醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù) 蛋白質(zhì)ppt課件

1、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第一章 蛋白質(zhì)的分別與純化第一節(jié) 蛋白質(zhì)分別純化的普通原那么一、蛋白質(zhì)分別純化技術(shù)及其根據(jù)表11 主要的蛋白質(zhì)分別純化方法及根據(jù) 性質(zhì) 分別方法分子大小與外形 超濾、透析、密度梯度離心、凝膠過(guò)濾層析、凝膠電泳溶解度 沉淀法、相分配法、分配層析、結(jié)晶、溶劑抽提、逆流分配電荷分布 電泳技術(shù)、等電點(diǎn)沉淀、離子交換層析、聚焦層析、等電聚倍數(shù)電泳生物功能專注性 親和層析疏水性 疏水作用層析、反相高效液相層析第一章 蛋白質(zhì)的分別與純化二、 蛋白質(zhì)純化的普通設(shè)計(jì)原那么1、目的蛋白的分別和純化應(yīng)該盡能夠選擇來(lái)源方便、本錢(qián)低、易操作的組織或細(xì)胞作為原料；2、要建立一個(gè)特異、快速、可反復(fù)、經(jīng)

2、濟(jì)的目的蛋白活性檢測(cè)方法；3、蛋白質(zhì)分別純化工藝的設(shè)計(jì)應(yīng)該分級(jí)分別、先粗后細(xì)的原那么；4、純化條件要盡能夠溫暖。第一章 蛋白質(zhì)的分別與純化第二節(jié) 蛋白質(zhì)的層析(chromatography)分別一、層析技術(shù)的開(kāi)展簡(jiǎn)史及科學(xué)意義二、層析技術(shù)的根本原理固定相：在層析系統(tǒng)分別過(guò)程中靜止不動(dòng)的相。流動(dòng)相：在層析系統(tǒng)分別過(guò)程中在載體上延一定方向挪動(dòng)的相。塔板實(shí)際：K (溶質(zhì)在固定相中的濃度) Cs(溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度) Cm把色譜柱比作一個(gè)精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來(lái)描畫(huà)組分在兩相間的分配行為，同時(shí)引入實(shí)際塔板數(shù)作為衡量柱效率的目的，即色譜柱是由一系列延續(xù)的、相等的程度塔板組成。每一塊塔板的高度用

3、 H表示，稱為塔板高度，簡(jiǎn)稱板高。 塔板實(shí)際假設(shè)：1. 在柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速到達(dá)平 衡。這一小段柱長(zhǎng)稱為實(shí)際塔板高度H。2. 以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是延續(xù)進(jìn)展的，而是脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積Vm。3. 一切組分開(kāi)場(chǎng)時(shí)存在于第0號(hào)塔板上，而且試樣沿軸縱向分散可忽略。4. 分配系數(shù)在一切塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無(wú)關(guān)。 簡(jiǎn)單地以為：在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快到達(dá)分配平衡，然后隨著流動(dòng)相按一個(gè)一個(gè)塔板的方式向前挪動(dòng)。對(duì)于一根長(zhǎng)為L(zhǎng)的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為： n = L / H n稱為實(shí)際塔板數(shù)。與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨實(shí)際塔板數(shù)n的添加而

4、添加，隨板高H的增大而減小。洗脫法也稱沖洗法。任務(wù)時(shí)，首先將樣品加到色譜柱頭上，然后用吸附或溶解才干比試樣組分弱得多的氣體或液體作沖洗劑。由于各組分在固定相上的吸附或溶解才干不同，被沖洗劑帶出的先后次序也不同，從而使組分彼此分別。流出曲線以下圖。層析的展開(kāi)方式頂替法是將樣品加到色譜柱頭后，在惰性流動(dòng)相中參與對(duì)固定相的吸附或溶解才干比一切試樣組分強(qiáng)的物質(zhì)為頂替劑或直接用頂替劑作流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)色譜柱，將各組分按吸附或溶解才干的強(qiáng)弱順序，依次頂替出固定相。很明顯，吸附或溶解才干最弱的組分最先流出，最強(qiáng)的最后流出。頂替法的流出曲線如以下圖。迎頭法是將試樣混合物延續(xù)經(jīng)過(guò)色譜柱，吸附或溶解才干最弱的組分首先

