不可忽視的轉(zhuǎn)膜和封閉WesternBlot專題(經(jīng)驗(yàn)篇)(共26頁)

1、不可忽視的轉(zhuǎn)膜和封閉(fngb):WesternBlot專題(經(jīng)驗(yàn)篇) 生物通技術(shù)專題：既可以定性(dng xng)，又可以半定量的Western是初步鑒定蛋白質(zhì)最方便也是最通用的方法。Western印跡要想做的好，當(dāng)然每個(gè)步驟都不能馬虎，看看這張圖，從電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗，二抗到最后的檢測，就像“發(fā)現(xiàn)號(hào)”升空的120萬個(gè)步驟那樣(nyng)一個(gè)也不能少。如果忽視了其中的一步，結(jié)果做不出來，也是令人非常頭痛的。 “工欲善其事，必先利其器”，要想有好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，好儀器是相當(dāng)重要的，因此讓我們先來看看什么樣的儀器能讓我們無后顧之憂，順利痛快的一步到位。 Western 印跡的儀器主要就是電泳系統(tǒng)

2、和電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)了，最好的品牌當(dāng)然是Bio-Rad和Amersham（GE Healthcare）的Hoefer系列了，現(xiàn)在國內(nèi)出品的物美價(jià)廉的電泳系列產(chǎn)品，也是不錯(cuò)的選擇，幾乎每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都需要至少一套Mini Cell吧？如果還沒有你該怎么挑選呢。一、Bio-Rad經(jīng)典Mini系列 Bio-Rad Laboratories由 David Schwartz 先生和妻子化學(xué)家Alice Schwartz于1957 年創(chuàng)建，總部位于加州 Hercules，下設(shè)三大部門生命科學(xué)部，臨床診斷部和工業(yè)材料部，其中生命科學(xué)部成功躋身世界排名前五名。在2004年，Bio-Rad還低價(jià)收購了因侵犯知識(shí)產(chǎn)權(quán)限于困境

3、的MJ Research，使得伯樂在PCR領(lǐng)域的市場份額驟然擴(kuò)大。Bio-Rad生命科學(xué)部產(chǎn)品包括蛋白組研究產(chǎn)品、層析儀與填料、蛋白質(zhì)和核酸電泳產(chǎn)品等，不過最為普通實(shí)驗(yàn)室熟悉的莫過于蛋白電泳Mini系列和層析儀。只要是提到SDS，Bio-Rad絕對(duì)是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室首先考慮的品牌，經(jīng)典就是經(jīng)典呀。 Mini-PROTEAN3電泳系統(tǒng)與Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)這一套Mini系列可謂是Bio-Rad最多人熟悉和稱道的產(chǎn)品了。自上個(gè)世紀(jì)50年代Raymond利用聚丙烯酰胺凝膠的分子篩性質(zhì)來延緩蛋白質(zhì)的遷移率從而達(dá)到分離蛋白的目的以來，經(jīng)過這么多年來的發(fā)展， SDS電泳技術(shù)已經(jīng)基本成熟了。而且

4、在操作手段方面也越來越簡便，越來越準(zhǔn)確。Mini Protein Cell的出現(xiàn)使得Western的制膠和電泳的消耗成本更經(jīng)濟(jì)、操作更簡便快速這種簡便也間接促進(jìn)了Western技術(shù)的更廣泛采用。而Mini-PROTEAN 3 自被生產(chǎn)出來那天就可以說是“踩在巨人的肩膀上”，因?yàn)樗×薆io-Rad之前第一代和PROTEAN 2微型垂直電泳儀的優(yōu)點(diǎn)，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，所以獲得了全球?qū)嶒?yàn)人員廣泛的認(rèn)同與喜愛。 Mini-PROTEAN 3的優(yōu)點(diǎn)可以概括為8個(gè)字用途廣泛，操作簡便。由于Mini-PROTEAN 3可以用于SDS變性電泳、非變性電泳、Tric-Tricine電泳、等電聚焦和酶譜

5、分析，以及dsDNA、ssDNA和RNA的電泳分離，因此可以說只要實(shí)驗(yàn)室有一套Mini-PROTEAN 3，足以應(yīng)付常規(guī)垂直電泳需要了。Mini-PROTEAN 3體現(xiàn)了Bio-Red不斷改進(jìn)的努力方向設(shè)計(jì)人性化，令操作更簡便這在各個(gè)細(xì)節(jié)都可以體現(xiàn)，比如說為了防止制膠過程出錯(cuò)，Mini在玻璃板，夾合器（固定玻璃板的裝置）以及電泳槽里等處分別都有注明正反位、夾板高度或正負(fù)極；方便的夾子取代了以前需要擰4個(gè)螺絲來固定玻璃板的麻煩。由于未交聯(lián)的聚丙烯酰胺本身是神經(jīng)毒素，因此每個(gè)實(shí)驗(yàn)者都希望操作能簡單快速，盡可能減少討厭的意外“事故(shg)”漏膠的發(fā)生。Mini-PROTEAN 3巧妙的設(shè)計(jì)使得配膠

