生物分離技術(shù)層析技術(shù)

1、2.10 層析技術(shù)歷史和概念分類常用的層析技術(shù)薄層層析法氣相色譜技術(shù)高效液相色譜技術(shù)固相萃取技術(shù)2.10.1 歷史和概念層析Chromatography1903, Tsweett M. 茨維特碳酸鈣石油醚洗脫層析法，最早用于有色物質(zhì)分離，因此也叫色譜法，色層法層析技術(shù)的發(fā)展歷程1931年Kuhn等在氧化鋁和碳酸鈣柱上制備性的分離了,-胡蘿卜素1941年，Martin和Synge采用水分飽和的硅膠為固定相，以含有乙醇的氯仿為流動相分離乙?；被?，建立了分配層析1951年，Martin和James報(bào)道了用自動滴定儀作檢測器分析脂肪酸，創(chuàng)立了氣-液色譜法，促進(jìn)了色譜理論的形成1958年，Golay

2、首先提出了分離效能極高的毛細(xì)管柱氣相色譜法1960年代，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易汽化的大分子物質(zhì)，科克蘭、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時(shí)代 概念層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相為流過固定相的氣體或液體，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達(dá)到分離的目的。固定相：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待

3、分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。吸附劑對有機(jī)物的吸附作用有多種形式。 例如以氧化鋁作為固定相時(shí)，非極性或弱極性有機(jī)物只有范德華力與固定相作用，吸附較弱；極性有機(jī)物同固定相之間可能有偶極力或氫鍵作用，有時(shí)還有成鹽作用。這些作用的強(qiáng)度依次為： 成鹽作用 配位作用 氫鍵作用 偶極作用 范德華力作用 有機(jī)物的極性越強(qiáng)，在氧化鋁上的吸附越強(qiáng)。石油醚環(huán)己烷四氯化碳苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮吡啶乙醇甲醇水乙酸各種展開劑對極性有機(jī)物的溶解能力對極性有機(jī)物的溶解能力

4、增強(qiáng)根據(jù)層析分離機(jī)制柱層析薄層層析紙層析薄膜層析吸附層析分配層析離子交換層析凝膠層析親和層析氣相(氣-液;氣-固)層析液相(液-液;液-固)層析根據(jù)兩相所處狀態(tài)根據(jù)操作形式不同2.10.2 層析法分類2.10.3 各種層析技術(shù)吸附層析吸附色譜利用固定相吸附中心對物質(zhì)分子吸附能力的差異實(shí)現(xiàn)對混合物的分離，吸附色譜的色譜過程是流動相分子與物質(zhì)分子競爭固定相吸附中心的過程。主要吸附力：吸附能（化學(xué)吸附、物理吸附）吸附劑：常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、聚酰胺、硅藻土等。 水分、粒度、吸附物分子大小、極性、特殊化學(xué)基團(tuán)等對各種吸附劑吸附力有影響纖維素，淀粉硅酸鎂硫酸鈣硅膠佛羅里硅土氧化鎂中

5、性氧化鋁活性炭對極性有機(jī)物的吸附作用增強(qiáng)對極性生物堿在硅膠上死吸附特別嚴(yán)重，可采用哪些途徑調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)？吸附層析代表之一 活性炭層析非極性吸附劑（C-C鍵為主體），一般用于純化、分離水溶性物質(zhì)（也可用于非極性和弱極性），如甙類、氨基酸類、糖類前處理：一般先過篩，用稀鹽酸洗滌，稀堿洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈，于120 干燥45h后即可 顆?；钚蕴?or 粉末活性炭？作為非極性吸附劑，水溶液中吸附強(qiáng)，有機(jī)溶劑中吸附弱活性炭的內(nèi)表面可高達(dá)1000m2/g 硅膠600m2/g研究認(rèn)為，分子量在5003000是活性炭可能吸附的范圍，并隨分子量的增大，吸附容量減小芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物對大分

6、子化合物的吸附力大于小分子化合物在疏水性相當(dāng)?shù)臈l件下，對極性基團(tuán)多的化合物吸附強(qiáng)于極性基團(tuán)少的（與活性炭極性基團(tuán)及表面水膜有關(guān)）纖維活性炭新型的高性能活性炭吸附材料它是利用超細(xì)纖維如黏膠絲、酚醛纖維或腈綸纖維等制成氈狀、繩狀、布狀等，經(jīng)高溫(1200K以上)炭化，用水蒸氣活化后形成的。纖維活性炭的表面積大，高達(dá)1700m2/g，密度小(515kg/m3)，微孔多而均勻，絕大多數(shù)為0.00150.0030m的小孔和中孔，因而吸附容量大，吸附和脫附速率高，殘留量少，使用壽命長.吸附能力比一般的活性炭高出110倍，特別是對于一些惡臭物質(zhì)的吸附量比顆粒活性炭要高40倍左右。吸附層析代表之二 氧化鋁柱層

7、析酸性氧化鋁pH約為44.5，用于分離羧酸、氨基酸等酸性物質(zhì)；中性氧化鋁pH值為7.5（仍屬于堿性吸附劑范疇），用于分離中性物質(zhì)，應(yīng)用最廣；堿性氧化鋁pH為910，用于分離生物堿、胺和其它堿性化合物等有獨(dú)特的優(yōu)勢。醛、酮、酸、內(nèi)酯等類型不易采用中性、堿性氧化鋁分離粒度：100160目氧化鋁的吸附活性與含水量關(guān)系極大，一般在200 左右加溫46h活化，然后按照下表加入一定量水來定等級， 層析用氧化鋁通常為 級。氧化鋁價(jià)格便宜，吸附量強(qiáng)于硅膠，對雜質(zhì)吸附能力強(qiáng)于硅膠活性加入水量（%）0361015用氧化鋁柱分離長春堿和長春新堿的范例長春花堿 (抗腫瘤藥物)，英文vinblastine，用于何杰金氏

8、病，淋巴細(xì)胞瘤，組織細(xì)胞淋巴瘤，組織細(xì)胞增生癥X，晚期睪丸腫瘤，對其它化藥物耐受的絨癌及乳腺癌。 長春花 Herba Catharanthi rosei， 別名：雁來紅、日日新、日日春、天天開，為夾竹桃科植物長春花Catharanthus roseus (L.)G.Don的全草 長春花總堿溶于甲醇長春花總堿的硫酸鹽沉淀長春花總堿的硫酸鹽水溶液氯仿萃取長春花總堿氯仿液用無水硫酸鈉干燥后減壓蒸干長春花總堿浸膏1g上30g氧化鋁柱（級），柱內(nèi)徑柱長=110重蒸的苯和氯仿混合溶液（比重1.3）洗脫分段收集并采用氧化鋁薄層色譜進(jìn)行檢測合并相同流分，蒸干后溶于乙醇，制成硫酸鹽析出結(jié)晶長春堿和長春新堿在1%

