編碼2622個(gè)開放性閱讀樞。同時(shí)， NCCP11945含有1 個(gè)能編碼12個(gè)ORFS的質(zhì)粒。整個(gè)基因組的編碼基因的密度為87%。全基因組平均G+C含量為52.4%，這與FA1090菌株相類似。二、淋病奈瑟菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)內(nèi)容（一）淋病奈瑟菌核酸的檢測(cè)1、PCR 是淋病奈瑟菌基因診斷中最基本的方法。PCR引物選擇的靶基

21、因多采用：隱蔽質(zhì)粒ccpB基因(ccpBHO1/3、1/2及ccpBN3/4); 16SrRNA基因(SL67/59、NGP1/2)；porA假基因；編碼外膜蛋白基因（omp基因）；opa基因；胞嘧啶DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因。2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)目前臨床檢測(cè)NG的主要的分子生物學(xué)技術(shù)。3、連接酶鏈反應(yīng)用于LCR方法檢測(cè)的NG靶基因主要有opa基因和Pilin基因。對(duì)咽拭子標(biāo)本具有很好的敏感性，但應(yīng)注意避免污染導(dǎo)致的假陽性抑制物所致的假陰性。4、鏈替代擴(kuò)增技術(shù)特異性擴(kuò)增NG染色體PivNg基因，然后用熒光標(biāo)記的探針檢測(cè)其相對(duì)應(yīng)的DNA靶序列。（二）淋病奈瑟菌的耐藥性檢測(cè)1、淋病奈瑟菌的主要耐藥

22、基因gyrA和parC基因：DNA 旋轉(zhuǎn)酶是氟喹諾酮類藥物作用的靶位，由 gyrA 和parC 基因編碼， gyrA基因突變可導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)的改變，阻止氟喹諾酮類藥物進(jìn)入靶位，引起耐藥。gyrA基因突變與淋球菌低水平和中度水平氟喹諾酮類藥物耐藥有關(guān)，而對(duì)氟喹諾酮類藥物高水平耐藥是gyrA和parC共同參與基因突變的結(jié)果， gyrA和parC 是氟喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）中的兩個(gè)重要基因。(2)penA、ponA基因：青霉素結(jié)合蛋白(PBPS)為淋球菌重要的外膜蛋白。編碼PBPS的基因主要有PenA、PonA基因，如果上述基因中發(fā)生突變，就會(huì)導(dǎo)致PBPS結(jié)構(gòu)的改變，使PBPS與青霉素的親和力下降

23、，細(xì)胞膜對(duì)青霉素的滲透性降低，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。(3)porB基因：孔蛋白是鑲嵌在淋球菌外膜的主要蛋白，與細(xì)菌的侵襲力有關(guān)，此外還具有物質(zhì)運(yùn)輸功能。主要由porB基因編碼，如果發(fā)生基因突變，導(dǎo)致孔蛋白120與121位氨基酸的改變，最終導(dǎo)致孔蛋白對(duì)親水性抗生素滲透性下降，使藥物在細(xì)胞內(nèi)蓄積不足，從而產(chǎn)生耐藥性。(4)Mtr系統(tǒng)調(diào)控基因：MtrR調(diào)控基因的突變，導(dǎo)致它編碼的MtrR阻遏蛋白減少或消失， Mtr操縱子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，使 MtrCDE 基因的表達(dá)增加，編碼的泵蛋白外排活性增加，加大脂溶性抗生素的排出，使菌體內(nèi)藥物蓄積不足，從而導(dǎo)致耐藥。(5)erm基因： erm基因編碼erm酶，如果發(fā)生突變