6、快速方便的同時(shí)更大大減少漏膠的幾率。除此之外，Mini的加樣容量也是可以多樣選擇的，包括10-well (30 l)，15-well (15 l)，10-well (50 l)，12-well (20 l)，9-well (30 l)，IPG comb (7 cm IPG strip)。 電泳結(jié)束后就要轉(zhuǎn)膜。同系列的Mini Trans-Blot可以說是Mini-PROTEAN 3的“完美拍檔”，它們組合在一起就是做Western印跡實(shí)驗(yàn)的最好選擇之一了。說它好，當(dāng)然是有原因的，由于Mini Trans-Blot在轉(zhuǎn)移過程當(dāng)中的三個(gè)關(guān)鍵步驟里設(shè)計(jì)巧妙，幫助轉(zhuǎn)移順利進(jìn)行，提高了轉(zhuǎn)膜效率，因此才會(huì)

7、得到如此多的用戶的贊賞。第一就是在夾板盒，由于轉(zhuǎn)膜過程中的氣泡問題對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大的影響試想一下，在特異帶顯色處正好有一個(gè)氣泡，那么本來可以很漂亮的結(jié)果就付之一炬了，甚至可能會(huì)造成假陰性結(jié)果。Mini Trans-Blot的夾板盒通過兩塊海綿與封口式設(shè)計(jì)幫助減少氣泡的存在，同時(shí)夾板盒多孔的設(shè)計(jì)也可以在壓制過程中使緩沖液均勻的滲出，減少氣泡。其次，轉(zhuǎn)膜槽的人性設(shè)計(jì)。試問一下，在轉(zhuǎn)膜中最怕什么，我想大部分人都會(huì)說是正負(fù)極弄錯(cuò)，Mini Trans-Blot為了防止這種造成整個(gè)實(shí)驗(yàn)完全失敗的情況出現(xiàn)，在轉(zhuǎn)膜槽的正負(fù)極上明確的用大范圍的紅與黑這兩種顏色標(biāo)志出來了，這樣出錯(cuò)的可能性就大大降低了。第三，

8、就是Mini Trans-Blot的冷卻裝置。Mini Trans-Blot有一個(gè)冷卻盒，聽起來好像很復(fù)雜，其實(shí)就是一個(gè)塑料盒子，但是這個(gè)盒子在轉(zhuǎn)膜過程中卻可以起重要作用，眾所周知，轉(zhuǎn)膜過程中發(fā)熱不僅會(huì)造成氣泡的形成，而且很有可能會(huì)影響蛋白的正常轉(zhuǎn)移，因此大多數(shù)轉(zhuǎn)移是在冰上進(jìn)行的，但由于空氣(kngq)的隔熱現(xiàn)象往往效果不是很明顯，利用Mini Trans-Blot，實(shí)驗(yàn)人員可以在冷卻盒中裝入緩沖液將其冰凍起來，轉(zhuǎn)膜時(shí)就可以起到冷卻的作用。除了以上這些，Mini Trans-Blot還有一次可以轉(zhuǎn)兩塊膜，低電壓過夜轉(zhuǎn)膜以及令人放心的外觀設(shè)計(jì)等方面的優(yōu)點(diǎn)。Mini-PROTEAN 3加上Mini

9、 Trans-Blot一套價(jià)格不便宜，要1000多美元呢?，F(xiàn)在那個(gè)(n ge)超薄硬質(zhì)玻璃板也可以單買了，以前可是十套打包的。 Bio-Rad除了這個(gè)(zh ge)“鎮(zhèn)店之寶”外，還有適合于13.3 x 8.7 cm gels的Criterion系列(xli)（Mini系列是8.6 x 6.8 cm），這一系列無論是電泳系統(tǒng)還是轉(zhuǎn)移系統(tǒng)都和Mini相似，但是(dnsh)它可以容納更多塊膠，為蛋白質(zhì)組分析提供便利。而且有線電極和板電極兩種方式供選擇。除此之外，還有更大尺寸的the Trans-Blot Cell(16 x20cm，26.5 x28cm)適合特別的需要的實(shí)驗(yàn)來選擇。二、電泳世家Ho