9、硫酸鈰銨的磷酸溶液下顯紫紅和灰藍(lán)色氯仿-乙醚-石油醚(10:10:1v/v)為展層劑通常所說的硅膠層析之一為吸附硅膠層析，載體硅膠具有多孔性的硅氧環(huán)（mSiO2nH2O）。硅醇基顯較弱的酸性。在甲醇和水中溶解度為0.01%，pH大于9時(shí)溶解度急劇上升。吸附層析代表之三 硅膠層析硅膠活化：110 下烘干12h，其吸附性也隨著水分的增加而降低，超過12%，吸附力極弱，不能用作吸附層析，只能作為分配層析的載體。硅膠能吸附極性、非極性，飽和、不飽和分子，具有吸附層析和分配層析的雙重特性。硅膠是中性偏酸性顆粒，且制備中接觸強(qiáng)酸，常帶酸性，又是弱酸性陽離子交換劑。前處理：檢查水浸膏pH（不低于5），否則水

10、洗至中性，110 下烘干24h。特殊要求下需要經(jīng)過6mol/L鹽酸及氯仿等預(yù)洗。干裝和濕裝干裝時(shí)，先在柱底塞上少許玻璃纖維，再加入一些細(xì)粒石英砂，然后將準(zhǔn)備好的吸附劑用漏斗慢慢加入干燥的色譜柱中，邊加入邊敲擊柱身，務(wù)必使吸附劑裝填均勻，不能有空隙。吸附劑用量應(yīng)是被分離混合物量的3040倍，必要時(shí)可多達(dá)100倍。加夠以后，在吸附劑上覆蓋少許石英砂。濕裝時(shí)，將準(zhǔn)備好的吸附劑用適量展開劑調(diào)成可流動的糊，如干裝時(shí)一樣準(zhǔn)備好色譜柱，將吸附劑糊小心地慢慢加入柱中（提前放一半柱體積的展開劑），加入時(shí)不停敲擊柱身，務(wù)必使吸附劑裝填均勻，不能有氣泡和裂隙，還必須使吸附劑始終被展開劑覆蓋。一般柱層析步驟1） 裝柱

11、2）洗柱干柱在使用前要洗柱，目的是排除吸附劑間隙中的空氣，使吸附劑填充密實(shí)。洗柱時(shí)從柱頂由滴液漏斗加入所選的展開劑，適當(dāng)放開柱下端的旋塞。加入時(shí)先快加，再放慢滴加速度，使吸附劑始終被展開劑覆蓋。洗柱時(shí)也要輕敲柱身，排出氣泡。3）上樣和洗脫上樣也分為干法和濕法干法為用比填料顆粒大的干燥硅膠加入待上樣的溶液中，攪拌吸附樣品后干燥成均勻的粉末后上樣將待分離的混合物用最小量洗脫液溶解，小心加入柱中。待混合物溶液液面接近吸附劑上的石英砂時(shí)，旋開滴液漏斗旋塞，滴加展開劑。滴加速度以12滴/秒為適度。整個(gè)過程中，應(yīng)使展開劑始終覆蓋吸附劑。正確選擇層析柱，正確使用層析柱吸附層析代表之四 大孔吸附樹脂大孔吸附樹

12、脂是一種不含交換基團(tuán)的、具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑，也是一種親脂性物質(zhì)，它可以有效從很低濃度的溶液中吸附各種類型化合物（親脂鍵、偶極離子、氫鍵等吸附方式，還有分子篩作用）。裝柱、上樣、洗脫都比較簡單，吸附量大，吸附速度快，選擇性好，機(jī)械強(qiáng)度高，解吸附容易。按基團(tuán)的極性可分為極性、非極性、中極性。大孔吸附樹脂的代表：三菱大孔吸附樹脂HP20；國產(chǎn)D101大孔吸附樹脂CD180丙烯酸系用于提取分離丁胺卡那霉素等氨基糖苷類半合成抗生素860021苯乙烯系主要用于甜菊糖苷、人參皂苷的提取精制，有機(jī)物的分離LK-002脲醛系列主要用于銀杏黃酮、山楂黃酮、大豆異黃酮等的吸附提取LK-001乙烯吡啶主要用于

13、甜菊糖甙等的吸附提取DM131 改進(jìn)型樹脂苯乙烯系主要用于銀杏黃酮、人參皂甙、茶多酚等物的天然藥提取和精制，具有吸附量大、二乙烯苯殘留量低的優(yōu)點(diǎn)，符合FDA的藥用要求大孔吸附樹脂應(yīng)用舉例 氨基糖甙樣品脫鹽：將含鹽的氨基糖甙，通過大孔吸附樹脂，氨基糖甙被吸附，而鹽溶液快速通過樹脂柱，去鹽后可用(10 - 20) %的含水醇或丙酮洗脫吸附物 冬蟲夏草有效成分的吸附分離：H-103吸附樹脂對核苷類化合物和芳香性氨基酸吸附，從而與糖類和非芳香性氨基酸分離。巰基纖維素巰基棉纖維是將巰基(HS-)連接在棉花的大分子鏈上而制成。巰基棉纖維對各種金屬元素的結(jié)合能力有著明顯的差異，其強(qiáng)弱順序基本上符合軟硬酸堿原

14、則Pt（）-Pd（）Au（）-Se（）Te（）As（）Hg（）-Ag（）Sb（）Bi（）Sn（）CH3HgIn（）-Pb（）Cd（）Zn（）巰基棉對堿金屬、堿土金屬無親和性（親石元素 ）；而對親硫元素吸附性能好。各種親硫的金屬成分可與較高濃度的K、Na、Mg2、Ca2、Sr2、Fe3、Mn2、Cr3分離。巰基纖維素的應(yīng)用舉例 化學(xué)發(fā)光測定水、血液和礦石中Co Hg（）、Bi（）、 Pb（）、 Cu（）干擾Co的化學(xué)發(fā)光測定，如何去除？在pH4條件下，讓試液流過巰基棉，干擾離子被吸附，流出液可直接測定。 還有哪些吸附材料？聚氨酯泡沫塑料納米分離富集材料殼聚糖磁微球2.10.4 分配層析分配色譜利

15、用固定相與流動相之間對待分離組分溶解度的差異來實(shí)現(xiàn)分離。分配色譜的固定相一般為液相的溶劑，依靠涂布、鍵合、吸附等手段分布于色譜柱或者擔(dān)體表面。分配色譜過程本質(zhì)上是組分分子在固定相和流動相之間不斷達(dá)到溶解平衡的過程。吸附層析往往吸附過于強(qiáng)烈，分配層析則避免了這一缺陷。紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相（12% 20%的水），有機(jī)溶劑為流動相。當(dāng)有機(jī)相流經(jīng)固定相時(shí)，物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分離。 分配層析之一 紙層析影響紙層析的幾大因素：物質(zhì)的分子量物質(zhì)的極性物質(zhì)的電荷展開用的溶劑種類溫度展開方式使用濾紙的種類其它上行法下行法濾紙的選用對紙層析

16、的影響型號 標(biāo)重(g/m2) 厚度(mm) 吸水性 灰分(%) 性能 1900.17150-1200.08快速 2900.16120-910.08中速 3900.1590-600.08慢速 41800.34151-1210.08快速 51800.32120-910.08中速 61800.3090-600.08慢速 雙向紙層析1、兩相常為酸堿差異的兩相如乙酸乙酯、95%乙醇、6mol/L HCl （8：1：1 V/V）為第一相，苯、丙酸、水（100：70：1 V/V）為第二相；2、第一相展開后，取出揮發(fā)有機(jī)溶劑至干，然后可直接放入第二相中層析。舉例：大豆異黃酮雙向紙層析分析方法的研究薄層層析技術(shù)