24、， erm基因編碼的酶可以使rRNA自動(dòng)甲基化，從而使大環(huán)內(nèi)酯類藥物作用靶位核糖體50S亞基蛋白改變，使藥物與靶位親和力下降引起耐藥2、淋病奈瑟菌耐藥檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù)（1）DNA測(cè)序：目前應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的淋病奈瑟菌耐藥基因主要有g(shù)yrA基因、parC基因、erm基因等。（2）PCR-SSCP（3）PCR-RFLP（4）基因芯片技術(shù)三、分子生物學(xué)檢驗(yàn)的臨床意義1、克服了淋球菌培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，提高了臨床標(biāo)本檢測(cè)的陽性率和準(zhǔn)確性。2、通過分子生物學(xué)技術(shù)可以進(jìn)行淋球菌感染的流行病調(diào)查。3、可以準(zhǔn)確、快速評(píng)價(jià)藥物治療的效果。4、有利于淋病的鑒別診斷。第四節(jié)O157型大腸埃希菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)感

25、染性腹瀉是世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題，其主要菌型是腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7，其產(chǎn)生強(qiáng)有力的細(xì)胞毒素志賀菌樣毒素Stx1和（或）Stx2。其主要作用部位是右半結(jié)腸，在盲腸、闌尾和升結(jié)腸引起黏膜的充血、水腫和細(xì)胞變性壞死，甚至血性腹瀉，嚴(yán)重者可以導(dǎo)致死亡。E.coliO157:H7引起的出血性結(jié)腸炎是1982年在美國(guó)俄勒崗州和密執(zhí)安州，因食用漢堡包引起的食物中毒的病人糞便中被分離并命名的。據(jù)美國(guó)疾病控制中心(CDC)報(bào)告，每年全國(guó)約發(fā)現(xiàn)2萬多例病人。死亡人數(shù)200-500人，以后陸續(xù)在全球五大州20多個(gè)國(guó)家被發(fā)現(xiàn)或引起暴發(fā)和流行。自82年發(fā)現(xiàn)至今，發(fā)生規(guī)模最大的一次爆發(fā)是97年5月下旬

26、，日本岡山、廣島等縣幾十所中學(xué)和幼兒園相繼發(fā)生6起集體食物中毒事件，人數(shù)多達(dá)1600人，導(dǎo)致3名兒童死亡，住院兒童達(dá)80人。同時(shí)日本仙臺(tái)和鹿兒島形成中毒人數(shù)過萬人，死亡11人，波及44個(gè)都府縣的爆發(fā)性食物中毒，引起全世界的關(guān)注。此外美國(guó)、加拿大、瑞典、澳大利亞、蘇格蘭、威爾士等國(guó)家和地區(qū)也相繼報(bào)道了EHEC的散發(fā)性感染和暴發(fā)流行。我國(guó)自1986年徐州首次分離O157:H7以來，福建、甘肅、浙江、江蘇和安徽等省市相繼從人和動(dòng)物中分離出O157:H7。1999年在江蘇淮北部分地區(qū)及鄰近的安徽部分地區(qū)發(fā)生的O157:H7感染暴發(fā)，患者超過2萬人，死亡177人，流行長(zhǎng)達(dá)7成個(gè)月，被認(rèn)為是迄今為止世界范

27、圍內(nèi)規(guī)模最大、死亡人數(shù)最多、時(shí)間最長(zhǎng)、發(fā)病原因最復(fù)雜的一次。一、O157型大腸埃希菌的基因組結(jié)構(gòu)特征大腸埃希菌的基因組由一個(gè)環(huán)狀染色體和大質(zhì)粒組成。O157:H7 EDL933株，有1387種大小不同的可能的至病基因，編碼可能的致病因子、選擇性新陳代謝能力和一些原噬菌體及新功能基因；有21個(gè)特異性序列，編碼溶血素、菌毛、侵襲性相關(guān)蛋白及鐵、脂肪和糖代謝相關(guān)的因子等；O157:H7 Sakai株與非致病的實(shí)驗(yàn)株E.coli K-12 MG1655株的全基因組序列進(jìn)行比較。 O157:H7 Sakai株染色體大小為55Mb，比K-12大895kb，兩者有約的高度保守序列。O157:H7 Sakai株染色體中包含5361開放閱讀框架，其中3729個(gè)ORF存在于K-12中，其余1632個(gè)ORF在K-12中不存在。1632個(gè)ORF中有873個(gè)ORF的功能是已知的，369個(gè)ORF與未知功能的蛋白質(zhì)相似，其余ORF則是