5、一純物質(zhì)的形狀流出，其次那么以第一組分和吸附或溶解才干較弱的第二組分混合物，以此類推。流出曲線如以下圖。A+ BA層析流出曲線及相關(guān)術(shù)語(yǔ)色譜流出曲線和色譜峰 由檢測(cè)器輸出的電信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖，所得曲線稱為色譜流出曲線。曲線上突起部分就是色譜峰。 假設(shè)進(jìn)樣量很小，濃度很低，在吸附等溫線氣固吸附色譜或分配等溫線氣液分配色譜的線性范圍內(nèi)，那么色譜峰是對(duì)稱的?；€ 在實(shí)驗(yàn)操作條件下，色譜柱后沒(méi)有樣品組分流出時(shí)的流出曲線稱為基線，穩(wěn)定的基線應(yīng)該是一條程度直線。峰高 色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直間隔，以h表示。 色譜流出曲線色譜流出曲線和色譜峰基線a峰高h(yuǎn)信號(hào)進(jìn)樣空氣峰色譜峰ha 保管值 死時(shí)間t0 不被

6、固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱為死時(shí)間，它正比于色譜柱的空隙體積，如以下圖。信號(hào)進(jìn)樣t0 由于這種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動(dòng)速度將與流動(dòng)相流動(dòng)速度相近。測(cè)定流動(dòng)相平均線速時(shí)，可用柱長(zhǎng)L與t0的比值計(jì)算，即 = L/t0信號(hào)進(jìn)樣tr2. 保管時(shí)間tr 試樣從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)過(guò)的時(shí)間，稱為保管時(shí)間，如以下圖。3. 調(diào)整保管時(shí)間tr某組分的保管時(shí)間扣除死時(shí)間后，稱為該組分的調(diào)整保管時(shí)間，即 tr= tr t0 由于組分在色譜柱中的保管時(shí)間tr包含了組分隨流動(dòng)相經(jīng)過(guò)柱子所須的時(shí)間和組分在固定相中滯留所須的時(shí)間，所以tr實(shí)踐上是組分在固定相中保管

7、的總時(shí)間。保管時(shí)間是色譜法定性的根本根據(jù)，但同一組分的保管時(shí)間常遭到流動(dòng)相流速的影響，因此色譜任務(wù)者有時(shí)用保管體積來(lái)表示保管值。4. 死體積V0 指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和銜接頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總和。當(dāng)后兩相很小可忽略不計(jì)時(shí)，死體積可由死時(shí)間與色譜柱出口的載氣流速Fcocm3min-1計(jì)算。 V0 = t0Fco 式中 Fco為扣除飽和水蒸氣壓并經(jīng)溫度校正的流速。僅適用于氣相色譜，不適用于液相色譜。5. 保管體積Vr 指從進(jìn)樣開(kāi)場(chǎng)到被測(cè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)過(guò)的流動(dòng)相的體積。保管時(shí)間與保管體積關(guān)系： Vr= tr Fco6. 調(diào)整保管體積

8、Vr 某組分的保管體積扣除死體積后，稱為該組分的調(diào)整保管體積。 Vr = Vr V0 = tr Fco 7. 相對(duì)保管值r2,1 某組分2的調(diào)整保管值與組分1的調(diào)整保管值之比，稱為相對(duì)保管值。 r2,1= tr2 / tr1= Vr2 / Vr1 由于相對(duì)保管值只與柱溫及固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)，因此，它在色譜法中，特別是在氣相色譜法中，廣泛用作定性的根據(jù)。 在定性分析中，通常固定一個(gè)色譜峰作為規(guī)范s，然后再求其它峰i對(duì)這個(gè)峰的相對(duì)保管值，此時(shí)可用符號(hào)表示，即 = tr (i) / tr (s) 式中tr (i)為后出峰的調(diào)整保管時(shí)間，所以總是大于1的。相對(duì)保管