17、一 、概述 薄層色譜法（Thin Layer Chromatography，TLC）是把吸附劑平鋪在一種載體上成一薄層作固定相，以不同的溶劑作流動相，靠吸附劑的毛細(xì)現(xiàn)象，沿著一定方向移動，使樣品中的各組分，在薄層中的吸附劑和展開劑之間，由于吸附與解吸的性質(zhì)差異而得以相互分離。Cabinet噴霧抽氣箱薄層層析優(yōu)點(diǎn)設(shè)備簡單，操作方便，消耗溶劑和吸附劑小，是一種經(jīng)濟(jì)的分離方法。分離操作時(shí)間短。一個(gè)薄板展開只需十幾分鐘，而且可以多個(gè)樣品或不同條件的薄板同時(shí)展開，工作效率高。薄層制作技術(shù)簡單，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求可以方便的更換吸附劑和制成大小、厚度不一的各種薄層。適應(yīng)的樣品范圍寬，從ng級的微量檢出到幾十毫克

18、的制備量皆很容易實(shí)現(xiàn)。樣品的性質(zhì)從極性大到非極性化合物皆可適用。流動相的更換方便，各種多元混合溶劑皆可選作展開劑，比高效被相色譜法所能選用的溶劑的范圍寬?？沙浞掷脴悠分懈鹘M分在多元混合溶劑中的分配系數(shù)差異，實(shí)現(xiàn)高效率分離。一個(gè)普通TLC理論板數(shù)可達(dá)到幾百塊，有利于一些復(fù)雜樣品的分離。展開操作技術(shù)豐富多樣，如雙向展開、圓形展開、多次展開、旋轉(zhuǎn)展開等，以適用于各種復(fù)雜體系樣品的分離與制備。薄層色譜法缺點(diǎn)（1）實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性差。不同的實(shí)驗(yàn)室，不同的操作者，甚至同一操作者的實(shí)驗(yàn)條件和結(jié)果很難完全重現(xiàn)，定量誤差一般510。（2）實(shí)驗(yàn)條件和數(shù)據(jù)的可比性較差。引起誤差的原因較多，如薄板的制作技術(shù)不良引起的薄

19、層的厚度不均一；薄板的活化，貯放條件不嚴(yán)格引起的板的活度不規(guī)范；樣品體系復(fù)雜等等，展開過程中展開劑的組成變化也是影響展開結(jié)果的因素之一。吸附劑的選擇 硅膠 這是最常用的吸附劑，要求表面孔徑在80100，粒度在2040m。 硅膠H為不含粘合劑的硅膠； 硅膠G含13-15的鍛石膏(CaSO4.1/2H2O)； 硅膠GF254是在硅膠中加入石膏和熒光指示劑，在波長為254nm的紫外光激發(fā)下發(fā)出黃綠色熒光，有紫外吸收的物質(zhì)顯色更清晰。0.5的羧甲基纖維素(CMC)氧化鋁 應(yīng)當(dāng)注意氧化鋁是一種具有催化活性的吸附刑，有可能引起試樣發(fā)生一些化學(xué)反應(yīng)，如引起酯水解，醛酮縮合，雙鍵位置遷移，脫氯化氫，酮的烯醇異

20、構(gòu)化等。所以氧化鋁薄板的應(yīng)用比硅膠板少。聚酰胺（腈綸、尼龍） 把聚酰胺粉鋪成薄層板，可用于分離易生成氫鍵的極性化合物，如酚類（鞣質(zhì)）、黃酮、酸類（核苷酸、氨基酸）、醇類、醛、酮等。DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析第一向：苯-冰乙酸體系第二向：甲酸-水體系顯色：黃綠色熒光（DNS-氨基酸）絡(luò)合薄層硝酸銀薄層主要機(jī)理是由于C=C鍵能與硝酸銀形成絡(luò)合物，而飽和的C-C鍵則不與硝酸銀絡(luò)合。因此在硝酸銀薄層上，化臺物可由于飽和程度不同而獲得分離，如碳原子相近的不飽和醇、酸；飽和化合物由于吸附最弱而Rf最高，含一個(gè)雙鍵的較含兩個(gè)雙鍵的Rf值高，含一個(gè)三鍵的較含一個(gè)雙鍵的Rf值高。順式的與硝酸銀絡(luò)合較反式

21、的易于進(jìn)行，可用來分離順反異構(gòu)體。薄層板的制作：手工、半自動、全自動、直接購買取硅膠G10g加30ml0.5CMC-Na水溶液，調(diào)成均勻糊狀物，鋪層于空氣中晾干后，移至110烘箱活化30min（1051h），置于燥器中備用（可鋪成10 cm 20cm的板8塊）展開劑的選擇方法ABCD 四元體系 A組分通常為展開劑中極性小，比例大，它對樣品不溶或微溶，在展開劑中主要是對樣品起 “輸送劑”的作用。如單獨(dú)使用，不能使樣品的斑點(diǎn)移動。 B組分極性比A組分大，能使樣品中各組分充分溶解，在展開過程中起“分配劑”作用。 C組分的極性介于A與B溶劑之間，是展開劑的“極性調(diào)節(jié)劑”，使A和B能夠互溶。D組分是為改

22、進(jìn)樣品中某些極性特別大的組分在展開中斑點(diǎn)拖尾或在原點(diǎn)不動，而加入強(qiáng)極性溶劑，如酸、堿等。其作用主要是“薄板的活性調(diào)節(jié)劑”。在展開劑中，D組分占的比例較小，必須嚴(yán)格控制加入量的準(zhǔn)確性。點(diǎn)樣與展開點(diǎn)樣時(shí)要控制點(diǎn)樣量和點(diǎn)樣次數(shù)。 一般：分析時(shí)幾到幾十微克，制備時(shí)幾到幾十毫克點(diǎn)樣時(shí)，（1）樣品溶液必須是均一體系，應(yīng)避免將非均相的混濁溶液點(diǎn)到紙或板上。（2）溶液的濃度應(yīng)在1左右，太稀對加樣體積增加，引起斑點(diǎn)擴(kuò)散。 （3）配制樣品溶液的溶劑盡量選用易揮發(fā)、極性較小的溶劑，樣品溶液太稀時(shí)可分多次加樣。（1）展開裝置應(yīng)密閉；（2）保持展開槽內(nèi)展開劑的蒸氣充分飽和，以消除“邊緣效應(yīng)”邊緣效應(yīng)(edge dffe

23、ct)：點(diǎn)于同一薄層上同一物質(zhì)的斑點(diǎn)，在色譜展開過程中，靠近薄層邊緣處斑點(diǎn)的Rf值與中心區(qū)斑點(diǎn)的Rf值有所不同，此種現(xiàn)象稱為邊緣效應(yīng)。薄層層析的定位 對展開后的薄板進(jìn)行定性與定量分析的前提是確認(rèn)板上各組分的色班或色帶的位置，通常稱顯色。常用的顯色方法有紫外熒光法、蒸氣顯色法和化學(xué)顯色法等。薄層色譜顯色劑顯色劑：有硫酸、碘的氯仿溶液、堿性高錳酸鉀溶液、磷鉬酸等通用顯色劑，也有根據(jù)化合物分類，或特殊官能團(tuán)設(shè)計(jì)的專屬性顯色劑。1碘蒸氣 對很多化合物顯黃棕色。 20.5碘的氯仿溶液 對很多化合物顯黃棕色。3碘碘化鉀溶液 對很多化合物顯黃棕色。 碘0.2g，碘化鉀0.4g，加水到100m1。 4 5磷鉬

