樣本dna純化保存方法

1、樣本DNA提取、純化、保存方法1一. DNA種類：真核生物DNA、細(xì)菌DNA、病毒DNA、質(zhì)粒DNA細(xì)胞懸液DNA、組織DNA2雙鏈環(huán)狀、雙鏈線性、單鏈環(huán)狀細(xì)胞核DNA、細(xì)胞器DNA3二. 提取DNA總的原則：41. 保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；2. 核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；5其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；4. 其他核酸分子，如RNA，也應(yīng)盡量去除。6三. DNA樣品準(zhǔn)備7 1. 生物組織：最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存70或液氮8液氮冷凍敲碎研磨組織勻漿法液氮勻漿法9102. 培養(yǎng)細(xì)胞懸浮生長細(xì)胞：1500g離心，4

2、10分鐘收集細(xì)胞單層培養(yǎng)細(xì)胞：可用刮棒或胰酶消化后離心收集11 3、血液樣品12血液抗凝易用檸檬酸抗凝液（ACD）： 檸檬酸 0.48g 檸檬酸鈉 1.32g 右旋葡萄糖 1.47g 加H2O 至 100ml 每6ml新鮮血液加1ml ACD液，0保存數(shù)天，-70長期貯存。13 四. DNA提取14 1. 酚抽提法：先用蛋白酶K、SDS破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯仿抽提，最后乙醇沉淀。獲DNA大小為100150kb15 2. 甲酰胺解聚法：破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA?？傻肈NA 200kb左右。16 3. 玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細(xì)胞，

3、將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DAN沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。17 4. 異丙醇沉淀法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態(tài)）。18 5. 表面活性劑快速制備法：用Triton X-100或NP40表面活性劑破碎細(xì)胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。19 6. 加熱法快速制備：加熱法快速制備：加熱96100，5分鐘，然后離心后取上清，可用于PCR反應(yīng)。20 7. 堿變性快速制備：先用NaOH作用20分鐘，再加HCl中和，離心后取上清，含少量DNA。21 五、DNA的濃縮221.固體聚乙二醇（PEG）濃縮：

4、用透析袋外敷PEG至合適量。232. 丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會。因此重復(fù)幾次可顯著減少DNA體積。24 3. 乙醇或異丙醇沉淀：25（1）需要陽離子鹽的存在 NaAc最常用， NaCl對含SDS樣品好， NH4Ac去除dNTP好， LiCl沉淀RNA好，但不能用于反轉(zhuǎn)錄前。26（2）沉淀溫度與時間 0，1015分鐘。27（3）離心 04，12000g，10分鐘，小于100bp DNA需超速離心284、精胺沉淀法 與DNA結(jié)合后使DNA結(jié)構(gòu)凝縮沉淀，需在無鹽或低鹽溶液。29六. DNA的鑒定301. 分光光度法在260nm和280nm處測定DNA溶液的光吸

5、收，A260與A280之比應(yīng)在1.751.80。低于此值表明制備物中留有蛋白質(zhì)成份或酚。高于此值表明有RNA的殘留量。31 2. 凝膠電泳分析323334(1). 影響瓊脂糖凝膠DNA 遷移率的因素A、DNA的分子大小 分子越大遷移速度越慢35B、瓊脂糖濃度 遷移率與濃度成反比瓊脂糖含量（W/V） 線性DNA分離范圍（Kb）0.3 5 - 600.6 1 - 200.7 0.8 - 100.9 0.5 - 71.2 0.4 - 61.5 0.2 - 3 2.0 0.1 236C、DNA構(gòu)象 相同分子量的超螺旋環(huán)狀（型），切口環(huán)狀（型）和線狀（型）DNA，以不同速率通過凝膠，一般情況下，遷移率型

6、型型3738D、電壓 遷移率與所加電壓成正比，但過大有效分離范圍變小。2Kb DNA, 電壓5V/cm。39E、電場方向 單一方向速率均等，改變方向，極大分子DNA遷移更慢。通過脈沖電場凝膠電泳分離極大DNA。40（2）. DNA的檢測41A、用溴乙錠染色在254nm紫外光下檢測，如需回收最好在300nm紫外光下割膠，否則易脫嘌呤而斷鏈，在1cm寬帶上可檢到10ng DNA。42B、用銀染法Ag+與DNA形成復(fù)合物，在甲醛還原下可染成黑褐色，靈敏度高200倍，但不能回收。43（3）. 分 析通常與已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段一起電泳，經(jīng)比較可獲知DNA標(biāo)本大小。如條帶拖尾，系加入DNA量太多或凝

7、膠未制好。如分子量小或一片糊狀，表示DNA有降解。44為了判斷目的DNA片段的大小，常在同一凝膠的目的DNA旁加一分子量參照物，同時電泳并染色后，就能在紫外燈下很快知道目的片段的大小。最常用的分子量參照物是 Hind 消化物，各片段的大小以bp表示，分別為：23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125。4546（4）. DNA回收47A、電泳到DEAE-纖維素膜 在所需條帶前插入DEAT-纖維素膜，繼續(xù)電泳至條帶DNA都到膜上，取出洗下。48B、透析袋電洗脫 切下條帶的瓊脂糖凝膠，放 透析袋內(nèi)，加緩沖液后繼續(xù)電泳，DNA出膠后回收。49C、低熔點瓊脂糖凝膠 切下膠，加熱到65熔化膠，然后用酚抽提回收DNA。50七. DNA的定量511. 分光光度法：測定DNA在A260nm的光吸收，計算濃度A260稀釋倍數(shù)50 g/ml (雙鏈DNA)52A260稀釋倍數(shù)40 g/ml (單鏈DNA)A260稀釋倍數(shù)20 g/ml (單鏈寡核苷酸DNA)532.瓊脂糖平板法：在含溴乙錠瓊脂糖平板上滴15l樣品DNA和已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品，放置數(shù)小時后比較檢測。543