9、值往往可作為衡量固定相選擇性的目的，又稱選擇因子。 區(qū)域?qū)挾?色譜峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，用于衡量柱效率及反映色譜操作條件的動(dòng)力學(xué)要素。表示色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法。1. 規(guī)范偏向 即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。2. 半峰寬W1/2 即峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬。它與規(guī)范偏向的關(guān)系為 W1/2=2.3543. 峰底寬度W 即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上截距間的間隔。它與規(guī)范偏向的關(guān)系是 W = 4 從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：(i) 根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判別樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù)；(ii) 根據(jù)色譜峰的保管值，可以進(jìn)展定性分析；(iii) 根據(jù)色譜峰的面積或

10、峰高，可以進(jìn)展定量分析；(iv) 色譜峰的保管值及其區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分別效能的根據(jù)；(v) 色譜峰兩峰間的間隔，是評(píng)價(jià)固定相或流動(dòng)相選擇能否適宜的根據(jù)。三、離子交換層析離子交換層析(ion exchange chromatography)利用物質(zhì)的電荷與層析載體(離子交換劑)電荷之間的相互作用到達(dá)分別純化的目的的層析方法稱離子交換層析。離子交換劑：離子交換層析所用的固相基質(zhì)，由不溶于水的、具有網(wǎng)狀構(gòu)造的高分子聚合物組成。離子交換層析的操作1、樣品的預(yù)備：固體樣品必需溶于適當(dāng)離子強(qiáng)度和pH的緩沖液中。組織液或細(xì)胞裂解液用緩沖液稀釋后可直接上柱。鹽析樣品必需除鹽后才干進(jìn)展分別。2、離子交換劑

11、的處置：根據(jù)被分別樣品的性質(zhì)選擇適宜的離子交換劑，離子交換劑在運(yùn)用前須先進(jìn)展處置。3、層析柱的預(yù)備：離子交換層析柱普通選擇粗短柱為宜，使得樣品在分別的同時(shí)進(jìn)展?jié)饪s。離子交換劑的用量根據(jù)樣品量和交換劑的交換容量確定。4、樣品分別：上樣量的多少與目的蛋白的性質(zhì)、濃度及交換劑的親和力有關(guān)。在分別過(guò)程中，應(yīng)留意1樣品的濃度不宜過(guò)大2溶解蛋白質(zhì)樣品的緩沖液的離子強(qiáng)度要低于起始緩沖液3上樣速度不要過(guò)快4上樣緩沖液的pH應(yīng)適宜5、洗脫6、洗脫液的鑒定和回收7、離子交換劑的再生與儲(chǔ)存兔球蛋白的木瓜蛋白酶水解物在CM纖維素柱上的層析分別天花粉各成分用特種離子交換劑層析分別二、分子篩原理凝膠過(guò)濾的分配系數(shù) K=

12、(Ve-V0) (Vi)主要凝膠過(guò)濾介質(zhì)的牌號(hào)及骨架構(gòu)造葡聚糖凝膠(G)型號(hào)分離范圍(分子量)吸水量(克克干凝膠)膨脹體積(毫升克干凝膠)浸泡時(shí)間蛋白質(zhì)多糖202590100 10700700 1.02-33115150015001.52.5-3.531251000-5000100-50002.54-631501500-30000500-100005.09-1131753000-700001000-500007.512-152431004000-1500001000-1000001015-207251505000-4000001000-1500001520-307252005000-80000

13、01000-2000002030-40725親和層析：利用生物分子間特殊的親和關(guān)系進(jìn)展的分別方法。是蛋白質(zhì)分別純化的最有效的方法之一，有時(shí)甚至可以僅用一步純化即可到達(dá)純化目的。只需被分別蛋白、配基和載體之間能構(gòu)成以下的關(guān)系，即可進(jìn)展親和層析根本原理：親和層析法利用了生命景象中生物分子之間非常特異的相互作用而進(jìn)展分別純化的方法。生物體內(nèi)能發(fā)生特異的相互作用的成分有：酶與酶的底物酶與酶的抑制劑酶與酶的變構(gòu)效應(yīng)劑酶與酶的輔酶激素與細(xì)胞膜上的受體維生素與結(jié)合蛋白核酸抗原與抗體外源凝集素與紅細(xì)胞外表的抗原特異性強(qiáng)分辨率高回收率高層析柱的再生方便親和層析特點(diǎn)特別適用于微量生物活性物質(zhì)的分別電泳 是指帶電粒

