生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)

1、第二章 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)第一節(jié) 生化制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ) 由人體組織來源的生化藥物具有療效好，幾乎無副作用的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。 但由于以人體組織提供的原料受到法律或倫理方面的嚴(yán)格限制，因此有許多的生化藥物已更多地采用生物工程技術(shù) 目前已生產(chǎn)應(yīng)用的制品主要有血液制品類、人胎盤制品類和人尿制品類。 動(dòng)物來源的生化藥物是天然生化藥物的主要品種，它具有原料來源豐富、價(jià)格低廉，便于綜合利用和批量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 但由于提供原料的動(dòng)物種族差異較大，所以對(duì)原料的品質(zhì)和制品的質(zhì)控要比一般藥物更為嚴(yán)格。 植物來源的生化藥物品種正逐年增加，如酶、蛋白質(zhì) 多糖和核酸等。 海洋生物來源的生化藥物是發(fā)展最

2、快的一大類生化藥物。海洋生物種類繁多，是豐富的藥物資源寶庫，具有很大發(fā)展?jié)摿?。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)一、生物材料與生化活性物質(zhì)（一）生化制藥的生物材料來源 供生產(chǎn)生化藥物的生物資源主要有動(dòng)物、植物、海洋生物和微生物的組織、器官、細(xì)胞與代謝產(chǎn)物。應(yīng)用動(dòng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物發(fā)酵技術(shù)也是獲得生化制藥原料的重要途徑。 基因工程技術(shù)與細(xì)胞工程技術(shù)和酶工程技術(shù)更是開發(fā)生化制藥資源的新途徑。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)1、動(dòng)物臟器 以動(dòng)物組織器官為原料可以綜合利用制備100多種生化藥品。動(dòng)物組織器官的主要來源是豬，其次是牛、羊、家禽和魚類等的臟器。 l）胰臟 胰臟是動(dòng)物體內(nèi)不可替代的實(shí)質(zhì)性腺體之一。它兼

3、有其他器官所沒有的內(nèi)分泌和外分泌兩種功能。 2）腦 腦組織富含脂質(zhì)。腦組織中脂類占13.5，蛋白質(zhì)占810，還有少量黏多糖 腦組織中的主要脂類物質(zhì)是腦磷脂、肌醇磷脂、神經(jīng)磷脂、腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂和膽固醇。還有神經(jīng)遞質(zhì)和多種神經(jīng)肽。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) （3）胃黏膜 胃是動(dòng)物的消化器官，主要分泌消化液、胃黏膜。 （4）肝臟 肝臟是機(jī)體內(nèi)最大的不可替代的實(shí)質(zhì)性腺體，是機(jī)體的“生化反應(yīng)器”。肝臟含有復(fù)雜的酶系，已知肝臟酶達(dá)數(shù)百種，有些是其他組織所沒有或者含量極少的。 如鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶僅存在于肝細(xì)胞的微粒體中。肝臟還含有不飽和脂肪酸、磷脂類和膽固醇。肝臟富有肝糖原及維生素A、D、E、B12

4、等。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（5）脾臟 脾臟是體內(nèi)最大的免疫器官，已用于生產(chǎn)的藥物有脾水解物，脾RNA和脾轉(zhuǎn)移因子。人脾混合淋巴因子制劑對(duì)原發(fā)性肝癌具有良好療效。（6）小腸 小腸是消化和吸收的主要場(chǎng)所，含有豐富的淋巴組織和多種內(nèi)分泌細(xì)胞。（7）腦垂體 腦垂體是重要的內(nèi)分泌腺體，由兩部分組成：腦垂體（前葉）包括遠(yuǎn)側(cè)部、結(jié)節(jié)及中間部；神經(jīng)垂體（后葉）包括神經(jīng)部及漏斗部。垂體激素品種不少于10種。（8）心臟 心臟含有豐富的糖原、激素和酶類。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 其他動(dòng)物臟器如肺、腎、胸腺、腎上腺、扁桃體、甲狀腺、睪丸、胎盤、羊精囊、氣管軟骨、眼球、雞冠等也都是重要的生物制藥原料。 2、血液、

5、分泌物和其他代謝物 血液約占體重的610，血液中水分占80，干物質(zhì)占20。血液資源豐富，可用于生產(chǎn)藥品、生化試劑、營(yíng)養(yǎng)食品、醫(yī)用化妝品及飼料添加劑等。 尿液、膽汁、蛇毒、蜂毒等也是重要的生物材料。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)3、海洋生物 海洋生物是開發(fā)防治常見病、多發(fā)病和疑難病藥物的重要生物材料。主要有：（1）海藻 海藻是海洋水生植物類，分綠藻門、褐藻門、藍(lán)藻門、紅藻門、甲藻門等10門，共10000多種。（2）腔腸動(dòng)物 腔腸動(dòng)物是原始多細(xì)胞動(dòng)物，有9000多種。（3）節(jié)肢動(dòng)物 節(jié)肢動(dòng)物門中的某些甲殼動(dòng)物可供藥用。甲殼動(dòng)物有25 000多種。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（4）軟體動(dòng)物 軟體動(dòng)物有80

6、 000種，包括螺、蚌類和烏賊等。（5）棘皮動(dòng)物 棘皮動(dòng)物有6000多種，包括海星、海膽、海參。（6）魚類 魚類有20000多種，可制造多種藥物。（7）爬行動(dòng)物 爬行動(dòng)物多數(shù)為陸生脊椎動(dòng)物。海生的主要有海蛇、海龜?shù)?。?）海洋哺乳動(dòng)物 用鯨魚和海豚類的臟器和腺體已制成多種藥物。 其他海洋生物還有環(huán)節(jié)、海綿、扁形、紐形、兩棲等也都是重要生物材料。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)4、植物 藥用植物品種繁多，除含有生物堿、強(qiáng)心苷、黃酮、皂苷、揮發(fā)油、樹脂、鞣質(zhì)等有效藥理成分外，還含有氨基酸，蛋白質(zhì)、酶、激素、糖類、脂類、維生素類等眾多生化成分。 由植物材料尋找有效生物藥物已逐漸引起重視，品種逐年增加，以及