24、酸乙醇溶液 噴后120烤，還原性物質(zhì)（多羥基、烯烴、炔烴、醛類等）顯藍(lán)色，再用氨水熏，背景變?yōu)闊o色。熒光薄層：有些化合物本身無色，在紫外燈下也不顯熒光或較弱，又無適當(dāng)?shù)娘@色劑時(shí)吸附劑中加入熒光物質(zhì)制成熒光薄層進(jìn)行層析，薄層板本身顯熒光，樣品斑點(diǎn)不顯，但吸收紫外光形成暗斑。254nm紫外光激發(fā)下顯出熒光的，如錳激化的硅酸鋅；365nm紫外光激發(fā)下發(fā)出熒光的，如銀激化的硫化鋅硫化鎬薄層層析的定性 薄層色譜分離后的定性分析最可靠的方法還是將樣品斑點(diǎn)從吸附劑上洗脫下來，除去溶劑后用有機(jī)波譜分析法進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。薄層色譜定量分析（1）溶劑洗脫分光光度測定法，方法的誤差在5以內(nèi)，已成為國內(nèi)外許多工業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量

25、控制的標(biāo)準(zhǔn)化方法。（2）在板上原位直接定量測定法。即測定斑點(diǎn)的面積法，誤差較大，一般1015之間；或測定斑點(diǎn)光密度法，誤差較小，一般510。薄層層析在天然藥物化學(xué)中的應(yīng)用1 證實(shí)兩個(gè)天然化合物相同或同類；2 測定混合物中組分的數(shù)目；3 決定適用于柱層析分離用的溶劑；4 監(jiān)控柱層析、萃取等分離過程；5 監(jiān)控一個(gè)反應(yīng)的進(jìn)程。應(yīng)用舉例：文字色料的薄層色譜檢驗(yàn)確定種類、鑒定成分以確定產(chǎn)地、銷售范圍民事案件：偽造、變造文書圓珠筆油的染料成分檢驗(yàn)不同種類藍(lán)色圓珠筆油樣品薄層色譜圖正丁醇-乙醇-水-36%乙酸體系第四章常用書寫字跡色料的薄層色譜分析第一節(jié)薄層色譜分析法概述第二節(jié)對純藍(lán)墨水字跡的薄層色譜分析第

26、三節(jié)對藍(lán)黑墨水字跡的薄層色譜分析第四節(jié)對紅墨水字跡的薄層色譜分析第五節(jié)對黑墨水字跡的薄層色譜分析第六節(jié)對碳素墨水字跡的薄層色譜分析第七節(jié)對簽字筆字跡的薄層色譜分析第八節(jié)圓珠筆油墨的薄層層析分析第九節(jié)黑色簽字筆十年發(fā)展變化研究第十節(jié)黑色筆跡與文件鑒定分配層析之反相硅膠層析所謂反相是指用非極性固定相和極性流動相組成的色譜體系。如在支持物上涂上一層高碳原子的疏水性強(qiáng)的烷烴類，洗脫液用極性強(qiáng)的溶劑，如甲醇和水的混合物。則被分離樣品中的極性強(qiáng)的物質(zhì)不被吸附，最先洗下來，得到較好的分離效果。 以2040 m無定形硅膠（或球形硅膠）為載體，與十八烷基三氯硅烷進(jìn)行鍵合制備出C18反相硅膠鍵合相（也稱ODS柱）

27、，它可完成高效液相色譜7080的分析任務(wù)。此外還有C8、C4、苯基、氰基等。流動相通常為甲醇/水體系或乙腈/水體系。C18、 C8 、 ODS、ODS2、RP18填料 硅膠基質(zhì)；高聚物小球基質(zhì)；氧化鋁；氧化鋯ODS：Octadecyl silane，十八烷基硅烷碳載量：色譜柱鍵全固定相的含碳量。一般碳載量高的，柱容量大，分離極性差異較小的比較好 孔徑、比表面積ODS填料選擇指南親水基團(tuán)疏水基團(tuán)2.10.5 離子交換層析離子交換劑是一種不溶性的高分子化合物，其分子（或其通過化學(xué)反應(yīng)引進(jìn)）具有解離性離子交換基團(tuán)，當(dāng)一定量的水溶液通過交換柱時(shí)，能與存在溶液中的陽離子或陰離子物質(zhì)起交換作用，而這種交換

28、是可逆的。強(qiáng)（弱）酸型陽離子交換劑 SO3H， COOH強(qiáng)（弱）堿型陰離子交換劑 N-(CH3)3X， NH2親水性離子交換劑（凝膠離子交換）可用于蛋白、多糖、生物堿的分離。去離子水是如何制得的？樣品強(qiáng)酸型陽離子酸性、中性化合物強(qiáng)堿性陰離子中性化合物吸附堿性化合物及兩性化合物稀NaOH洗脫酸性化合物2.10.6 凝膠層析和親和層析 親和層析：是利用生物大分子之間有專一的親和力而達(dá)到分離純化的層析方法優(yōu)點(diǎn)： 1.純化過程簡單、迅速 2.分離效率高 3.實(shí)驗(yàn)條件溫和缺點(diǎn)： 1.針對某一分離對象就需要制備專一的 吸附劑和建立相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件 2.配基的選擇及其與基質(zhì)的共價(jià)結(jié)合需 要煩瑣的操作步驟具有專

29、一性親和力的生物分子對： 酶底物（包括酶的競爭性抑制劑和輔 酶因子） 特異性抗原抗體 激素受體 DNA互補(bǔ)的DNA或RNA 凝集素和糖蛋白應(yīng)具備的特性： 1.有豐富的可供活化的化學(xué)基團(tuán)，并在溫 和條件下能與配基共價(jià)結(jié)合。 2.惰性的，非專一性吸附無或足夠小。 3.多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 4.良好的機(jī)械性能，具有好的液體流動性。 5.有較好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。載體的選擇瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖凝膠應(yīng)具備的特性： 1.對于欲純化的生物物質(zhì)應(yīng)具有專一親和性 2.必須具備能被修飾的功能基團(tuán)固相化技術(shù)：將配基以共價(jià)鍵連接于不溶于水的固相基質(zhì)上制成固相化吸附劑配基的選擇親和法舉例親和層析法分離豌豆凝集素原理

30、 親和層析技術(shù)利用豌豆凝集素可與葡聚糖凝膠發(fā)生特異性結(jié)合，再用含葡萄糖的氯化鈉溶液將豌豆凝集素洗脫下來。比較豌豆凝集素和雜蛋白對兔紅細(xì)胞凝集作用的差異來進(jìn)行鑒定。器材 1.層析柱2.恒溫孵育箱3.反應(yīng)板1）親和層析分離 Sephadex G-50裝柱，用1mol/L NaCl洗脫液平衡5分鐘,加樣6滴。加樣后立即開始收集洗脫液，每管收集3ml，控制流速1015滴/分鐘，待雜蛋白洗脫后，開始換0.2mol/L葡萄糖NaCl洗脫液進(jìn)行洗脫，每管收集3 ml。收集約10管后，用1mol/L NaCl洗脫液平衡柱5分鐘，此柱即可再生。2）豌豆凝集素生物活性測定 取反應(yīng)板一塊，分別在各孔中加入對照生理鹽

