南方醫(yī)科大學(xué)分生實驗-綠色熒光蛋白EGFP的基因克隆

1、-. z.綠色熒光蛋白EGFP的基因克隆南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)院摘要本實驗旨在學(xué)習(xí)基因克隆并檢驗，綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞后很穩(wěn)定，對多數(shù)宿主的生理無影響，是常用的報道基因，便于實驗。本實驗通過將含有目的基因GFP的pEGFP-N1質(zhì)粒和pMD18-T載體進展酶切、電泳、回收、連接、轉(zhuǎn)入、篩選之后，把GFP基因成功導(dǎo)入到大腸桿菌DH5 (克隆菌)中，從而實現(xiàn)熒光蛋白基因的克隆和表達(dá)。關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白克隆表達(dá)實驗名稱綠色熒光蛋白的基因克隆實驗日期2015- 2015-實驗地點合作者指導(dǎo)教師評分教師簽名批改日期實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)使用限制性切酶進展DNA酶切的原理和方法。學(xué)習(xí)掌握瓊脂糖凝膠電泳的根本原理

2、和操作方法。掌握PCR技術(shù)原理和PCR儀的操作方法。學(xué)習(xí)PCR產(chǎn)物的TA克隆的根本原理和操作步驟。了解和掌握大腸桿菌的制備方法的根本原理和操作要點以及DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌的原理和方法。掌握雙酶切法鑒定重組DNA的根本原理和操作步驟，以及菌落PCR鑒定重組DNA的根本原理和方法。掌握IPTG誘導(dǎo)GFP基因表達(dá)的根本原理和操作步驟實驗原理pEGFP-N1質(zhì)粒T載體材料與方法：實驗材料：質(zhì)粒：pEGFP-N1T載體：pUCm-T菌種：DH5(克隆菌)PCR引物：FGGCATATGGTGAGCAAGGGCGARCGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56實驗試劑：即用型藍(lán)白T載體pMD18-

3、T vector cloning kit快速DNA連接試劑盒限制性切酶：EcoR IFermentasA*ygen質(zhì)粒提取試劑盒抗生素：氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)*-gal、IPTG等實驗儀器：超凈工作臺，恒溫?fù)u床，高壓滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱，臺式高速離心機，大容量冷凍離心機，PCR儀，紫外分光光度計，水平電泳槽，垂直電泳槽，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，制冰機、超低溫冰箱等方法別離目的基因限制酶切割目的基因與載體連接重組體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩選重組體、轉(zhuǎn)化子實驗具體流程獲取外源基因堿裂解法提取質(zhì)粒使用A*ygen質(zhì)粒提取試劑盒徹底棄上清棄上清菌液離心1300r pm,1min瞬時離心加350l

4、溶液S3加250l 溶液S2加250l 溶液S1漩渦震蕩顛倒數(shù)次懸浮沉淀取上清600l加到吸附柱中離心13000rpm,10min顛倒數(shù)次離心放置3-5min13000rpm,1min棄濾液，參加600l洗滌液W棄濾液，參加600l洗滌液W離心離心放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間加40l洗脫液13000rpm,1min 13000rpm,1minPCR擴增 / -20保存?zhèn)溆脳墳V液空柱離心離心13000rpm,2min13000rpm,1minPCR擴增目的基因GFP取0.2 ml PCR反響管一支，用微量加樣槍按下述順序分別參加各試劑(注意每換一種試劑換一個新吸頭)：H2O6l質(zhì)粒DN

5、ApEGFP-N12l引物GFP1 (10M)1l引物GFP2 (10M)1lPremi* Taq10l總體積20l加完試劑后，將PCR反響管放到PCR儀上。PCE參數(shù)設(shè)置： 94預(yù)變性5分鐘后開場以下循環(huán) 94 30 秒 56 30 秒 30 循環(huán) 72 1 分鐘 72 7 分鐘 4 保溫瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的質(zhì)粒凝膠準(zhǔn)備膠床準(zhǔn)備鋪膠靜置膠床置于電泳槽中加電泳緩沖液拔梳子上樣1lPCR產(chǎn)物，6l loading buffer混合點樣點marker電泳取出凝膠拍照構(gòu)建重組DNA使用即用型藍(lán)白T載體和快速DNA連接試劑盒。按下表參加試劑：為了檢驗轉(zhuǎn)化是否成功，設(shè)置對照組實驗實驗組對照組即用型