7、各種蛋白酶抑制劑。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)5、微生物 微生物資源非常豐富，已研究的品種僅占自然界中微生物總數(shù)的10左右。微生物的代謝物有1300多種，已大量生產(chǎn)的才近百種。微生物酶有幾千種，已被應(yīng)用的才幾十種，可見其應(yīng)用前景很大。（1）細(xì)菌 常用細(xì)菌發(fā)酵法生產(chǎn)。主要發(fā)展領(lǐng)域有：氨基酸。有機(jī)酸。糖類。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)核苷酸類。維生素。用細(xì)菌可制取多種維生素如VB1、YB2、VB6、煙酸、生物素等。酶。（2）放線菌 放線菌是最重要的抗生素產(chǎn)生菌，己有的1000多種抗生素約23產(chǎn)自放線菌。其代謝產(chǎn)物也是重要的生物制藥資源。氨基酸。核苷酸類。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)維生素。利用放線菌可產(chǎn)

8、生維生素B12、B族維生素、胡蘿卜素、蕃茄素及食品染料。酶。放線菌能產(chǎn)生眾多品種的酶。（3）真菌酶有機(jī)酸。氨基酸。核酸及其有關(guān)物質(zhì)。維生素。促生素。多糖。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（4）酵母菌維生素。蛋白質(zhì)與多肽。核酸。6、開發(fā)生物新資源（1）動(dòng)植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng) 利用動(dòng)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)產(chǎn)生生物藥品是細(xì)胞工程技術(shù)的一大應(yīng)用領(lǐng)域。（2）應(yīng)用基因重組技術(shù)建立“工程菌”或“工程細(xì)胞”，使所需要的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，制造各種生物活性物質(zhì)，是生物制藥工業(yè)的重要發(fā)展領(lǐng)域。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（二）生物材料的準(zhǔn)備1、生物材料的選擇 生化藥物生產(chǎn)原料的選擇原則是：有效成分含量高，原料新鮮、無污染；

9、來源豐富、易得；原料產(chǎn)地較近，價(jià)格低廉；原料中雜質(zhì)含量少，便于分離純化等。（1）有效成分的含量 生物品種 根據(jù)目的物的分布，選擇富含有效成分的生物品種是選材的關(guān)鍵。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)合適的組織器官。 另外動(dòng)物的年齡、性別、營(yíng)養(yǎng)狀況、產(chǎn)地、季節(jié)對(duì)活性物質(zhì)的含量也有影響。植物原料要注意采集地點(diǎn)、季節(jié)，微生物原料要注意其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間與活性成分的關(guān)系。（2）雜質(zhì)情況 選材時(shí)，應(yīng)避免與目的物性質(zhì)相似的雜質(zhì)對(duì)純化過程的干擾。（3）來源 應(yīng)選用來源豐富的材料，盡量不與其他產(chǎn)品爭(zhēng)原料，最好能一物多用，綜合利用。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)2、生物材料的采集、預(yù)處理與保存 生物材料采集時(shí)必須保證環(huán)境衛(wèi)生

10、符合要求，并盡力保持原材料的新鮮，防止腐敗、變質(zhì)與微生物污染。 生物材料采摘選取后，必須快速及時(shí)速凍，低溫保存，防止生物活性成分的變性、失活，酶原提取要及時(shí)進(jìn)行，防止酶原激活轉(zhuǎn)變?yōu)槊浮?植物原料采集后可就地去除不用的部分，將有用部分保鮮處理。 收集微生物原料時(shí)，要及時(shí)將菌體細(xì)胞與培養(yǎng)液分開，根據(jù)有效成分存在部位及時(shí)進(jìn)行保鮮處理。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 生物材料的保存方法主要有： 冷凍法。本法適用于所有生物材料。一般先速凍后置于40處低溫保存。 有機(jī)溶劑脫水法，常用的有機(jī)溶劑是丙酮。 防腐劑保鮮法。常用乙醇、苯酚等。二、生化活性物質(zhì)的提?。ǎ┥钚晕镔|(zhì)常用的提取方法1、酸、堿、鹽水溶液提取

11、法 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)2、表面活性劑提取法與反膠束提取法 表面活性劑分子兼有親水與疏水基團(tuán)，分布于水油界面時(shí)有分散、乳化和增溶作用。 生物提取常用的表面活性劑，其HLB多在1020之間。 在適當(dāng)pH及低離子強(qiáng)度的條件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，使膜的滲透性改變或使之溶解。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 反膠束也稱為反膠團(tuán)。反膠束是表面活性劑分散于連續(xù)的有機(jī)相中自發(fā)形成的納米尺度的一種聚集體。反膠束系統(tǒng)作為液液萃取方法，更具選擇性。 此法的優(yōu)點(diǎn)是使熱敏感性的，親水蛋白質(zhì)在一種近似水相的環(huán)境中被提取出來，最大限度地保持了蛋白質(zhì)的生物活性，蛋白質(zhì)通過中間反膠束從一個(gè)主體相中轉(zhuǎn)移到另一個(gè)水相

12、中，并在瞬間完成。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)3、有機(jī)溶劑提取 用有機(jī)溶劑提取生化物質(zhì)可分為固液提取和液液提?。ㄝ腿。┒?。（1）固液提取 在生物制藥中常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等極性溶劑以及乙醚、三氯甲烷、苯等非極性溶劑。 極性溶劑既有親水基團(tuán)又有疏水基團(tuán)，從廣義上說，也是一種表面活性劑。甲醇、乙醇、丙酮能同水混溶，同時(shí)又有較強(qiáng)的親脂性，對(duì)某些蛋白質(zhì)、類脂起增溶作用， 乙醚、三氯甲烷、苯是脂質(zhì)化合物的良好溶劑。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 在選用有機(jī)溶劑時(shí)一般采用“相似相溶”的原則。 丁醇在水溶液中解離脂蛋白的能力更強(qiáng)。 在生化物質(zhì)提取前，有時(shí)還用丙酮處理原材料，制成“丙酮粉”，其作