14、子在電場(chǎng)中向與其本身帶相反電荷的電極挪動(dòng)的景象 正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子蛋白質(zhì)的電泳分別+-+-蛋白質(zhì)膠體顆粒的沉淀 帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)酸酸堿堿脫水脫水脫水不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒 沉淀帶正電荷的蛋白質(zhì) 疏水膠體帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) 疏水膠體堿酸親水膠體親水膠體親水膠體 帶電顆粒在電場(chǎng)中所遭到的電場(chǎng)力 F=EQ 根據(jù)Stoke定律，球形分子在液體中泳動(dòng)所遭到的阻力 F=6rv電泳原理： F=F即：EQ= 6rv 時(shí)，V=EQ6r 當(dāng)物質(zhì)在電場(chǎng)中挪動(dòng)時(shí)，遭到電場(chǎng)力和液體阻力兩方面的力的影響，當(dāng)電場(chǎng)力和阻力平衡時(shí)，帶電顆粒作勻速運(yùn)動(dòng)， 兩個(gè)帶電顆粒能否分開(kāi)，由兩個(gè)顆粒在電泳

15、過(guò)程中的遷移率所決議，即U=d lVt或d=UVtldU= =VEtVl=dlVt 或d1-d2=(U1-U2)Vtld=遷移率或泳動(dòng)度是指帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下泳動(dòng)的速度，可用以下公式計(jì)算： =/E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt 為遷移率cm2V-1min-1；為顆粒泳動(dòng)速度cms-1；E為電場(chǎng)強(qiáng)度Vcm-1；d為顆粒泳動(dòng)的間隔cm；l為濾紙有效長(zhǎng)度cm；V為實(shí)踐電壓V；t為通電時(shí)間s或min。經(jīng)過(guò)丈量d, l, V, t, 即可計(jì)算出被分別物質(zhì)的遷移率。 影響電泳的要素1、帶電粒子的性質(zhì)與電泳行為2、電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)帶電粒子遷移的影響：電場(chǎng)強(qiáng)度也稱電位梯度，是指單位長(zhǎng)度每一厘米支持物

16、體上的電位降，它對(duì)泳動(dòng)速度起著非常重要的作用。普通，電場(chǎng)強(qiáng)度越高，帶電顆粒挪動(dòng)速度越快。3、溶液的pH對(duì)帶電粒子遷移的影響：溶液的pH值決議了帶電顆粒解離的程度，也決議了物質(zhì)所帶凈電荷的多少。4、電滲對(duì)電泳的影響：電滲是在電場(chǎng)中液體對(duì)固體的相對(duì)挪動(dòng)。電 滲 作 用5、離子強(qiáng)度對(duì)電泳的影響：電泳液中的離子添加會(huì)使電泳遷移率降低，緣由是帶電的離子會(huì)吸引相反符號(hào)的離子聚集在其周圍，構(gòu)成一個(gè)與運(yùn)動(dòng)粒子符號(hào)相反的離子氛，它使該離子向相反的方向運(yùn)動(dòng)，從而降低了該粒子的遷移率。6、溫度對(duì)的電泳的影響：電泳過(guò)程中由于通電產(chǎn)生焦耳熱，熱對(duì)電泳有很大的影響。 溫度每升高1，遷移率約添加2.4%。為降低熱效應(yīng)對(duì)電泳

17、的影響，可控制電壓或電流，或在電泳系統(tǒng)中安裝冷卻散熱安裝 。 電 泳 的 分 類 和 特 點(diǎn)電泳的分類自在挪動(dòng)界面電泳區(qū)帶電泳穩(wěn)態(tài)電泳 自在挪動(dòng)界面電泳moving boundary electrophoresis，沒(méi)有支持物，在一個(gè)U形管中進(jìn)展電泳，目前已被區(qū)帶電泳所取代。 區(qū)帶電泳zone electrophoresis在一定的支持物上進(jìn)展的電泳，電泳結(jié)果構(gòu)成一條條的區(qū)帶而得名。 穩(wěn)態(tài)電泳steady state electrophoresis帶電顆粒電泳一定時(shí)間后到達(dá)穩(wěn)態(tài)而停頓挪動(dòng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE聚丙烯酰