10、efer 也許國內(nèi)的研究人員不那么熟悉Hoefer，但是這個(gè)1967就成立的公司在電泳產(chǎn)品領(lǐng)域可謂赫赫有名。多年來一直專注于核酸和蛋白電泳分離技術(shù)，使得其產(chǎn)品質(zhì)量和設(shè)計(jì)一直處于領(lǐng)先地位，在國外真正屬于“頂級(jí)”口碑的電泳產(chǎn)品。被GE收購了的Amersham則是大家非常熟悉的品牌（包括獨(dú)步天下的原法碼西亞的蛋白純化王國），而多年為Amersham代工生產(chǎn)單向電泳產(chǎn)品的正是Hoefer。2003年Hoefer成為著名的哈佛生命科學(xué)全資子公司，GE（Amersham）目前繼續(xù)銷售Hoefer的各種產(chǎn)品，而且8月期間還有 HYPERLINK /custom/ge/web/1.htm t _blank 6

11、到7折的特別優(yōu)惠，很值得看看（點(diǎn)擊這里）。老實(shí)說GE的這一單向電泳系列一直算是良心價(jià)，和美國Hoefer的價(jià)格差不多，如果算上這么大的折扣優(yōu)惠，在美國也買不到這個(gè)價(jià)格呢！ GE（通用電氣公司）有一個(gè)很有名的創(chuàng)始人托馬斯愛迪生，自1896年愛迪生電燈公司和休斯頓電氣公司合并成立GE公司以來，GE秉承著“夢想啟動(dòng)未來”的理念逐漸成為了一家多元化的科技、媒體和金融服務(wù)公司。2004年4月，GE宣布成功收購Amersham公司所有股票，自此GE Healthcare在生命科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展生機(jī)勃勃，充滿朝氣，繼續(xù)拓展Amersham在基因組，蛋白質(zhì)組，分離純化，檢測試劑等領(lǐng)域打下的王朝。 在蛋白電泳與印跡

12、系統(tǒng)方面，Amersham做得標(biāo)準(zhǔn)全面，有各種的可以放置不同凝膠數(shù)目、凝膠面積和厚度的電泳槽可供選擇，通常可以分成三類：微型、中型和大型，另外電轉(zhuǎn)印跡系統(tǒng)也有多種選擇，比如說如果你想做半干轉(zhuǎn)移，那么就可以選擇Hoefer TE70或Hoefer TE77，如果是要做全濕轉(zhuǎn)移，那么Hoefer TE22或TE62是可以考慮的購買對(duì)象。所以如果你剛開始接觸蛋白電泳和Western印跡，那么可以考慮一下GE公司（Amersham）的產(chǎn)品，因?yàn)檫@些產(chǎn)品不僅購買放心，而且在產(chǎn)品服務(wù)方面也相當(dāng)不錯(cuò)，能夠找到眾多有用的資料。別具一格Hofer MiniVE Amersham在電泳儀器方面挑選范圍廣，而在蛋白

13、垂直電泳系統(tǒng)中一定要提及的就是Hofer MiniVE了，這一設(shè)計(jì)完整、使用方便的新一代電泳儀器融合了蛋白電泳與Blot兩方面裝置配備，設(shè)計(jì)獨(dú)特，而且在前一段時(shí)間GE公司大減價(jià)活動(dòng)中，全套MiniVE只要560美元，只用花一套儀器的錢就可以用作兩種用途，這么著名的品牌，真是難得物美價(jià)廉?。ㄈ绻B同電泳電源還可以再打折哦，暈.）。 說它是好貨，那么到底MiniVE是好在哪兒呢？其實(shí)在眾多電泳儀器倍出的江湖，MiniVE有三招讓其獨(dú)步武林，第一招就是操作簡便，節(jié)省時(shí)間。由于有時(shí)蛋白電泳使用頻率很高，所以實(shí)驗(yàn)人員當(dāng)然會(huì)希望操作簡單啦。MiniVE配膠過程就三步：load clampcast，只需把玻