13、用是使材料脫水，脫脂，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，增加了某些物質(zhì)的穩(wěn)定性，便于貯存和運(yùn)輸。 有機(jī)溶劑既能抑制微生物的生長(zhǎng)和某些酶的作用，也能阻止大量無關(guān)蛋白質(zhì)的溶出，有利于進(jìn)一步純化。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（2）液液萃取 液液萃取是利用溶質(zhì)在兩個(gè)互不混溶的溶劑中溶解度的差異將溶質(zhì)從一個(gè)溶劑相向另一個(gè)溶劑相轉(zhuǎn)移的操作。 影響液液萃取的因素主要有目的物在兩相的分配比（分配系數(shù)）和有機(jī)溶劑的用量等。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 溶劑萃取的注意事項(xiàng)：（1）pH 在萃取操作中正確選擇pH很重要。 所以，酸性物質(zhì)在酸性條件下萃取，堿性物質(zhì)在堿性條件下萃取，對(duì)氨基酸等兩性電解質(zhì)，則采用pH在等電點(diǎn)時(shí)進(jìn)行提取較好。（2

14、）鹽析 加入中性鹽如硫酸銨、氯化鈉等可以使一些生化物質(zhì)溶解度減少，這種現(xiàn)象稱作鹽析。 在提取液中加入中性鹽，可以促使生化物質(zhì)轉(zhuǎn)入有機(jī)相從而提高萃取率：鹽析作用也能減少有機(jī)溶劑在水中的溶解度，使提取液中的水分含量減少。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（3）溫度 一般在室溫或低溫下進(jìn)行萃取操作。（4）乳化 液液萃取時(shí)，常發(fā)生乳化作用。去乳化的常用方法有：過濾與離心；輕輕攪動(dòng)；改變兩相的比例；加熱；加電解質(zhì)；加吸附劑（如碳酸鈣）等。 液液萃取時(shí)溶劑的選擇要注意以下幾點(diǎn)：（1）選用的溶劑必須具有較高選擇性。（2）選用的溶劑，溶質(zhì)與溶劑要容易分離與回收。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（3）兩種溶劑的密度相差不大時(shí)

15、，易形成乳化，選溶劑時(shí)應(yīng)注意。（4）要選用無毒，不易燃燒的價(jià)廉易得的溶劑。 4、雙水相萃取法 雙水相系統(tǒng)是兩種親水性的聚合物都加在一個(gè)水溶液中，當(dāng)超過某一濃度時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生兩相，兩種聚合物分別溶于互不相溶的兩相中。 其操作是向水相中加入溶于水的高分子化合物，如聚乙二醇（PEG）或葡聚糖，可以形成密度不同的兩相（有時(shí)甚至是多相），因兩相都含有較多的水，所以稱為雙水相，常用的雙水相系統(tǒng)為PEG葡聚糖和PEG無機(jī)鹽兩種，后者應(yīng)用更廣泛。 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 一般認(rèn)為，成相是由于聚合物之間的不溶性，即聚合物分子的空間阻礙作用，無法相互滲透，不能形成均一相，從而具有相分離的傾向。 如用等量的11的

16、右旋糖酐溶液和0.36甲基纖維素溶液混合，靜止后，產(chǎn)生兩相，上相中含右旋糖酐0.39，含甲基纖維素0.65，而下相中含右旋糖酐1.58，含甲基纖維素0.15。 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)5、超臨界萃取技術(shù) 超臨界流體萃取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是節(jié)能，對(duì)生化活性物質(zhì)不產(chǎn)生熱變性作用，可使用生理惰性溶劑在低溫下分離活性組分。 當(dāng)在某一溫度和壓力時(shí)，氣體和液體的物理特性就會(huì)趨于相同。兩相變?yōu)橐幌?，此時(shí)稱為臨界點(diǎn)，物質(zhì)的臨界點(diǎn)常數(shù)包括：臨界溫度、臨界壓力和臨界密度。 如CO2的臨界點(diǎn)分別為31.1、7.3MPa和0.47gml，當(dāng)溫度和壓力高于臨界點(diǎn)值時(shí)，物質(zhì)處于液體和氣體的中間狀態(tài)，在超臨界狀態(tài)下的流體稱為超臨

17、界流體，超臨界流體最常用的萃取劑是CO2。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 超臨界流體的物理特性、傳質(zhì)特性通常介于液體和氣體之間，適于作為萃取溶劑。 超臨界流體具有與液體同樣的凝聚力、溶解力。密度與液體比較接近。 隨著溫度和壓力的連續(xù)變化，超臨界流體擴(kuò)散系數(shù)接近于氣體，是通常液體的近百倍，超臨界流體的黏度大大低于液體的黏度，接近氣體的黏度，有利于物質(zhì)的擴(kuò)散。 超臨界流體的溶解力與其密度有很大關(guān)系，而密度又受到體系溫度或壓力的影響，所以壓力或溫度的變化都會(huì)直接改變其溶解能力。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（二）提取效率 提取時(shí)，總希望提取率愈高愈好，但實(shí)際上這種“相轉(zhuǎn)移”的提取效率不可能達(dá)到100。 在生

18、物材料中總要?dú)埩舨糠帜康奈铮瑲埩袅康亩喙讶Q于所選擇的溶劑系統(tǒng)的種類、用量、提取次數(shù)以及操作條件。 在實(shí)際工作中，溶劑的用量有一定限量，所以一般用分次提取法予以彌補(bǔ)。 一般生產(chǎn)上多用23次提取。溶劑用量（L）為生物材料的25倍，少數(shù)情況也有用1020倍量溶劑作一次性提取。目的是節(jié)省提取時(shí)間，降低有害酶的作用。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 當(dāng)提取物由固相轉(zhuǎn)入液相或從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)到細(xì)胞外時(shí)，提取率還與物質(zhì)的擴(kuò)散作用有關(guān)。為了提高提取速度，常采取一些措施，如增加材料的破碎程度，進(jìn)行攪拌，延長(zhǎng)提取時(shí)間，提高提取溫度。（三）影響提取效率的因素1、溫度 多數(shù)物質(zhì)的溶解度隨提取溫度的升高而增加。另外較高的溫度可以

