第20章(濁度)自動(dòng)化儀器分析ppt課件

1、第二十章免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化儀器分析.1了解免疫檢測(cè)自動(dòng)化的根本概念2了解免疫檢測(cè)自動(dòng)化設(shè)計(jì)的根本原理3了解免疫檢測(cè)自動(dòng)化儀器在臨床上的運(yùn)用4掌握常用的幾種免疫檢測(cè)自動(dòng)化儀器的檢測(cè)原理、運(yùn)用以及評(píng)價(jià)，本章重點(diǎn). 免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化 (automation of immunoassays) 是將免疫學(xué)反響檢測(cè)過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分別、信號(hào)檢測(cè)、數(shù)據(jù)處置、打印報(bào)告和檢測(cè)后的儀器清洗等步驟由計(jì)算機(jī)控制，自動(dòng)化進(jìn)展。.第一節(jié) 自動(dòng)化免疫濁度分析系統(tǒng).免疫濁度分析屬液相沉淀實(shí)驗(yàn)，其根本原理是：抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反響，構(gòu)成小分子免疫復(fù)合物19S，使反響液出現(xiàn)濁度。在抗體略微過量且固

2、定的情況下，構(gòu)成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的添加而添加，反響液的濁度亦隨之增大，即待測(cè)抗原量與反響溶液的濁度呈正相關(guān)。 .一、免疫透射比濁法【原理】一定波長(zhǎng)的入射光線經(jīng)過抗原抗體反響后的溶液時(shí)，被其中的免疫復(fù)合物微粒吸收、反射和折射而減弱(圖9-7)，在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而構(gòu)成的免疫復(fù)合物量與參與反響的抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。與知濃度的抗原規(guī)范品比較，可確定標(biāo)本中抗原含量。. 二、免疫膠乳比濁法 原理用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒普通為0.2 m，在遇到相應(yīng)抗原時(shí)，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚 ，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。如下圖：a為單

3、個(gè)膠乳顆粒不妨礙光線透過，b為抗原抗體結(jié)合構(gòu)成的凝聚膠乳大顆粒使透射光減弱或散射光加強(qiáng)。 .三、免疫散射比濁法 【原理】 粒子對(duì)光線的散射作用是溶液中的微粒子遭到光線照射后，微粒子對(duì)光線產(chǎn)生反射和折射而構(gòu)成散射光。懸浮微粒對(duì)光散射構(gòu)成的散射光強(qiáng)度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度、丈量角度等要素親密相關(guān)，其公式如下：. 式中I為與入射光成角處散射光強(qiáng)度；和I0為入射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度；dn/dc為校正因子，反映了溶液折射指數(shù)和顆粒濃度的變化；M為顆粒分子量；c為濃度；N為阿佛加德指數(shù)；為顆粒到檢測(cè)器的間隔；為散射光與入射光的夾角散射夾角。II042dn/dc) 2 Mc(1+cos) N24.

4、 顆粒直徑1/10 Rayleigh 散射1/10顆粒直徑 Debye 散射 顆粒直徑 Mile 散射. 定時(shí)散射比濁法fixed time nephelometry定時(shí)散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，參與待測(cè)抗原，此時(shí)反響立刻開場(chǎng)，在反響的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號(hào)動(dòng)搖較大，所獲取的信號(hào)計(jì)算出的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定的誤差。定時(shí)散射比濁法是避開抗原抗體反響的不穩(wěn)定階段，即散射光信號(hào)在開場(chǎng)反響7.5s2min內(nèi)的第一次讀數(shù)，專門在抗原抗體反響的最正確時(shí)段進(jìn)展讀數(shù)，將檢測(cè)誤差降到最低。 . 速率散射比濁法rate nephelometry速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反響的動(dòng)力學(xué)測(cè)定法。所謂速率

5、是指抗原抗體反響在單位時(shí)間內(nèi)構(gòu)成免疫復(fù)合物的速度不是免疫復(fù)合物累積的量，延續(xù)測(cè)定各單位時(shí)間內(nèi)復(fù)合物構(gòu)成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號(hào)聯(lián)絡(luò)在一同，構(gòu)成動(dòng)態(tài)的速率散射比濁法，每項(xiàng)檢測(cè)僅1min2min即可完成。 .表抗原抗體復(fù)合物構(gòu)成的速率累計(jì)時(shí)間s構(gòu)成IC總量速率累計(jì)時(shí)間s構(gòu)成IC總量速率 5 810 13 515 251220 603525 1509030 2308035 300 7040 360 6045 415 5550 450 4555 480 3060 500 20.抗原抗體反響速率的動(dòng)態(tài)變化.BN ProSpec全自動(dòng)特定蛋白分析儀.BNP防抗原過量的設(shè)計(jì)：優(yōu)化反響條件，令初始稀釋度分析

