實(shí)驗(yàn)八DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定

1、實(shí)驗(yàn)八 DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定 實(shí)驗(yàn)八DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆障拗菩詢?nèi)切酶的特性。了解限制性內(nèi)切酶的用途。實(shí)驗(yàn)八DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定二、DNA限制性內(nèi)切酶概述和分析 限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:類和類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子,然后從底物上解離。類由兩種酶組成: 一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為

2、獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識(shí)別序列。類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。 絕大多數(shù)類限制酶識(shí)別長度為4至8個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列。實(shí)驗(yàn)八DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定GAATTCCTTAAGEcoR AAGCTTTTCGAAHind 5555實(shí)驗(yàn)八DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定實(shí)驗(yàn)八DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定質(zhì)粒pUC18的物理圖譜實(shí)驗(yàn)八DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定三、材料重組質(zhì)粒；EcoRI酶及其酶切緩沖液: 購買成品； Hind酶及其酶切緩沖液: 購買成品;瓊脂糖(Agarose) 。四、儀器移液器及吸頭，水平式電泳裝置,電泳儀,臺(tái)式高速離

3、心機(jī), 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀。 實(shí)驗(yàn)八DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定五、試劑 1、 5TBE電泳緩沖液：配方見第一章。 2、 6電泳載樣緩沖液：0.25 溴粉藍(lán)，40(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于 4。 3、 溴化乙錠(EB)溶液 實(shí)驗(yàn)八DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定六、操作步驟 1、 將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號(hào),用微量移液槍分別加入質(zhì)粒DNA （5-14 l）和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10緩沖液2l,再加入重蒸水使總體積為18l,將管內(nèi)溶液混勻后加入EcoRI和Hind各1l,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機(jī)甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵,要防止錯(cuò)加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時(shí)應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時(shí)間，以免活性降低。2、 混勻反應(yīng)體系后,將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?37水浴保溫1-3小時(shí),使酶切反應(yīng)完全。3、 每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應(yīng),置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?實(shí)驗(yàn)八DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定七、電泳檢測(cè) 在1瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，EB染色，紫外 透射儀下觀察或拍照。實(shí)驗(yàn)八DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和鑒定思考題：寫出EcoRI和 Hind兩種內(nèi)切酶消化產(chǎn)物的末端序列。什么是粘