31、水、雜蛋白洗脫液、豌豆凝集素收集液各二滴再加入兔紅細(xì)胞懸液1滴，置37保溫10分鐘，取出后用玻棒在反應(yīng)孔輕輕攪動，比較各孔凝集情況，并解釋結(jié)果。各種層析分離原理及應(yīng)用領(lǐng)域?qū)游龇诸惙蛛x原理應(yīng)用領(lǐng)域吸附色譜吸附能、氫鍵各種有機(jī)化合物的分離、制備分配色譜疏水分配作用各種有機(jī)化合物的分離、制備凝膠色譜溶質(zhì)分子大小高分子分離，分子量及其分布的測定離子交換色譜庫侖力無機(jī)離子、有機(jī)離子分離親和色譜生化特異親和力蛋白、抗體、酶分離，生物和醫(yī)藥分析手性色譜立體效應(yīng)手性異構(gòu)體分離、藥物純化各種層析方法分離效能的比較類型填充劑顆粒直徑（um）N有效/t一般氣相填充柱毛細(xì)管氣相層析柱經(jīng)典柱層析薄層層析不規(guī)則硅膠微粒層

32、析柱多孔硅膠微球1300.20.5150755103610250.020.2211232.10.7 氣相色譜 GC 惰性氣體作為流動相，利用分配系數(shù)差異，組分在兩相間多次（103-106）分配，由于固定相對組分保留能力不同，經(jīng)過一定的柱長后彼此分離，順序離開色譜柱進(jìn)入檢測器，產(chǎn)生的信號經(jīng)放大后，在記錄器上描繪出各組分的色譜峰 。可替代Porakak系列固定液的發(fā)展帶動毛細(xì)管柱和氣相色譜的發(fā)展十二烷基苯磺酸鋁 非高聚物，產(chǎn)品穩(wěn)定分離范圍廣,不但可分離弱極性的烷烴、芳烴、酯、酮, 尤其對極性較強(qiáng)的有機(jī)羧酸有獨(dú)特的分離能力, 可不經(jīng)衍生直接進(jìn)樣分析耐老化GC的優(yōu)點(diǎn)、高靈敏度：可檢出10mg-10克的

33、物質(zhì)，可作超純氣體、高分子單體的痕跡量雜質(zhì)分析和空氣中微量毒物的分析。、高選擇性：可有效地分離性質(zhì)極為相近的各種同分異構(gòu)體和各種同位素。、高效能：可把組分復(fù)雜的樣品分離成單組分。、速度快：一般分析、只需幾分鐘幾十分鐘即可完成。、應(yīng)用范圍廣：即可分析低含量的氣、液體，亦可分析高含量的氣、液體，可不受組分含量的限制。、所需試樣量少：一般氣體樣用幾毫升，液體樣用幾微升或幾十微升。、設(shè)備和操作比較簡單儀器價(jià)格便宜。 氣相色譜儀 gas chromatographic instruments島津 GC2010 氣相色譜儀氣相色譜結(jié)構(gòu)流程1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計(jì);

34、6-壓力表；4-針形閥；5-流量計(jì); 6-壓力表；9-熱導(dǎo)檢測器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀；載氣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱檢測系統(tǒng)溫控系統(tǒng)載氣系統(tǒng)作為氣相色譜載氣的氣體，要求要化學(xué)穩(wěn)定性好；純度高；價(jià)格便宜并易取得；能適合于特定的檢測器。常用的載氣有氫氣、氮?dú)?、氬氣、氦氣、二氧化碳?xì)獾鹊?。載氣為什么要凈化？應(yīng)如何凈化（凈化器）？ 除去載氣中的一些有機(jī)物、微量氧，水分等雜質(zhì) 不純凈的氣體作載氣，可導(dǎo)致柱失效，樣品變化，氫焰色譜可導(dǎo)致基流噪音增大，熱導(dǎo)色譜可導(dǎo)致鑒定器線性變劣等。一般均采用化學(xué)處理的方法除氧，如用活性銅除氧；采用分子篩、活性碳等吸附劑除有機(jī)雜質(zhì)；采用硅膠，分子篩等吸附劑

35、除水分。 色譜柱(分離柱)色譜柱:色譜儀的核心部件。柱材質(zhì):不銹鋼管或玻璃，內(nèi)徑3-6毫米。長度可根據(jù)需要確定。柱填料:粒度為60-80或80-100目的色譜固定相。固定相：AT SE-30,AT OV-1組成：100%甲基聚硅氧烷極性：非極性應(yīng)用：碳?xì)浠衔锿愋吞枺篋B(HP) -1、AC1、SPB-1、CPSIL5、DM-1、RT-1使用溫度：50300固定相：AT XE-60組成：25%氰乙基甲基聚硅氧烷極性：中極性應(yīng)用：酯、硝基化合物同類型號：DB (HP) -225、AC225使用溫度：0280固定液使用 固定相：AT FFAP組成：聚乙二醇TPA改性極性：極 性應(yīng)用：酸、醇、醛、

36、酯、腈、酮、基油同類型號：DB (HP) FFAP、SP-1000、Supecl-NUKOL、AC20使用溫度：50250固定相: AT 農(nóng)殘?zhí)朅T 農(nóng)殘?zhí)柦M成：極性：應(yīng)用：六六六、DDT等含氯農(nóng)藥擬除蟲菊酯類、含磷類農(nóng)藥同類型號：SPB-608、HP-608使用溫度：25300毛細(xì)管柱內(nèi)徑 0.53mm 具有近似填充柱的負(fù)荷量，總柱效則遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過填充柱。達(dá)到同樣的分離度時(shí)，0.53mm大口徑柱的分析時(shí)間顯著快于填充柱?？煞奖愕牟捎弥线M(jìn)樣或直接進(jìn)樣技術(shù)，適合于分析不太復(fù)雜的樣品，是填充柱理想的替代柱。0.32mm 柱效稍低于0.25mm常規(guī)柱，負(fù)荷量大于常規(guī)柱的60%，用特制注射針可做柱上進(jìn)樣

37、。0.25mm 最常用的內(nèi)徑規(guī)格。有較高的柱效，負(fù)荷量較低，必須分流進(jìn)樣或無分流進(jìn)樣。用于復(fù)雜多組份樣品分析。0.20mm 柱效高,負(fù)荷量低，流失較小，適合與質(zhì)譜等靈敏檢測器聯(lián)用。毛細(xì)管柱長度 512m 短柱：分離少于10個(gè)組份（不包含難分離物質(zhì)對）的簡單樣品。2530m 中長柱：分離1050個(gè)組份的樣品。50m 長柱：分離大于50個(gè)組份或包含有難分離物質(zhì)對的復(fù)雜樣品。膜 厚 0. 10. 2um 薄液膜低負(fù)荷量，高溫下流失較小，適合于高沸點(diǎn)化合物的分析，適于配高靈敏檢測器。0.250.33um 標(biāo)準(zhǔn)液厚一般商品柱的標(biāo)準(zhǔn)液膜。0.55.0um 厚液膜較高的樣品負(fù)荷量，在高溫下流失較大，適于分析