14、璃板放上去，夾緊，然后灌膠就完事了。漏膠？那是極少發(fā)生的事。細(xì)微之處見真功，MiniVE的設(shè)計(jì)有一些過人之處。比如Spacer有T邊，大大減少側(cè)邊漏膠的幾率；而將玻璃裝到模塊上的時(shí)候，兩邊底部的玻璃/Spacer/玻璃處都有Guide Foot，頂一下“三件套”的上面就可以保證足部完全對(duì)齊防止底部漏膠。裝玻璃的時(shí)候如果傳統(tǒng)的“插進(jìn)模塊”就容易導(dǎo)致Spacer和玻璃之間“走位”，MiniVE的模塊兩個(gè)側(cè)邊和底部都可以打開，將裝好的玻璃平放，合上夾邊再擰螺絲就行；底部的封邊也很特別，有3檔，一個(gè)是密封檔，可以密封底邊后直接倒膠；一個(gè)是半開的電泳檔，允許電泳液均勻連通膠底部，另一個(gè)當(dāng)然就是完全打開以

15、便裝卸玻璃了。所以MiniVE并沒有單獨(dú)的倒膠架子，將底部封條推到密封位置后就可以將模塊“掛”在電泳主槽的邊上倒膠了，不用擔(dān)心膠面不平哦。Amersham產(chǎn)品做工精良，值得信賴的。第二招，高品質(zhì)大容量。MiniVE與一般蛋白電泳相比，有個(gè)很大優(yōu)勢，就是其蛋白膠可薄至0.5mm，而且凝膠大小是1010.5cm(WH)，比一般的108cm要長了30%，這樣的好處就是增加了蛋白分辨率，使一些“難舍難分”的蛋白組分“分道揚(yáng)鑣”，達(dá)到更好的分離效果。 HYPERLINK /feedback/newsforms/buyform.aspx?subid=2&companyname=Promega&compan

16、yid=146&proname=ViaFect%2526%238482%3b%d7%aa%c8%be%ca%d4%bc%c1&extraEmail= t blank ViaFect轉(zhuǎn)染試劑(shj)第三招，Western印跡，MiniVE采用的轉(zhuǎn)移槽是“盒式”的，潤濕的轉(zhuǎn)移膜和濾紙(lzh)、海綿組成“三明治”結(jié)構(gòu)夾在“盒式”的轉(zhuǎn)移模塊中，閉合后每個(gè)轉(zhuǎn)移模塊只用350毫升的緩沖液，放入主槽中；而電泳主槽里只放預(yù)冷的去離子水作為降溫，就可以直接轉(zhuǎn)膜了。這種轉(zhuǎn)移方法不用整個(gè)電泳主槽裝滿電泳轉(zhuǎn)移緩沖液，可以節(jié)約不少緩沖液（1.21.7升）呢，而且可以減少不均勻的發(fā)熱。Amersham除了這種微型的電

17、泳系統(tǒng)，還有Hofer其它系列，比如SE250垂直電泳儀，這種電泳系統(tǒng)配有熱交換模塊，可以消除smile現(xiàn)象（一種由于熱量交換不及時(shí)而引起的蛋白帶波動(dòng)現(xiàn)象，生物通注）。再比如凝膠大小為1816cm的SE600 Ruby，以及為了蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需要開發(fā)的Ettan DALT six和Ettan DALT twelve，這兩種電泳系統(tǒng)分別可以進(jìn)行6塊和12塊凝膠的電泳，這可以說是“庫斯拉級(jí)”的電泳系統(tǒng)??！三、國產(chǎn)品牌 國產(chǎn)電泳儀，國內(nèi)的老牌六一是大家非常熟悉的產(chǎn)品，價(jià)格的絕對(duì)優(yōu)勢令其歷時(shí)數(shù)十年而屹立不倒。電泳儀這玩意本來技術(shù)含量不比芯片掃描儀什么的，只要設(shè)計(jì)合理(hl)好用，電極絲筆直耐用分離效

18、果好，塑料槽晶瑩剔透美觀易清洗，價(jià)格合理就好。國內(nèi)品牌現(xiàn)在材料都沒話說，高透明度聚碳酸脂注塑成型，鑄造模具非常精密。關(guān)鍵就是設(shè)計(jì)，好不好用，分離效果好不好。最近新冒頭的后起之秀，北京百晶生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品就值得關(guān)注-越是新出品的電泳槽，在設(shè)計(jì)上就越值得期待，無他，只因具體設(shè)計(jì)上可以參考其他著名品牌優(yōu)缺點(diǎn)，揚(yáng)長避短，結(jié)合更多使用人多年的心得和期望進(jìn)行改進(jìn)-站在巨人的肩膀上自然有高度。 這個(gè)百晶其實(shí)是美國海灣基因集團(tuán)公司在中國設(shè)置的以出口為主兼顧國內(nèi)市場的外向型生產(chǎn)加工基地，專業(yè)研發(fā)和組裝生產(chǎn)“Baygene”品牌電泳及配套儀器，將美國工程師的人性化設(shè)計(jì)理念和國外制造的高精度模具組合起來，核心