19、降低物料的黏度，有利于分子擴(kuò)散和機(jī)械攪拌。 應(yīng)用有機(jī)溶劑提取生化成分時(shí)，一般在較低的溫度下進(jìn)行提取，一方面是為了減少溶劑揮發(fā)損失和生產(chǎn)安全，另一方面也是為了減少活力損失。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)2、酸堿度 多數(shù)生化物質(zhì)在中性條件下較穩(wěn)定，所以提取用的溶劑系統(tǒng)原則上應(yīng)避免過酸或過堿，pH一般應(yīng)控制在49范圍內(nèi)。為了增加目的物的溶解度，往往要避免在目的物的等電點(diǎn)附近進(jìn)行提取。 巧妙地選擇溶劑系統(tǒng)的pH，不但直接影響目的物與雜質(zhì)的溶解度，還可以抑制有害酶類的水解破壞作用，防止降解，提高收得率。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)3、鹽濃度 鹽離子的存在能減弱生物分子間離子鍵及氫鍵的作用力。稀鹽溶液對(duì)蛋白質(zhì)等

20、生物大分子有助溶作用。 一些不溶于純水的球蛋白在稀鹽中能增加溶解度，這是由于鹽離子作用于生物大分子表面，增加了表面電荷，使之極性增加，水合作用增強(qiáng)，促使形成穩(wěn)定的雙電層，此現(xiàn)象稱“鹽溶”作用。 多種鹽溶液的鹽溶能力既與其濃度有關(guān)，也與其離子強(qiáng)度有關(guān)，一般高價(jià)酸鹽的鹽溶作用比單價(jià)酸鹽的鹽溶作用強(qiáng)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)常用的稀鹽提取液有：氯化鈉溶液（0.10.15molL）；磷酸鹽緩沖液（0.020.05molL）；焦磷酸鈉緩沖液（0.020.05molL）： 醋酸鹽緩沖液（0.100.15molL）： 檸檬酸緩沖液 （0.020.05molL）。 其中焦磷酸鹽的緩沖范圍較大，對(duì)氫鍵和離子鍵

21、有較強(qiáng)的解離作用，還能結(jié)合二價(jià)離子，對(duì)某些生化物質(zhì)有保護(hù)作用。 檸檬酸緩沖液常在酸性條件下使用，作用近似焦磷酸鹽。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（四）提取方法的選擇 生物材料及其目的物與提取有關(guān)的一些性狀包括溶解性質(zhì)、分子量、等電點(diǎn)、存在方式、穩(wěn)定性、相對(duì)密度、粒度、黏度、目的物含量、主要雜質(zhì)種類及溶量解性質(zhì)、有關(guān)酶類的特征等。 操作者可根據(jù)文獻(xiàn)資料及本人的試驗(yàn)探索獲得有關(guān)信息，在提取過程中盡量增加目的物的溶出度，盡可能減少雜質(zhì)的溶出度，同時(shí)充分重視生物材料及目的物在提取過程中的活性變化。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 對(duì)酶類藥物的提取要防止輔酶的丟失和其他失活因素的干擾； 對(duì)蛋白質(zhì)類藥物要防止其高級(jí)

22、結(jié)構(gòu)的破壞（即變性作用），應(yīng)避免高熱、強(qiáng)烈攪拌、大量泡沫、強(qiáng)酸 強(qiáng)堿及重金屬離子的作用。 多肽類及核酸類藥物需注意避免酶的降解作用，提取過程中，應(yīng)在低溫下操作，并添加某些酶抑制劑； 對(duì)脂類藥物應(yīng)特別注意防止氧化作用，減少與空氣的接觸，如添加抗氧劑，通氮?dú)饧氨芄獾?。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 在提取過程中，如蛋白質(zhì)、酶及核酸類藥物常采用下列保護(hù)措施。（1）采用緩沖系統(tǒng) 防止提取過程中某些酸堿基團(tuán)的解離導(dǎo)致溶液pH的大幅度變化，使某些活性物質(zhì)變性失活或因pH變化影響提取效果。 在生化藥物制備中，常用的緩沖系統(tǒng)有磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、醋酸緩沖液、碳酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液和巴

23、比妥緩沖液等， 所使用的緩沖液濃度均較低，以利于增加溶質(zhì)的溶解性能。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（2）添加保護(hù)劑 防止某些生理活性物質(zhì)的活性基團(tuán)及酶的活性中心受破壞，如巰基是許多活性蛋白質(zhì)和酶的催化活性基團(tuán)，極易被氧化，故提取時(shí)，常添加某些還原劑如半胱氨酸、巰基乙醇、二巰基赤鮮糖醇、還原型谷胱甘肽等。 其他措施如提取某些酶時(shí)，常加入適量底物以保護(hù)活性中心。對(duì)易受重金屬離子抑制的活性物質(zhì)，可在提取時(shí)添加某些金屬螯合劑，以保護(hù)活性物質(zhì)的穩(wěn)定性。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（3）抑制水解酶的作用 抑制水解酶對(duì)目的物的作用是提取操作中的最重要保護(hù)性措施之一。 如需要金屬離子激活的水解酶（如DNase）常加