38、低沸點(diǎn)樣品。檢測器熱導(dǎo)池檢測器的檢測原理是基于不同組分與載氣之間有不同的熱導(dǎo)系數(shù)。當(dāng)經(jīng)色譜柱分離后的組份被載氣帶入熱導(dǎo)池中由于組份和載氣的熱傳導(dǎo)率不同，因而使熱敏元件溫度發(fā)生變化，并導(dǎo)致電阻發(fā)生變化，從而導(dǎo)致電橋不平衡，輸出電壓信號，此信號的大小與被測組份的濃度成函數(shù)關(guān)系，再由記錄儀或色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)進(jìn)行換算并記錄下來。 熱導(dǎo)池檢測器的工作原理（TCD）熱敏電阻絲R參熱敏電阻絲R測載氣+組份參比池測量池純載氣構(gòu)造靈敏度低（不小于3000mvml/mg） 常用于填充柱和濃度較大時(shí)氫焰電離檢測器的工作原理（FID） 目前認(rèn)為火焰中的電離不是熱電離而是化學(xué)電離，即有機(jī)物在火焰中發(fā)生自由基反應(yīng)而被電離。

39、 化學(xué)電離產(chǎn)生的正離子( CHO+、H3O+)和電子(e)在外加150300v直流電場作用下向兩極移動而產(chǎn)生微電流。經(jīng)放大后，記錄下色譜峰。 氫火焰電離檢測器對大多數(shù)的有機(jī)化合物有很高的靈敏度。但對在氫火焰中不電離的無機(jī)化合物例如CO、CO2、SO2、N2、NH3等和電離差的有機(jī)化合物CCl4則不能檢測。氣相色譜為什么常要進(jìn)行程序升溫？提高柱溫可以提高傳質(zhì)速率，提高柱效，但柱溫過高又會使組分間分離度減小。柱溫的變化影響柱的選擇性和柱效。寬沸程混合物，選用程序升溫法可以通過升溫控制物質(zhì)分離效果，例如維持低溫使易揮發(fā)物先進(jìn)入柱子，再逐漸升溫使難揮發(fā)物進(jìn)入柱子，從而達(dá)到兩類物質(zhì)的有效分離。 為什么要

40、對氣相色譜柱進(jìn)行“老化”？目的有兩個(gè)，一是為了徹底除去填充物中的殘余溶劑（包括水），和某些揮發(fā)性雜質(zhì)。二是促進(jìn)固定液均勻的、牢固分布在擔(dān)體的表面上一般一段時(shí)間不用柱子，再用時(shí)，均要對柱子進(jìn)行老化，根據(jù)個(gè)人習(xí)慣和需要老化224h（一般20h，極性長/非極性短）。頻繁老化柱子，對柱子壽命有影響。氣相色譜檢測中樣品的衍生化有何目的？舉例：脂肪酸衍生化：高沸點(diǎn)脂水解或皂化，然后脂肪酸或脂肪酸鹽再與甲醇或乙醇反應(yīng)降低沸點(diǎn)增加高溫穩(wěn)定性減少損失和保留氣相色譜我們還必須掌握的細(xì)節(jié)載氣為什么要凈化？穩(wěn)壓閥用途？先通載氣還是先加熱柱子？混合氣體平均沸點(diǎn)和進(jìn)樣汽化溫度控制？氣相色譜儀要放置在通風(fēng)環(huán)境？Agilen

41、t 7890A/5975C 氣質(zhì)聯(lián)用儀 譜庫：NIST05標(biāo)準(zhǔn)譜庫19萬張，化學(xué)結(jié)構(gòu)式庫：16萬張 裂解氣相色譜紅外光譜聯(lián)用儀 裂解器： PYROJECTOR II氣相色譜： Agilent 6890紅外光譜： Nicolet5700 澳大利亞 SGE公司美國安捷倫公司美國熱電公司 氣相色譜在揮發(fā)油成分分析中的應(yīng)用揮發(fā)油含量檢測揮發(fā)油指紋圖譜建立氣質(zhì)聯(lián)用鑒定瑪咖揮發(fā)油中的主要成分2.10.8 High Performance Liquid Chromatography，HPLC 高效液相色譜法高效液相色譜最典型的特征： 使用內(nèi)徑28mm的細(xì)口徑不銹鋼色譜柱，平均直徑小于50um的各類型填充顆粒

42、均勻填充，使分離效率提高；采用很高的入口壓力（150400大氣壓），使流動相的速度增高，線速度一般在0.15cm/s (0.01100ml/min)之間，甚至更高一些；并通過各種高靈敏度的檢測器在線檢測（紫外檢測器可達(dá)0.01ng），以達(dá)到高速高效分離分析或制備純化各種化合物的液相柱層析方法。HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：速度快通常分析一個(gè)樣品在1530 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。分辨率高可選擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果。靈敏度高紫外檢測器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)0.1pg。色譜柱可反復(fù)使用用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收樣品經(jīng)

43、過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分。 進(jìn)樣口檢測器色譜圖色譜柱溶劑泵混合器Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)高效液相的基本操作步驟1.過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。 2.對抽濾后的流動相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘(250ml)。3.打開HPLC工作站（包括計(jì)算機(jī)軟件和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統(tǒng)。 4.進(jìn)入HPLC控制界面主菜單，點(diǎn)擊manual，進(jìn)入手動菜單。 5. 有一段時(shí)間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進(jìn)樣閥。6. 調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過200bar。選用合適的流速和所需波長，走基線，觀察基線

44、的情況7. 進(jìn)樣和進(jìn)樣后操作。進(jìn)樣，所有的樣品均需過濾；全部樣品內(nèi)成分在流動相下出峰后，繼續(xù)走一段基線，用10%甲醇和純甲醇分別洗掉柱內(nèi)雜質(zhì)。 8 關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)計(jì)算機(jī)，再關(guān)液相色譜。9. 登記。氣相色譜 PK 高效液相色譜1. 分子量應(yīng)用范圍：氣相11001000；液相1005000100002.幾乎所有不能用氣相分析的樣品；以及氣相可以分析的部分樣品3.液相色譜流動相多樣，可以通過選擇流動相和固定相使樣品得到良好的分離4.比氣相更方便制備，尤其是那些熱敏的活性物質(zhì)1. 液相條件的摸索比較復(fù)雜2.液相所需流動相比較貴，而且也不環(huán)保3.高效液相色譜價(jià)格較貴，操作要更加規(guī)范，技術(shù)要求更高高效液相色