19、進(jìn)口器件及不同程度的國產(chǎn)化率集成的國產(chǎn)貨。包括高、中、低壓電泳儀電源；垂直、水平電泳儀；可整支高溫消毒的移液器；超薄型磁力攪拌器；手掌式、臺(tái)式離心機(jī)；高精度恒溫循環(huán)器；常溫、低溫干式恒溫器；顯微鏡數(shù)碼圖像系統(tǒng)等。其中最為值得稱道的就是Baygene BG-verMINI 迷你垂直電泳儀。因?yàn)樵O(shè)計(jì)更人性化，操作更簡便。1首先，跑蛋白電泳最重要是必須效果好。 BG-verMINI 迷你垂直電泳儀（標(biāo)配）凝膠尺寸是8297mm(WH)，分離長度比一般迷你型凝膠8273cm長25%。由此增加了蛋白分辨率，分離了粘連的蛋白組分。同時(shí)又可以兼作8273cm迷你型凝膠，達(dá)到省時(shí)省液、快速方便的效果。兼顧到了

20、多種使用習(xí)慣。2：其次，只是效果好就可以嗎？在當(dāng)今越來越講究效率的今天光是效果好還不夠，還得必須操作簡單不漏膠。那么讓我們來看看 BG-verMINI 迷你垂直電泳儀如何實(shí)現(xiàn)簡單方便的。它具有獨(dú)特的灌膠裝置，可同時(shí)灌1-2塊膠。制膠過程只需三步：把帶固定墊條的玻璃固定在主槽上，再將主槽放在獨(dú)特的灌膠裝置上，即可完全放心的灌膠。任何人都能在1分鐘內(nèi)操作完成，沒有任何漏膠的可能。凝膠制成后卸掉灌膠裝置，凝膠板無需二次移動(dòng)（不用拆下玻璃板），將主槽整個(gè)放入殼體中即可電泳。最大限度避免了玻璃板移動(dòng)過程的失誤以及凝膠滲漏等等。在國內(nèi)外相關(guān)產(chǎn)品都需二次移動(dòng)的情況下，此特點(diǎn)更加彰顯突出和有效。3液體攪拌：槽

21、體底部留有1cm空間，便于電泳或轉(zhuǎn)印時(shí)放置磁力棒進(jìn)行攪拌，以使溫度和離子強(qiáng)度均勻，實(shí)現(xiàn)電泳或轉(zhuǎn)印的最好效果。若不用此功能時(shí)，可放置減液板（電泳配件）填充其空間，以減少緩沖液量。4充分接觸：電極的正極結(jié)構(gòu)為V字形設(shè)計(jì)，兩側(cè)有氣泡出孔，電泳時(shí)不會(huì)有氣泡在電極周圍存留，保證了電極與緩沖液的充分接觸，達(dá)到了散熱的良好效果。5緩沖液量自由放置：槽體寬大，充分達(dá)到了足量緩沖液帶來的極佳散熱效果。既避免了用戶自制“冰盆”冷卻的尷尬， 又避免了凝膠譜帶的“笑臉”現(xiàn)象。需要節(jié)省緩沖液時(shí)，減液板又可以發(fā)揮作用啦。上下槽合計(jì)最低緩沖液量為400ml。6多板制膠：需要提前制成大量凝膠板冷藏保存的用戶，我們也準(zhǔn)備了多板

22、制膠器供選擇，每次可制4塊凝膠。7轉(zhuǎn)印電泳：配套的聚碳酸脂模具成型BG-blotMINI迷你轉(zhuǎn)移槽，內(nèi)置冷卻裝置冰盒，其快速吸收了轉(zhuǎn)印過程的熱量，克服了無冰盒轉(zhuǎn)印的發(fā)熱現(xiàn)象。具有限位功能的轉(zhuǎn)移槽，配以顏色明顯的轉(zhuǎn)印夾和電極，確保了轉(zhuǎn)印過程的正確定向。生物通Western Blot技術(shù)(jsh)專輯之PAGE膠電泳(din yn)和轉(zhuǎn)膜 PAGE倒膠的儀器我們(w men)在前面 HYPERLINK /newsf/2005-8/2005825181619.htm t _blank WesternBlot儀器之選已經(jīng)介紹過了，除了順手的工具能防止漏膠，PAGE配膠的試劑和配方比例對(duì)電泳結(jié)果的質(zhì)量當(dāng)