24、入EDTA或用檸檬酸緩沖液，使水解酶活力受到抑制。 對(duì)熱不穩(wěn)定的水解酶，可用熱變性提取法，使酶失活。 根據(jù)酶的溶解性質(zhì)的不同，可用pH不同的緩沖體系提取，以減少酶的釋放或根據(jù)酶的最適pH，選用酶發(fā)揮活力最低的pH進(jìn)行提取。 最有效的辦法是在提取時(shí)，添加酶抑制劑。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（4）其他保護(hù)措施 為了保持某些生物大分子的活性，還要注意避免紫外線、強(qiáng)烈攪拌、過酸、過堿或高溫、高頻震蕩等。 有些活性物質(zhì)還應(yīng)防止氧化，如固氮酶、銅鐵蛋白提取分離時(shí)要求在無氧條件下進(jìn)行，有些活性蛋白對(duì)冷、熱變化也十分敏感，如免疫球蛋白就不宜在低溫凍結(jié)。所以提取時(shí)要根據(jù)目的物的不同性質(zhì)，具體對(duì)待。生物制藥工藝技

25、術(shù)基礎(chǔ)(3)三、生化活性物質(zhì)的濃縮與干燥（一）生化活性物質(zhì)的濃縮 生化活性物質(zhì)提取液在進(jìn)一步分離、提純前，根據(jù)物料性能可采用不同方法濃縮，由于多數(shù)生化活性成分對(duì)熱不穩(wěn)定，因此常采用一些較為緩和的濃縮方法。1、鹽析濃縮 用添加中性鹽的方法來使某些蛋白質(zhì)（或酶）從稀溶液中沉淀出來，從而達(dá)到樣品濃縮的目的。 最常用的中性鹽是硫酸銨，其次是硫酸鈉、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸鉀等。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)2、有機(jī)溶劑沉淀濃縮 在生物大分子的水溶液中，逐漸加入乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，可以使生化物質(zhì)的溶解度明顯降低，從溶液中沉淀出來，這也是濃縮生物樣品的常用方法。 其優(yōu)點(diǎn)是溶劑易于回收，樣品不必透析除鹽，在低溫操

26、作下，對(duì)多種生物大分子較為穩(wěn)定，但對(duì)某些蛋白質(zhì)或酶卻易使它們變性失活，應(yīng)小心操作。 應(yīng)用本法獲得的濃縮物，為防止生物活性物質(zhì)變性應(yīng)盡快除去有機(jī)溶劑。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)3、用葡聚糖凝膠（Sephadex）濃縮 加入固體的干葡聚糖凝膠G25，緩慢攪拌30min，葡聚糖凝膠吸水膨脹，進(jìn)行吸濾，生物大分子全部留在溶液中，如此重復(fù)數(shù)次，可在短時(shí)間內(nèi)使溶液濃縮到l00ml，每次葡萄糖凝膠的加入量為溶液量的15為宜， 用過的葡聚糖凝膠經(jīng)蒸餾水洗凈后，可用乙醇脫水，干燥后重復(fù)使用。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)4、用聚乙二醇濃縮 將待濃縮液放入透析袋內(nèi)，袋外覆以聚乙二醇，袋內(nèi)的水分很快被袋外的聚乙二醇所吸

27、收，在極短時(shí)間內(nèi)，可以濃縮幾十倍至上百倍。5、超濾濃縮 應(yīng)用不同型號(hào)超濾膜濃縮不同分子量的生物大分子。 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)6、真空減壓濃縮與薄膜濃縮 真空減壓濃縮在生物藥物生產(chǎn)中使用較為普遍，濃縮的目的是除去揮發(fā)性溶劑，保持物料的生物活性，如薄膜蒸發(fā)器便是其中一例。 薄膜蒸發(fā)的進(jìn)行方式有二： 一是使液膜快速流過加熱面而蒸發(fā)， 另一是使物料劇烈地沸騰，產(chǎn)生大量泡沫，以泡沫的內(nèi)外表面為蒸發(fā)面進(jìn)行蒸發(fā)，后一方法使用較普遍。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（二）干燥 干燥是使物質(zhì)從固體或半固體狀經(jīng)除去存在的水分或他種溶劑，從而獲得干燥物品的過程。 水分在干燥的物料中，有三種

28、情況：即表面水、毛細(xì)管中的水與細(xì)胞內(nèi)的水。表面水很容易通過汽化除去。毛細(xì)管中的水，由于毛細(xì)管壁的作用，較難除去。 細(xì)胞內(nèi)的水由于被細(xì)胞膜包圍封閉，如不擴(kuò)散到膜外則不容易蒸發(fā)除去。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 干燥速度在溫度及壓力不變的條件下取決于液體到達(dá)表面的速度。 物質(zhì)在空氣中的干燥度，也常稱為物質(zhì)的平衡濕度，在一定條件下是一個(gè)不變值。因此，除非改變大氣的溫度，濕度或壓力。 干燥多用加熱法進(jìn)行。常用的方法有膜式干燥、氣流干燥、減壓干燥等。此外，冷凍干燥、噴霧干燥以及紅外線干燥等也常選用。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)1、減壓干燥 減壓干燥是在密閉容器中抽去空氣后進(jìn)行干燥的方法，亦稱真空干燥。2、噴

29、霧干燥 噴霧干燥是流化技術(shù)用于干燥的最早方法。待干燥的物質(zhì)先濃縮成一定濃度的液體。由于液體經(jīng)噴霧后具有極大的表面，故能在很短時(shí)間內(nèi)干燥，使受熱時(shí)間縮短，而且干燥物為粉狀，不需粉碎即可應(yīng)用。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)3、冷凍干燥 冷凍干燥是在低溫、低壓條件下，利用水的升華性能而進(jìn)行的一種干燥方法。 在預(yù)凍結(jié)過程中，制品的預(yù)凍有兩種方式： 其一是制品與干燥箱同時(shí)降溫； 另一種是待干燥箱擱板降溫至40左右，再將制品放入。前者相當(dāng)于慢凍，后者則介于慢凍與速凍之間。 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 冷凍干燥機(jī)系由制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、加熱系統(tǒng)、電器儀表控制系統(tǒng)所組成，主要部件為干燥箱