45、譜的家當(dāng)1、過濾時(shí)為什么濾膜光面向上？2、HPLC中濾膜的選擇親水性樣品：選用親水膜片，對水有親和力，適合過濾水為基質(zhì)的溶液?？捎玫臑V膜有：混合纖維素酯（ MCE ）、聚醚砜（PES）、親水PVDF(聚偏氟乙烯）、親水PTFE（聚四氟乙烯）、尼龍66等。強(qiáng)腐蝕性有機(jī)溶劑：一般采用疏水性膜，如PTFE、聚丙烯（PP）等材質(zhì)的濾膜。蛋白溶液：低蛋白吸附的濾膜，如PVDF濾膜。離子色譜：通常認(rèn)為PES濾膜比較適合低無機(jī)離子的溶液的過濾。如果選擇針式過濾器，還要考慮樣品的體積通常樣品量小于2ml時(shí)，選用4mm直徑的微型過濾器；樣品量在2-10ml之間，選用13mm直徑的過濾器；當(dāng)樣品量大于10ml時(shí)，

46、選用25mm直徑的針式過濾器。不要使用小于10 cc的注射器，因?yàn)樾◇w積柱管可能會使壓力超過上限，導(dǎo)致濾膜的破壞或者人身傷害。僅限于實(shí)驗(yàn)室專用, 一次性使用，不可再生。應(yīng)棄去部分開頭的濾液，體積約為過濾器的死體積，以25 mm為例，大概棄去前1ml濾液；或者用1 至2 ml的溶液預(yù)清洗過濾器。通用型在線脫氣機(jī) 藍(lán)蓋瓶 HPLC專用 超聲波清洗器 針頭過濾器自動進(jìn)樣100樣品盤/機(jī)器手/自動洗針機(jī)械手樣品盤琳瑯滿目的液相色譜柱，我們?nèi)绾芜x擇？分析還是制備？極性如何？樣品數(shù)量？分離難度？重現(xiàn)性要求？pH值要求如何？有無前人的經(jīng)驗(yàn)？口袋里面的錢有多少？類型性質(zhì)色譜分離方式烷基C8、C4非極性反相、離

47、子對烷基C18非極性反相、離子對苯基非極性反相芳硝基弱極性反相或正相氰基極性正相（反相）氨基極性正相（反相、陰離子交換）Protein-Pak TM高分辨離子交換柱Protein-PakTM HR離子交換柱:填料:剛性親水性的聚甲基丙烯酸酯孔徑:1000（100納米，0.1m）優(yōu)點(diǎn):非特異性吸附小，擴(kuò)散小HPAE高效陰離子交換色譜測定蜂蜜中葡萄糖和果糖的研究CarboPacTM PAl0(4mm250mm)陰離子交換分離柱脈沖安培檢測器：電解池內(nèi)有電解反應(yīng)的發(fā)生選擇18mmol/L NaOH為淋洗液單糖在堿性條件下陰離子化異構(gòu)化(烯醇化反應(yīng))流速1.0mL/min總時(shí)間20min能較好地分離葡

48、萄糖、果糖和蔗糖。天然蜂蜜中蔗糖含量非常少，利用此方法可以鑒別天然蜂蜜的真?zhèn)?。分析柱、半制備柱、制備柱流速轉(zhuǎn)化speed=制備柱內(nèi)(半)徑的平方/分析柱內(nèi)(半)徑的平方1分析柱填料的粒徑/制備柱填料的粒徑1.5*1.5/0.23*0.23*1ml/min*5um/10um=21.2ml/min柱溫箱色譜試劑讓人流口水的一臺HPLC高效液相色譜儀-配備三個(gè)檢測器，分別是紫外檢測器、電導(dǎo)檢測器、示差折光檢測器。此外有二極管陣列檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器、蒸發(fā)激光散射檢測器紫外檢測器是高壓液相色譜儀常用的一種檢測器。利用試樣組分吸收紫外線，依據(jù)紫外線吸收光譜進(jìn)行分析。有兩種類型的紫外檢測器，一

49、是固定波長（254nm）紫外檢測器，一是可變波長紫外檢測器。用這種檢測器時(shí)，流動相必須在所使用的波長處無吸收。紫外檢測器主要用于檢測芳烴，含共軛雙鍵和生色團(tuán)的試樣組分。由于結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、靈敏度高（10-9g/ml），且不受溫度、流量等因素的影響，并能用于梯度洗脫，因而在液相色譜中被廣泛采用。 是HPLC的主要耗材之一，有時(shí)間限制！價(jià)格較貴！PDA 二極管陣列檢測器 光電二極管陣列檢測器 ( Photo-Diode Array)檢測器或DAD (Diode Array Detector)檢測器，上世紀(jì)80年代發(fā)展起來的新型紫外檢測器。 紫外檢測器只能用單波長檢測,而二極管能同時(shí)進(jìn)行全波長檢

50、測。也就是說紫外檢測器的譜圖是二維的,而二極管檢測器的譜圖是三維的。分析物質(zhì)中有多個(gè)化合物共存，且紫外特征差異較大，PDA就更有優(yōu)勢。 示差檢測器 示差檢測器是連續(xù)檢測樣品流路與參比流路間液體折光指數(shù)差值的檢測器，是根據(jù)折射原理設(shè)計(jì)的示差折光檢測器對高分子化合物、糖類、脂肪烷烴等都能夠檢測。在凝膠色譜中示差折光檢測器是必不可少的。另外在制備色譜中也經(jīng)常用到。還適用于流動相紫外吸收本底大，不適于紫外吸收檢測的體系。示差檢測器屬于通用性檢測器，如果選擇合適的溶劑，幾乎所有的物質(zhì)都可以進(jìn)行檢測。 不能用于梯度洗脫，靈敏度低，檢測限1mg/ml0.1mg/ml 電導(dǎo)檢測器（electrolytic c

51、onductivity detector, ELCD）：基于離子性物質(zhì)的溶液具有導(dǎo)電性，其電導(dǎo)率與離子的性質(zhì)和濃度相關(guān)。 電導(dǎo)檢測器是離子色譜中必備的檢測器。熒光檢測器（fluorescence detector，F(xiàn)D）：許多有機(jī)化合物，特別是芳香族化合物、生化物質(zhì)，如有機(jī)胺、維生素、激素、酶等，被一定強(qiáng)度和波長的紫外光照射后，發(fā)射出較激發(fā)光波長要長的熒光。有的有機(jī)化合物可與發(fā)熒光物質(zhì)反應(yīng)衍生化后檢測。靈敏度要比紫外檢測法高2-3個(gè)數(shù)量級。所需樣品量很小，特別適合于藥物和生物化學(xué)樣品的分析。 蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light-scattering detector, ELS

52、D）色譜柱流出液導(dǎo)入霧化器，被載氣霧化成微細(xì)液滴，液滴通過加熱漂移管時(shí)，流動相中的溶劑被蒸發(fā)掉，只留下溶質(zhì)，激光束照在溶質(zhì)顆粒上產(chǎn)生光散射，光收集器收集散射光并通過光電倍增管轉(zhuǎn)變成電信號。因?yàn)樯⑸涔鈴?qiáng)只與溶質(zhì)顆粒大小和數(shù)量有關(guān)，所以ELSD屬通用型和質(zhì)量型檢測器。適合于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測。與示差折光檢測器相比，它的基線漂移不受溫度影響，信噪比高，也可用于梯度洗脫。 進(jìn)樣器高壓泵流動相色譜柱檢測器數(shù)據(jù)處理化學(xué)工作站何謂梯度洗提？它與氣相色譜中的程序升溫有何異同之處？ 在一個(gè)分析周期內(nèi)，按一定程序不斷改變流動相的組成或濃度配比，稱為梯度洗提是改進(jìn)液相色譜分離的重要手段 梯度