23、然有決定性的影響，這個(gè)配膠的比例，在分子克隆上有詳細(xì)的論述，相信大家都不難查到。容易忽視的問題主要在于過硫酸銨（AP）一定要新鮮最好用小指管配AP（寫日期）保存在-20度，超過2周的AP扔掉算了，或者已經(jīng)反復(fù)打開使用多次的AP都別用，小氣病發(fā)作的后果往往是得不償失膠凝不好多半是這里疏忽（或者混合不勻），因?yàn)橄鄬?duì)配膠的其他組分，AP算最活躍分子如果還有諸如漏加某組分或者配比錯(cuò)誤或者Buffer搞錯(cuò)，那絕對(duì)是你自己找罵，不值得同情。水要用去離子的純水，MilliQ級(jí)更好。Cambrex(原來的FMC)有商品化的丙烯酰胺母液，很貴，也很好配出的膠對(duì)200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE膠，條帶

24、清晰漂亮，可惜一直沒有搞清楚配方的奧秘；但是數(shù)十倍于丙烯酰胺粉劑的價(jià)格令人卻步，不過，對(duì)接觸丙烯酰胺粉塵嚴(yán)重過敏的人可以選擇這個(gè)。更加豪華的選擇是已經(jīng)凝好的預(yù)制膠，各種配方各種比例各種梳孔大小多少任君選擇，打開即用，當(dāng)然更直接方便，更吸引人的是結(jié)果漂亮，分辨率高，特別是重復(fù)性好，條帶真正是razor sharp啊！平時(shí)都能用這么豪華的東西心情當(dāng)然超爽啊，實(shí)驗(yàn)緊湊又輕松，效率也更高??！如果實(shí)驗(yàn)都能這么“好馬配好鞍”，想必更容易出結(jié)果，也就更容易拿經(jīng)費(fèi)吧！什么時(shí)候我們的實(shí)驗(yàn)才能實(shí)現(xiàn)這種良性循環(huán)啊！Invitrogen旗下的Norvex和Cambrex（原來的FMC）PAGEr都是首選預(yù)制膠?？墒窃?/p>

25、“社會(huì)主義初級(jí)階段”這種奢侈品平時(shí)流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了新的優(yōu)惠活動(dòng)， HYPERLINK /custom/Invitrogen/10/index.html t _blank 買3盒NuPAGE預(yù)制膠就送電泳儀或者電轉(zhuǎn)移，面對(duì)這種誘惑，你難道就沒有一點(diǎn)非份之想的沖動(dòng)？上樣電泳(din yn)：上樣前蛋白樣品(yngpn)最好離心，上樣量不宜過多，以免看結(jié)果時(shí)，每個(gè)條帶都彎彎地“笑”你貪多嚼不爛哦。其他的操作，按照說明控制電流，不要過多重復(fù)使用電泳Buffer（別小氣，重復(fù)使用會(huì)降低緩沖能力的），好像基本不會(huì)出問題了。當(dāng)預(yù)染的Marker告訴你，你要分辨的蛋白已經(jīng)

26、到達(dá)最佳分辨區(qū)分離膠的2/3處，OK，電泳結(jié)束了。電泳結(jié)果(ji gu)檢查：如果要做Western Blot，是否需要先檢查電泳結(jié)果呢？能先看看結(jié)果如何再進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)膜當(dāng)然最好。考馬斯亮藍(lán)使用簡便快速，可以分辨1ug左右的條帶，是最經(jīng)濟(jì)通用的蛋白PAGE膠電泳染色方法。銀染操作復(fù)雜一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng蛋白?？墒怯捎诳捡R斯亮藍(lán)染色或者銀染經(jīng)過固定不可逆結(jié)合，會(huì)干擾后面的Western Blot實(shí)驗(yàn)，很多人會(huì)選擇省略掉這一步同樣的樣品跑2塊膠，一塊染色一塊轉(zhuǎn)膜，一般也可以說明問題。如果想在轉(zhuǎn)膜前看看電泳結(jié)果，你需要用SYPRO Tangerine這種金色熒光蛋白染料靈敏度很高檢

27、測4ng-8ng蛋白，接近銀染，但使用非常簡單，最重要的是由于不用酸堿或者有機(jī)溶劑固定，不干擾蛋白活性，特別適合Western轉(zhuǎn)膜前的染色，或者非變性膠的活性蛋白的檢測（比如染色后還需要在膠上進(jìn)行活性檢測等等）。可惜SYPRO Tangerine價(jià)格挺貴的，500ul（5000 x）要2000元，即使很節(jié)約的用只夠大概100多次呢。所以最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的方法是：麗春紅S，直接染色轉(zhuǎn)移膜，檢測轉(zhuǎn)膜效果，充分脫色后不干擾Western結(jié)果。麗春紅的檢測靈敏度和考馬斯亮藍(lán)差不多。轉(zhuǎn)膜：經(jīng)過PAGE電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品需要經(jīng)過“轉(zhuǎn)膜”步驟從PAGE膠轉(zhuǎn)移到膜上固定，才能用各種方法進(jìn)行Western Blo