6、范圍更寬，保證抗原抗體反響呈最正確比例預(yù)反響程序：IgM，LamU，AlbU，2MUVLinIntegral計(jì)算程序.定時(shí)散射比濁法測(cè)定原理表示圖 .IMMAGE全自動(dòng)特定蛋白分析儀.一、特異性二、比例性三、可逆性一、抗體來源：兔，羊，- 二、親合力 三、濃度 四、電解質(zhì)，(增濁劑) 五、pH 六、溫度抗原抗體反響的特點(diǎn)抗原抗體反響的影響要素.抗體抗體的質(zhì)量 特異性強(qiáng)，效價(jià)高，親和力強(qiáng)，R型抗體的含量 抗體過量.抗體的特異性 抗體只針對(duì)相應(yīng)的抗原，非特異性的交叉反響會(huì)引起偽濁度。.抗體的效價(jià) 一個(gè)合格的比濁用抗體其效價(jià)必需在1：20抗體稀釋度以上，否那么易構(gòu)成偽濁度。.抗體的親和力 親和力強(qiáng)那

7、么抗體活性高，不僅可以加快抗原抗體反響速度，而且構(gòu)成的免疫復(fù)合物較結(jié)實(shí)，不易發(fā)生解離。.R型抗血清 以家兔為代表的小動(dòng)物血清，如豚鼠、大白鼠、家兔、家禽、羊等動(dòng)物的免疫血清。 這類抗血清親和力高，與抗原結(jié)合后不易再解離，抗體過剩時(shí)易構(gòu)成大而穩(wěn)定的復(fù)合物，抗原過剩時(shí)那么構(gòu)成可溶性復(fù)合物。.H型抗血清 以馬為代表的大動(dòng)物血清，如驢、騾、馬等動(dòng)物的免疫血清。 該血清親和力弱，抗原抗體結(jié)合后極易再解離，抗原過剩和抗體過剩皆易構(gòu)成可溶性復(fù)合物。.pH：6.58.5離子強(qiáng)度：在一定范圍內(nèi)，離子強(qiáng)度大，IC構(gòu)成快；離子強(qiáng)度過低或無電解質(zhì)存在，那么不易出現(xiàn)可見的沉淀反響。.3. 增濁劑的運(yùn)用為了提高抗原抗體復(fù)

8、合物的構(gòu)成速度，經(jīng)常要參與增濁劑，如分子量為60008000的3%4% 聚乙二醇PEG或吐溫-20tween-20，以消除蛋白質(zhì)分子周圍的電子云和水化層，促進(jìn)抗原抗體結(jié)合。但PEG濃度過高，分子量過大會(huì)引起血清中其他蛋白質(zhì)如IgM、2巨球蛋白、脂蛋白非特異性沉淀，構(gòu)成偽濁度。因此，運(yùn)用恰當(dāng)?shù)脑鰸釀m宜的濃度是準(zhǔn)確測(cè)定所必需的。 .4. 偽濁度非抗原抗體特異性結(jié)合構(gòu)成的濁度，稱為偽濁度，可導(dǎo)致抗原檢測(cè)結(jié)果假性升高。偽濁度構(gòu)成的緣由包括混濁標(biāo)本、高血脂標(biāo)本、反復(fù)凍融標(biāo)本；抗體效價(jià)低1:20、抗血清滅活處置、抗血清含有交叉反響性抗體等；增濁劑PEG濃度過高；抗血清細(xì)菌污染和蛻變；器材尤其是比色杯不

9、清潔、塵埃污染等；緩沖液的離子強(qiáng)度太高，pH和溫度不適宜等，都對(duì)濁度產(chǎn)生影響。 .5.規(guī)范曲線制備與質(zhì)量控制運(yùn)用儀器規(guī)定的規(guī)范品制備劑量-反響曲線，普通采用5點(diǎn)或6點(diǎn)定標(biāo)，然后選擇適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)方法進(jìn)展曲線擬合；每改換一批試劑，應(yīng)重新制備劑量-反響曲線。為保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠，選取適宜的質(zhì)控血清，每次開機(jī)進(jìn)展室內(nèi)質(zhì)量控制是極其必要的。 . 根據(jù)全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)的處置方式，人們通常將全自動(dòng)酶免分析儀分成二類，一類為分體機(jī)，一類為連體機(jī)。分體機(jī)是由“前處置系統(tǒng)即全自動(dòng)樣本處置任務(wù)站和“后處置系統(tǒng)即全自動(dòng)酶免分析儀兩個(gè)獨(dú)立的部分組成。連體機(jī)是由多個(gè)模塊組成，運(yùn)用一臺(tái)計(jì)算機(jī)、一套操作系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了從標(biāo)本稀釋、加樣到酶標(biāo)板孵育、洗滌、加試劑、再孵育、洗滌、讀數(shù)和結(jié)果打印全自動(dòng)進(jìn)展。 自動(dòng)化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng).全自動(dòng)酶免分析儀可對(duì)630塊板酶標(biāo)板同時(shí)進(jìn)展任務(wù)，具有一套完好的任務(wù)和分析系統(tǒng)，不同的儀器大小不同、配置不同，但性能根本一樣。 .1.條形碼識(shí)別系統(tǒng) 2.樣本架和加樣系統(tǒng) 3.試劑架 4.溫育系統(tǒng) 5.液路系統(tǒng) 6.洗板系統(tǒng) 7. 酶標(biāo)板讀數(shù)儀 8.自動(dòng)裝載傳送系統(tǒng) 9. 計(jì)算機(jī)管理和信息系統(tǒng) .儀器評(píng)價(jià)全自動(dòng)酶免分析儀中的連體機(jī)是將樣本處置任務(wù)站和全自動(dòng)酶免分析儀結(jié)合起來，任務(wù)速度