18、胺凝膠是由單體丙烯酰胺Acr和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺Bis聚合而成 聚合過(guò)程需求有催化劑參與，有兩種聚合方式，化學(xué)聚合和光聚合。催化劑包括引發(fā)劑和加速劑兩部分組成?；瘜W(xué)聚合反響的引發(fā)劑常為過(guò)硫酸銨，過(guò)硫酸銨首先構(gòu)成自在基，經(jīng)過(guò)自在基傳送，使丙烯酰胺成為自在基，發(fā)動(dòng)聚合反響。加速劑 四甲基乙二胺tetramethylethylenediamine，TEMED可加快引發(fā)劑釋放自在基的速度；光學(xué)聚合反響的引發(fā)劑為核黃素。聚丙烯凝膠的特點(diǎn)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分別物不發(fā)生化學(xué)反響；對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定；幾乎無(wú)電滲作用，只需Acr純度高，操作條件一致，那么

19、樣品分別反復(fù)性極好。樣品不易分散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g。凝膠孔徑可經(jīng)過(guò)選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)理。分辯率高，尤其在不邊疆凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。凝膠孔徑及其有關(guān)性質(zhì)凝膠性能與總濃度及交聯(lián)度的關(guān)系 凝膠的孔徑、機(jī)械性能、彈性、透明度、黏度和聚合程度取決于凝膠總濃度和Acr與Bis之比。TAcr和Bis總濃度%= 100%a+bmc交聯(lián)劑百分比%= 100% ba+b a/b與凝膠的機(jī)械性能親密相關(guān)。當(dāng) a/b 100時(shí)，即使5%的凝膠也呈糊狀，易于斷裂。欲制備完全透明而又有彈性的凝膠，應(yīng)控制 a/b =30左右。T普通為5%10%。凝膠濃度與孔徑的關(guān)系 T與c 不

20、僅與凝膠的機(jī)械性能有關(guān)，還與凝膠的孔徑關(guān)系極為親密。普通講，T越大，孔徑越小。此外，孔徑還同Bis與Acr的比例有關(guān)， Bis占Acr總濃度5%時(shí)，孔徑最小。凝膠濃度與被分別物相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān)。聚丙烯酰胺凝膠電泳垂直平板電泳程度板電泳圓盤(pán)電泳延續(xù)電泳不延續(xù)電泳Disc電泳丙烯酰胺凝膠電泳的運(yùn)用 聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，可分為延續(xù)的和不延續(xù)的兩類 。 前者指整個(gè)電泳系統(tǒng)中所用緩沖液，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是一樣的；后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液、pH值和孔徑，不延續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過(guò)程中濃縮成層，從而提高分辨才干。 在不延續(xù)PAGE系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng),，即

21、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)。 、電荷效應(yīng)：各種蛋白質(zhì)按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場(chǎng)向一定電極，以一定速度泳動(dòng)。 、分子篩效應(yīng)：區(qū)別不同大小分子種類的才干是凝膠所具有的一種篩分大小的才干即分子篩效應(yīng)。這種效應(yīng)與凝膠過(guò)濾過(guò)程中的情況不同。 濃縮效應(yīng)9 蛋白質(zhì)的研討歷史與方法 SDSPAGE電泳是運(yùn)用聚丙烯凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的一種有效的方法。SDS是陰離子變性劑，使蛋白質(zhì)分子變性為直鏈狀，且其所帶陰離子將蛋白質(zhì)分子所帶電荷完全履蓋，具有類似的荷質(zhì)比，電泳過(guò)程完全與蛋白質(zhì)的分子量相關(guān)。電泳終了后的凝膠用考馬斯亮蘭或銀染后與知分子量的蛋白質(zhì)的規(guī)范蛋白比較得出。9 蛋白質(zhì)的研討歷史與方法 二維電泳是等電聚焦電泳與SDSPAGE電泳結(jié)合的雙向電泳。電泳過(guò)程用柱狀等電聚焦電泳后再行SDSPAGE電泳，等電聚焦電泳利用蛋白質(zhì)等