28、t的檢測和顯色，而且為了防止沒有電場的情況下已經(jīng)分離的蛋白條帶擴(kuò)散，轉(zhuǎn)移要盡快進(jìn)行轉(zhuǎn)膜的首要是選膜。在轉(zhuǎn)移膜上顯色其實(shí)就像是畫家在畫布上作畫一樣，不光要有好的畫筆和顏料，適合的畫布也是相當(dāng)之重要。Western Blotting亦是如此，沒有選擇好合適的轉(zhuǎn)移膜是無法做出漂亮的結(jié)果的。因此，選擇適合的轉(zhuǎn)移膜，要讓轉(zhuǎn)移“膜”高一尺，幫襯而不是阻礙到我們的實(shí)驗(yàn)。 Western Blot印跡常用的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride） ，此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白

29、印跡。具體哪種膜適合于哪些實(shí)驗(yàn)?zāi)?？選擇的根據(jù)主要有：a.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。籦.不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；c.如果后繼實(shí)驗(yàn)有其他要求，比如要做蛋白測序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜，就像國畫要選擇宣紙，油畫要挑亞麻布或薄棉扣布一樣。首先(shuxin)來比較下這幾種膜的特點(diǎn)NC膜尼龍膜PVDF膜靈敏度和分辨率高高高背景低較高低結(jié)合能力80110 ug/cm2400 ug/cm2125200 ug/cm2（適合于SDS存在下與蛋白質(zhì)的結(jié)合）材料質(zhì)地干的NC膜

30、易脆軟而結(jié)實(shí)機(jī)械強(qiáng)度高溶劑耐受性無無有操作程序緩沖液潤濕,避免氣泡緩沖液潤濕使用前100%甲醇潤濕檢測方式常規(guī)染色，可用放射性和非放射性檢測不能用陰離子染料常規(guī)染色，比較于NC膜，可用考馬斯亮藍(lán)染色，可用于ECL檢測，快速免疫檢測。適用范圍0.45um一般蛋白0.2um一分子量小于20kD蛋白0.1um一分子量小于7kD蛋白低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖(主要用在核酸檢測中)糖蛋白檢測和蛋白質(zhì)測序價(jià)格價(jià)格較便宜便宜較貴1. 硝酸(xio sun)纖維素膜 硝酸纖維素膜是蛋白印跡最廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，對(duì)蛋白有很強(qiáng)的結(jié)合能力，而且適用于各種顯色方法，包括同位素，化學(xué)發(fā)光（Lumino

31、l類）、常規(guī)顯色、染色和熒光顯色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很簡便，比如不需要甲醛預(yù)處理，只要在無離子水面浸潤排出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了；比如NC膜很容易封閉，也不需要特別嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長時(shí)間， Schleicher & Schull公司的一個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)移到NC膜上的幾種蛋白4度條件下保存5年依然保持免疫識(shí)別特性，依然可以得到清晰可信的Western Blot結(jié)果。不過要注意的是純的硝纖膜在比較脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于需要多次重復(fù)清洗的用途因?yàn)榻?jīng)不起多次“折磨”。選擇硝纖膜時(shí)要注意的是選擇合適的孔徑，通

32、常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔徑的膜，小于20KD的話建議選擇0.2um的，如果小于7KD的話最好選擇0.1um的膜。另外還要注意選擇純的NC膜混有含醋酸纖維（CM）的NC膜結(jié)合力會(huì)有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上結(jié)合的蛋白會(huì)因?yàn)橐恍┤ノ蹌┒淮妫虼嗽诜忾]時(shí)最好使用較溫和的Tween20，而且濃度不要超過0.3%（據(jù)說0.05%效果最好）。 硝纖膜最為大家熟悉和認(rèn)可的品牌就是 Schleicher & Schull；Millipore；PALL，另外羅氏、Invitrogen、GE（Amersham）、Santa Cruz等公司都有提供各式的硝纖膜（估計(jì)OEM的可能性比較大