30、、凝結(jié)器、冷凍機(jī)組、真空泵組和加熱裝置等（圖2 3）。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)四、生化活性物質(zhì)的分離與純化1、生化制藥工藝中分離制備方法的特點(diǎn) 生化分離技術(shù)包括：生化分離分析和生化制備。前者主要對(duì)生物體內(nèi)各組分加以分離后進(jìn)行定性、定量鑒定。 而后者則主要是為了獲得生物體內(nèi)某一單純組分。 生物制藥工藝中分離制備方法有下列特點(diǎn)：（1）生物材料組成非常復(fù)雜。其中有不少化合物迄今還是未知物，而且生物活性物質(zhì)在分離進(jìn)程中仍處于不斷代謝變化中，因此常無固定操作方法可循。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（2）有些化合物在生物材料中含量極微，因此分離操作步驟多，不易獲得高收率。（3）生物

31、活性成分離開生物體后，易變性破壞，必須十分小心地保護(hù)這些化合物的生理活性，這也是生物制藥中分離、制備的難點(diǎn)。（4）生物制藥中的分離方法幾乎都在溶液中進(jìn)行，各種參數(shù)（溫度、pH、離子強(qiáng)度等）對(duì)溶液中各種組分的綜合影響常常無法固定，以致許多實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)理論性不強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果常常帶有很大經(jīng)驗(yàn)成分。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（5）為了保護(hù)目的物的生理活性及結(jié)構(gòu)上的完整性，生物制藥中的分離方法多采用溫和的“多階式”方法進(jìn)行，即常說的“逐級(jí)分離”方法。（6）生物產(chǎn)品最后均一性的證明與化學(xué)上純度的概念不完全相同，因生物分子對(duì)環(huán)境反應(yīng)十分敏感，結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系比較復(fù)雜，故對(duì)其均一性的評(píng)估常常是有條件的，只憑一種方法得

32、到的純度結(jié)論往往是片面的，甚至是錯(cuò)誤的。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)2、生化制藥工藝中分離制備方法的基本原理生物大分子分離純化的主要原理是：（1）根據(jù)分子形狀和大小不同進(jìn)行分離。如差速離心與超離心、膜分離（透析、電滲析）超濾法 凝膠過濾法。（2）根據(jù)分子電離性質(zhì)（帶電性）的差異進(jìn)行分離。如離子交換法、電泳法、等電點(diǎn)聚焦法。（3）根據(jù)分子極性大小及溶解度不同進(jìn)行分離。如溶劑提取法、逆流分配法、分配層析法、 鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法及有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法。（4）根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)的不同進(jìn)行分離。如選擇性吸附與吸附層析法。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（5）根據(jù)配體特異性進(jìn)行分離親和層析法。3、分離純化的基本程序

33、和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 生物體內(nèi)某一組分，特別是未知結(jié)構(gòu)的組分的分離制備設(shè)計(jì)大致可分為五個(gè)基本階段：（1）確定制備物的研究目的及建立相應(yīng)的分析鑒定方法；（2）制備物的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性的預(yù)備試驗(yàn)；（3）材料處理及抽提方法的選擇；生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（4）分離純化方法的摸索；（5）產(chǎn)物的均一性測(cè)定。 提取是分離純化目的物的第一步，所選用的溶劑應(yīng)對(duì)目的物具有最大溶解度，并盡量減少雜質(zhì)進(jìn)入提取液中，為此可調(diào)整溶劑的pH、離子強(qiáng)度、溶劑成分配比和溫度范圍等。 分離純化是生化制備的核心操作。所以合理的分離純化方法是根據(jù)目的物的理化性質(zhì)與生物學(xué)性質(zhì)依具體實(shí)驗(yàn)條件而定。 根據(jù)分析和預(yù)試驗(yàn)的初步結(jié)果，參考別人對(duì)類似物

34、質(zhì)的分離純化經(jīng)驗(yàn)，也可以少走彎路。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)4、分離純化方法步驟優(yōu)劣的綜合評(píng)價(jià) 每一個(gè)分離純化步驟的好壞，除了從分辨能力和重現(xiàn)性二方面考慮外，還要注意方法本身的回收率。5、制備物均一性的鑒定 一個(gè)制備物是否純，常以“均一性”表示。均一性是指所獲得的制備物只具有一種完全相同的成分。均一性的評(píng)價(jià)常須經(jīng)過數(shù)種方法的驗(yàn)證才能肯定。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 如果某物質(zhì)所具有的物理、化學(xué)各方面性質(zhì)經(jīng)過幾種高靈敏度方法的鑒定都是均一的，那么大致可以認(rèn)為它是均一的。 當(dāng)然，隨著更好的鑒定方法的出現(xiàn)，還可能發(fā)現(xiàn)它不是均一的。 絕對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)只有把制備物全部結(jié)構(gòu)搞清楚，并經(jīng)過人工合成證明具有相同生理

35、活性時(shí)，才能肯定制備物是絕對(duì)純凈的。 生物分子純度的鑒定方法很多，常用的有溶解度法、化學(xué)組成分析法、電泳法、免疫學(xué)方法、離心沉降分析法、各種色譜法、生物功能測(cè)定法，以及質(zhì)譜法等。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)第二節(jié) 微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)、微生物菌種的選育與菌種保藏（一）菌種的分離與篩選1、菌種的分離 （1）含菌樣品的收集 根據(jù)微生物的生態(tài)特點(diǎn)，從自然界取樣，分離所需菌種，一般可從土壤中分離。 生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) （2）富集培養(yǎng) 收集到的樣品若含所需要的菌較多，可直接分離。若含所需要的菌很少，就需要經(jīng)過富集培養(yǎng)，使所需要的菌大量生長(zhǎng)，以利篩選。 再配合控制溫度、pH或營(yíng)養(yǎng)成分即可達(dá)到目的。