53、洗提與氣相色譜中的程序升溫類似，但是前者連續(xù)改變的是流動相的極性、pH或離子強(qiáng)度，而后者改變的溫度。程序升溫也是改進(jìn)氣相色譜分離的重要手段柱子柱壓高，被污染了怎么辦？1、清洗（依據(jù)柱子的耐受程度） ： 甲醇、乙腈、5%甲醇、水、25%異丙醇-乙腈溶液、異丙醇（粘度大、低流速）、四氫呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷； DMF-二甲基甲酰胺或DMSO-二甲基亞砜與水1:1； 10%甲醇水（含0.1%磷酸）、90%甲醇水（含0.1%磷酸）； 10%、50%、100%酸性乙腈柱子柱壓高，被污染了怎么辦？2、預(yù)制柱：更換、清洗、超聲1min（接在柱后洗脫）3、反沖：低速4、拆柱：拆掉、刮掉、補(bǔ)上新填料、

54、壓實(shí)5、換柱（配備預(yù)制柱）實(shí)用高效液相色譜法的建立 美L.R.森德爾LloydR.Snyder等著；張玉奎等譯 HPLC方法的建立掌握要分析的化合物的基本性質(zhì)如何根據(jù)化合物的pKa值來選擇流動相的pH值？C18柱，較強(qiáng)保留如果是酸性化合物的話，建議pH值大于pKa值2左右，保證目標(biāo)化合物為離子狀態(tài)，更容易被洗脫。當(dāng)然了，這跟化合物的性質(zhì)有很大關(guān)系，有些化合物本來在C18上面保留不是很強(qiáng)，這時(shí)不調(diào)pH值也沒關(guān)系。如果是堿性化合物的話，pH值應(yīng)小于pKa 2左右。C18，保留較弱。調(diào)節(jié)pH在pKa值附近，盡量讓化合物呈分子狀態(tài)。分離前要考慮很多問題！定量分析？一種不希望發(fā)現(xiàn)物質(zhì)的檢出？未知樣品組分

55、的確認(rèn)？是否有必要檢測出所有樣品的化學(xué)成分？實(shí)驗(yàn)室有哪些HPLC設(shè)備？色譜柱能否恒溫？能否做梯度洗脫？該設(shè)備上建立的方法能否得到推廣和認(rèn)可？分離方法是不是還要應(yīng)用到液質(zhì)檢測？樣品的預(yù)處理！很多樣品在進(jìn)HPLC前要經(jīng)過預(yù)分離，除去干擾物，濃縮樣品，或消除“柱殺手”首次HPLC分離的較好試驗(yàn)條件主要HPLC方法的特性離子對試劑是將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子 或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配。一般適用所有色譜固定相，流動相含水至少達(dá)10，否則就有產(chǎn)生沉淀的危險(xiǎn)（特別是在使用乙腈的情況下）。當(dāng)使用長鏈的離子對試劑時(shí)，如十六烷

56、基硫酸銨或十二烷基硫酸鈉，色譜柱將選用反相色譜柱。較離子交換色譜，離子對色譜的優(yōu)點(diǎn)在于： 緩沖液制備簡單； 碳鏈長度選擇眾多，可用于增加保留時(shí)間、改善分離性質(zhì)，提高分離效率； 同時(shí)分離離子化和非離子化分析物； 分析結(jié)果重現(xiàn)性極好； 改善峰形 酸堿物質(zhì)在高效液相中的保留性能消除硅醇基-堿作用的三乙胺等保護(hù)劑緩沖溶液的使用高pH值對高效液相色譜柱壽命影響較大封端色譜柱對生物堿保留的影響舉例：高效液相色譜方法的應(yīng)用蜜柑草槲皮素（黃酮類化合物）島津LC-20AT紫外檢測器ODS柱甲醇-0.4%磷酸檢測波長360簡單的樣品前處理！標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性試驗(yàn)精密度試驗(yàn)重現(xiàn)性試驗(yàn)回收率試驗(yàn)精密度系指在規(guī)定的測試條件

57、下，同一個(gè)均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。一般用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示（即RSD）。精密度包含重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性。重復(fù)性：在相同條件下，由同一個(gè)分析人員測定所得結(jié)果的精密度，稱為重復(fù)性。取同一批次樣品，同一方法平行制備6份，分別測定含量計(jì)算6份的RSD（一般要求5%）。中間精密度：在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測定結(jié)果的精密度，稱為中間精密度。操作方法：取三批樣品，在同一試驗(yàn)室，與不同日期，不同人員，不同儀器分別檢測含量，三批樣品分別對比檢驗(yàn)結(jié)果的RSD。重現(xiàn)性：在不同實(shí)驗(yàn)室，不同分析人員測定結(jié)果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。法定標(biāo)準(zhǔn)采用的分析方法，進(jìn)行重現(xiàn)性

58、試驗(yàn)。故我們在進(jìn)行藥品質(zhì)量研究時(shí)不需驗(yàn)證。 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）=標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）/計(jì)算結(jié)果的算術(shù)平均值（X）*100%A、B兩組各有6位學(xué)生參加同一次語文測驗(yàn):A組的分?jǐn)?shù)為95、85、75、65、55、45B組的分?jǐn)?shù)為73、72、71、69、68、67這兩組的平均數(shù)都是70，但A組的標(biāo)準(zhǔn)差為18.71分，B組的標(biāo)準(zhǔn)差為2.36分，說明A組學(xué)生之間的差距要比B組學(xué)生之間的差距大得多。 檢測限：3倍噪音定量限：10倍噪音，定量限范圍做精密度試驗(yàn)線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性相關(guān)系數(shù)999目標(biāo)濃度三、生化分離介質(zhì)生化分離介質(zhì)應(yīng)具備的基本條件粒度適宜及粒徑分布均勻的微球 生化專用 5350m 大孔吸附

59、150590m 瓊脂糖 45165m 聚苯乙烯系列530m 粒徑過細(xì)，增加柱壓，影響流速； 粒徑均勻，分辨率高，重復(fù)性好，分離峰對稱生化分離介質(zhì)應(yīng)具備的基本條件介質(zhì)要具有與生物大分子的相容性，而無非特異性吸附 尤其對于常用的分子篩型凝膠過濾 保持介質(zhì)的高分離容量，延長使用壽命生化分離介質(zhì)應(yīng)具備的基本條件具有適當(dāng)?shù)目讖郊翱追植迹豪趥髻|(zhì)具有優(yōu)良的化學(xué)穩(wěn)定性：穩(wěn)定的功能基團(tuán)和食品、藥品安全優(yōu)良的物理機(jī)械穩(wěn)定性：清洗、消毒和再生生化分離介質(zhì)應(yīng)具備的基本條件要有比較寬放的pH穩(wěn)定范圍Sephadex G10 pH操作范圍：213Sephadex G200 pH操作范圍：210Sepharose 6B pH操作范圍：49Sepharose CL-2B pH操作范圍：313與生化分離介質(zhì)相關(guān)的概念交聯(lián)劑和交聯(lián)度 含兩個(gè)以上功能基團(tuán)的單體 氯代環(huán)氧丙烷二乙烯基苯生化分離介質(zhì)的分類天然多糖類 纖維