6、藍(lán)白T載體1 l1 lPCR擴增產(chǎn)物1 lControl Insert DNA1 l快速連接緩沖液(2*)5 l5 l超純水-ddH2O2.5 l2.5 lRapid T4 DNA ligase0.5 l0.5 l總體積10 l10 l添加完成后，冰箱16反響45分鐘重組DNA的轉(zhuǎn)化預(yù)先制備好感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化DNA，為了檢驗轉(zhuǎn)化是否成功，設(shè)置對照組實驗實驗組：10l PCR產(chǎn)物/藍(lán)白T載體連接產(chǎn)物+ 100l感受態(tài)細(xì)胞陽性對照組：10l Control Insert DNA/藍(lán)白T載體連接產(chǎn)物+100l感受態(tài)細(xì)胞陰性對照組：10l無菌雙蒸水 + 100l感受態(tài)細(xì)胞步驟：分別制作3組將10lDN

7、A和100l的感受態(tài)細(xì)胞參加試管中冰浴30min42水浴準(zhǔn)確90s迅速轉(zhuǎn)移至冰浴冷卻1-2min參加800lLB培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)45min檢測重組DNA：涂布平板篩選步驟：取適量體積的轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)抗生素Amp、*-gal、IPTG的LB固體平板上，用滅過菌的玻璃棒涂布均勻。室溫放置幾分鐘，倒置平皿37培養(yǎng)過夜。重組DNA的篩選培養(yǎng)的菌落在篩選培養(yǎng)基中，白色的菌落含有重組體pUC18，藍(lán)色菌落則沒有或只有載體pUC18。挑選白色單菌落擴大培養(yǎng)：用接種棒在白色單菌落上挑取菌落，接種于4mlLB/Amp+培養(yǎng)液中，37震蕩培養(yǎng)過夜。重組DNA的鑒定從擴大培養(yǎng)的菌液中提取重組質(zhì)粒D

8、NA，再進展限制性切酶酶切，經(jīng)行瓊脂糖凝膠水平電泳。進展對照實驗。劇烈震蕩菌體沉淀擴大培養(yǎng)的菌液步驟：12000rpm250l250l取600l上清于吸附柱管1min溶液S1裂解液S2顛倒混勻4-6次350l溫和的顛倒混勻6-8次12000rmp室溫靜置35min中和液S3直到出現(xiàn)白色絮狀沉淀10min棄濾液空柱棄濾液棄濾液 12000rmp600l洗滌液W600l洗滌液W30s12000rpm 30s12000rpm 30s收集洗脫液備用取吸附柱至另一新EP管 10000rpm50l室溫靜置 12000rpm2 min洗脫液1min1min干凈離心管2l10 Buffer R10LH2O6l

9、取5l加1lloading buffer混合取5l，加1lloading buffer混合混合后37水浴116h 2lEcoR I電泳五、結(jié)果與討論：最后插入質(zhì)粒中的DNA片段應(yīng)為740bp，重組質(zhì)粒大小應(yīng)為3038bp+740bp=3778bp實驗結(jié)果現(xiàn)象與討論堿裂法提取質(zhì)粒5000pEGFP-N1質(zhì)粒大小為4.7kb，電泳顯示光帶與marker5k相近，說明質(zhì)粒提取較成功。電泳顯示出兩條帶，可能原因：參加S2時顛倒力度過大造成DNA斷裂。參加S2變形時間過長。參加S3復(fù)性時間過長。提取的質(zhì)粒不夠純潔。PCR擴增目的基因7502000只出現(xiàn)兩條帶，其中有接近750bp的光帶，說明目的基因在PCR擴增中得到擴增。重組DNA的篩選12111111111實驗組培養(yǎng)基中：1是藍(lán)色菌落2是白色菌落陽性對照組培養(yǎng)基中只有白色菌落陰性對照組培養(yǎng)基中無菌落說明重組DNA較為成功。5000重組DNA的鑒定2000121是酶切DNA2是提取的質(zhì)粒DNA當(dāng)天實驗使用的marker為2000bp。5000兩個光帶均亮度微弱，且均大于2000bp，酶切DNA沒有出現(xiàn)740bp的光帶。111總結(jié)：在PCR擴增中，雖然有接近750bp的光帶，但亮度微弱，說明在實驗過程中，DNA破壞嚴(yán)重，所以到后面實驗中，重組成功的細(xì)菌，量不多，光帶亮度都微弱。而在實驗