36、 （3）菌種的純化 在自然條件下，各種類型的菌混雜在一起生長(zhǎng)，所以要進(jìn)行分離，以獲得純種。 菌種純化的方法一般采用稀釋分離法或劃線分離法。 2、菌種的篩選 篩選前，先要考慮哪些微生物是篩選的對(duì)象。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（二）菌種的選育與保藏1、菌株的選育 發(fā)酵生產(chǎn)，從自然界直接分離到的菌種，都不能適合實(shí)際生產(chǎn)需要。只有通過誘變、選育才能使產(chǎn)量成倍、成百倍地提高。（1）自然選育 自然選育是一種純種選育的方法。它利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理，通過分離、篩選排除衰變型菌落，從中選擇維持原有生產(chǎn)水平的菌株。因此，它能達(dá)到純化、復(fù)壯菌種，穩(wěn)定生產(chǎn)的目的。 自然選育一般包括單孢子懸浮液的制

37、備、分離及單菌落培養(yǎng)、篩選等操作過程。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)（2）誘變育種 誘變育種是指有意識(shí)地將生物體暴露于物理的、化學(xué)的或生物的一種或多種誘變因子，促使生物體發(fā)生突變，進(jìn)而從突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程。 出發(fā)菌株的選擇 出發(fā)菌株是用于誘變的原始菌株，選擇出發(fā)菌株時(shí)，應(yīng)考慮以下問題： a、出發(fā)菌株的穩(wěn)定性，盡量挑選純系菌株，以排除異核體系與異質(zhì)體菌株，因此對(duì)選定的出發(fā)菌株常需通過自然選育進(jìn)一步純化；生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) b、選用具備某種優(yōu)良特性的菌株。 c、擬選對(duì)誘變劑敏感的菌株，以提高突變頻率； d、菌種的生理狀態(tài)及生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間，因?yàn)檎T變劑對(duì)處于轉(zhuǎn)錄狀態(tài)或翻譯狀態(tài)的菌

38、種效應(yīng)要比靜止?fàn)顟B(tài)或休眠狀態(tài)的菌種敏感得多。 一般細(xì)菌處于營(yíng)養(yǎng)體，比處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體為佳。真菌和放線菌則以它們的孢子，或處于剛開始萌發(fā)狀態(tài)的孢子為佳。 為了保證菌體和誘變劑均勻接觸，出發(fā)菌株都必須制備成單細(xì)胞（孢子）懸浮液，嚴(yán)格控制單孢子的分散度在95以上。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 誘變處理 能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑。目前使用的誘變劑可分為物理誘變因子、化學(xué)誘變劑和生物誘變因子三大類。 多次反復(fù)用同一種誘變因子處理易出現(xiàn)“飽和”或回復(fù)突變現(xiàn)象，因此常采用多種不同的誘變因子或復(fù)合因子誘變。 a、物理誘變：物理誘變因子主要包括紫外線（UV）、射線、射線、快中子（FN）、射線、超

39、聲波、激光等，其中以紫外線輻照使用最為普遍。 近年來用離子束注入細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行誘變育種。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) b、化學(xué)誘變：化學(xué)誘變劑是一些能和DNA起作用，改變其結(jié)構(gòu)，并引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)。 化學(xué)誘變劑據(jù)其與DNA作用方式不同有3類： 烷化劑如氮介、乙烯亞胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亞硝基脲、亞硝酸等，它們與DNA堿基起反應(yīng)，引起堿基配對(duì)的轉(zhuǎn)換而發(fā)生遺傳變異；生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 堿基類似物，它們摻入到DNA分子中而導(dǎo)致遺傳變異如5溴尿嘧啶（5BU）、5氟尿嘧啶（5FU）等； 移碼誘變劑如吖啶黃、吖啶橙等。它們可插入DNA雙螺旋的鄰近堿基對(duì)之間造成堿基的插入或缺失導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和翻

40、譯的移碼突變。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) c、生物誘變：噬菌體可作為誘變劑應(yīng)用于抗噬菌體菌種的選育，其作用原理可能與傳遞遺傳信息，誘發(fā)抗性突變有關(guān)。 誘變劑量的選擇能夠提高正變株獲得率的誘變劑量即為最適劑量，一般情況下，誘變處理后的細(xì)胞死亡率越高，活下來的細(xì)胞的突變率也越高，故可用死亡率作為相對(duì)劑量。 在自動(dòng)化程度高的大規(guī)模篩選中，常采用死亡率在9099.9的高劑量， 小規(guī)模的人工篩選，一般采用死亡率7090的低劑量， 也有報(bào)道采用死亡率4060的更低劑量。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 增變劑的使用，氯化鋰本身并無誘變作用，但在抗生素產(chǎn)生菌的誘變育種中表明氯化鋰與一些誘變因子具有協(xié)同作用。 氯化

41、鋰使用劑量一般為0.5，處理方法多是后處理，即加在平板培養(yǎng)基中，在菌種的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)生作用。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 突變株的篩選 a、隨機(jī)篩選：隨機(jī)篩選指菌種經(jīng)誘變處理后，憑經(jīng)驗(yàn)隨機(jī)選擇一定數(shù)量的菌落，其中包括未發(fā)生突變的野生型菌株和發(fā)生突變后的正向及負(fù)向突變株，再進(jìn)行搖瓶篩選。 b、半理性化篩選：近年來，隨著遺傳學(xué)、生物化學(xué)知識(shí)的積累，人們對(duì)多種抗生素生物合成途徑及代謝調(diào)控機(jī)制的了解不斷深入，抗生素產(chǎn)生菌的推理選育技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生、即根據(jù)已知的或可能的生物合成途徑、代謝調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)來設(shè)計(jì)篩選方法，以打破微生物原有的代謝調(diào)控機(jī)制，獲得能大量形成產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株。生物制藥工藝技術(shù)基

42、礎(chǔ)(3)（3）現(xiàn)代菌種選育技術(shù) 雜交育種 雜交育種一般指將兩個(gè)基因型不同的菌株通過接合使遺傳物質(zhì)重新組合，再?gòu)闹蟹蛛x和篩選出具有新性狀的菌株。 雜交育種是選用已知性狀的供體菌株和受體菌株作為親本，把不同菌株的優(yōu)良性狀集中于重組體中。 因此雜交育種具有定向育種的性質(zhì)。雜交育種使得遺傳物質(zhì)重新組合，擴(kuò)大了變異范圍，改善了產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 原生質(zhì)體融合 用脫壁酶處理將微生物細(xì)胞壁除去，制成原生質(zhì)體，再用聚乙二醇（PEG）促進(jìn)原主質(zhì)體發(fā)生融合，從而獲得融合子，這一技術(shù)叫原生質(zhì)體融合。 原生質(zhì)體融合的重組頻率高于普通雜交方法，并實(shí)現(xiàn)了種間、屬間的融合，為親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的、性能差別

43、較大菌株實(shí)現(xiàn)雜交，開辟了一條有效的途徑。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 基因工程技術(shù) 基因工程技術(shù)可完成超遠(yuǎn)緣雜交，是將某一生物體（供體）的遺傳信息在體外經(jīng)人工與載體相接（重組），構(gòu)成重組DNA分子，然后轉(zhuǎn)入另一微生物體（受體）細(xì)胞中，使外源DNA片段在后者內(nèi)部得以表達(dá)和遺傳。 所以基因工程是在分子生物學(xué)理論指導(dǎo)下的一種自覺的、能像工程一樣可事先設(shè)計(jì)和控制的育種技術(shù)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3)2菌種的保藏（1）菌種的退化與防止 退化意味著隨時(shí)間的推移菌種的一個(gè)或多個(gè)特性逐步減退或消失。一般把菌株的生活力、產(chǎn)孢子能力的衰退和特殊產(chǎn)物產(chǎn)量的下降統(tǒng)稱為退化。 菌株的遺傳性狀是穩(wěn)定的，但是也可能發(fā)生突變。

44、因此，可以在基因型改變的情況下引起菌種退化。 在傳代過程中回復(fù)突變的數(shù)量逐步取得優(yōu)勢(shì)的過程，也就是菌種退化的過程。所以基因突變可以使原來純的菌株變?yōu)椴患?，不純菌株在傳代過程中不斷增加比例，從而導(dǎo)致群體的退化。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 菌種退化現(xiàn)象的綜合比較鑒別是： 單位容積中發(fā)酵液的活性物質(zhì)含量； 瓊脂平皿上的單菌落形態(tài)； 不同培養(yǎng)時(shí)期菌體細(xì)胞的形態(tài)和主要遺傳特征，如形成孢子能力； 發(fā)酵過程的pH變動(dòng)情況； 發(fā)酵液的氣味、色澤。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 菌種退化問題十分復(fù)雜，對(duì)其規(guī)律尚缺乏了解。所以，只能提供一些原則性防止措施。 防止基因突變，基因突變是菌種退化的一個(gè)重要原因，應(yīng)用低溫保藏

45、法可以減少突變的發(fā)生； 采用雙重缺陷型，利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型作為生產(chǎn)菌株時(shí)，回復(fù)突變可導(dǎo)致產(chǎn)量下降，采用雙重缺陷標(biāo)志可間接而有效地防止突變； 制定科學(xué)管理制度，使用菌種時(shí)大批制作平行的菌種斜面，少轉(zhuǎn)接傳代； 分離單菌落，在建立新菌株和使用過程中認(rèn)真進(jìn)行單菌落分離，再多制作平行的菌種斜面；生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 選擇培養(yǎng)條件，選擇有利高產(chǎn)菌株而不利于低產(chǎn)菌株的培養(yǎng)條件。（2）常用的菌種保藏法 微生物菌種在多次傳代中，會(huì)發(fā)生遺傳性的變異，而且退化性的變異是大量的，所以微生物菌種應(yīng)妥善保藏，使之能長(zhǎng)期保持存活、不退化，便于生產(chǎn)和科研使用。 菌種保藏的原理是根據(jù)菌種的生理、生化特點(diǎn)，創(chuàng)造條件使菌體的代謝

46、處于不活潑的狀態(tài)。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 保藏時(shí)，先挑選優(yōu)良的純種，最好是選取它們的休眠體（孢子、芽孢等），然后創(chuàng)造一個(gè)最有利于休眠的環(huán)境條件（如低溫、干燥、缺氧和缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等），以降低菌種代謝活動(dòng)的速度，達(dá)到延長(zhǎng)保存期的目的。 一種較好的保藏方法，首先要求能較長(zhǎng)期地保存原有菌種的優(yōu)良特性，但也要考慮方法本身的經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 斜面低溫保藏法。斜面低溫保藏法是最早使用的而且現(xiàn)今仍然普遍采用的方法。 具體方法是將菌種接種于所要求的斜面培養(yǎng)基上，置最適溫度下培養(yǎng)，待得到健壯的菌體后，放在4左右，濕度小于70的條件下保藏，每間隔一定時(shí)間重新移植培養(yǎng)1次。 一般，細(xì)菌每月移植一次，放線菌每3個(gè)月移植一次，酵母菌每46個(gè)月移植一次，絲狀真菌每4個(gè)月移植一次。 保存期間應(yīng)注意冰箱溫度，不能波動(dòng)太大，切忌保存在0以下，否則培養(yǎng)基會(huì)結(jié)冰脫水，造成菌種性能的衰退。生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)(3) 液體石蠟封藏法。在長(zhǎng)好菌苔的斜面試管中，加入滅過菌的液體石蠟，可防止或減少培養(yǎng)基內(nèi)水分蒸發(fā)，隔絕培養(yǎng)物與氧的接觸，從而降低微生物的代謝活動(dòng)，推遲細(xì)胞老化，延長(zhǎng)了保存時(shí)間。適用于不能利用石蠟油作碳源的微生物的保藏。 方法為選用優(yōu)質(zhì)純凈無色中性的液體石蠟，經(jīng)121加壓蒸汽滅菌30min，然后在150170烘箱