33、，不過有時(shí)挺奇怪的，OEM的有時(shí)比生產(chǎn)廠家賣的還便宜）。 Schleicher & Schull的名字拗口那大概需要舌頭在口腔里經(jīng)過若干次不同弧度和不同速度的上下往返精確運(yùn)動(dòng)再配合適當(dāng)?shù)耐職獠拍茏x得準(zhǔn)確優(yōu)雅，不過作為第一個(gè)提供硝纖膜的廠家依然廣為人知，其NC膜分為純NC膜和強(qiáng)化NC膜兩種：Protran nitrocellulose membrane和Optitran nitrocellulose membrane。前者Protran一直是 Schleicher & Schull自豪的產(chǎn)品，這種“100% Pure Nitrocellulose Membranes”。一般而言，NC膜越純，其蛋

34、白結(jié)合能力就越高，所以要增加WB的靈敏度和分辨率，提高所使用膜的純度是個(gè)可以考慮的選擇。如果NC膜攙雜一些醋化纖維素這在前面已經(jīng)提到，會(huì)影響蛋白質(zhì)結(jié)合。而Protran在制作過程中去除了各種雜質(zhì)，保證了其純度，從而增加了蛋白結(jié)合能力。除了這一點(diǎn)以外，Protran還有低背景、多孔徑選擇（0.45, 0.2, 0.1um）和保存時(shí)間長（實(shí)驗(yàn)證明膜上蛋白辨認(rèn)時(shí)間可長達(dá)5年！真是“路遙知馬力”的典范）等優(yōu)點(diǎn)。但是Protran由于是純NC膜，比較脆，機(jī)械耐受力欠佳，需要小心操作，如果擔(dān)心自己“粗手粗腳”，那么就可以考慮一下Optitran或者(huzh)Pall公司的以耐受力著稱的BioTrace

35、NT Nitrocellulose Transfer Membrane。 Optitran是在一層超薄聚酯支撐膜的兩面均勻鋪上100%純的硝酸纖維素，結(jié)果表面看起來和純硝纖膜完全一樣，保持了NC膜各種優(yōu)點(diǎn)，只是內(nèi)部多了一層中性支持物，大大增強(qiáng)這種強(qiáng)化NC膜的柔韌度和機(jī)械耐受力，不容易卷曲，方便操作，特別是重復(fù)標(biāo)記和洗脫的實(shí)驗(yàn)(shyn)。不過有的使用過的人反應(yīng)不如純NC膜結(jié)合能力強(qiáng)。 NC膜除了一般的Discs、Rolls和Sheets以外，像Invitrogen、Bio-Rad公司還有一種方便顧客使用的“sandwich”三明治形，十分有趣。說它有趣是因?yàn)榭紤]周到，利于高通量操作，但其實(shí)也就

36、是將濾紙和NC膜紙?zhí)壮蔀V紙NC膜濾紙的層迭形式，預(yù)先切割裝訂好，方便使用。不過，卷膜肯定是最實(shí)惠的選擇，只不過要自己動(dòng)手裁剪切記，必須帶手套操作。不知道為什么在國外硝纖膜會(huì)被當(dāng)作危險(xiǎn)品來運(yùn)輸還要加收運(yùn)費(fèi)，所以貨期蠻長的，所以還是卷膜好，一卷用n年如果非要給這個(gè)n加個(gè)期限，那就是至少可以用到等我畢業(yè)之后。2. PVDF膜 剛開始做WB的人也許會(huì)有這種疑問：為什么實(shí)驗(yàn)室的老師（或者(huzh)師兄師姐們）在教我們做WB的時(shí)候，如果是用PVDF膜做，總是小心翼翼的剪，節(jié)省著用，甚至一些邊邊角角也舍不得丟掉呢？其實(shí)，這不僅是因?yàn)镻VDF膜比較貴，還由于PVDF膜是做WB的“殺手锏”。 聚偏二氟乙烯（P

37、VDF）膜作為基質(zhì)的轉(zhuǎn)印膜由Millipore公司在1985年首先推出。與硝酸纖維素膜相比，PVDF膜在蛋白質(zhì)截留能力，機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)相容性上都更優(yōu)越的性能(xngnng)（Pluskal,et al.,1986)。市售硝酸纖維素膜的典型結(jié)合量是80-100g/cm2,而PVDF膜結(jié)合量是100-200g/cm2（而結(jié)合強(qiáng)度PVDF比硝纖膜強(qiáng)6倍！）。在艾滋病毒（HIV）血清學(xué)檢驗(yàn)中直接比較PVDF和硝酸纖維素膜，PVDF膜具有更好的截留總HIV抗原能力并提高抗體檢測糖基化被膜抗原的性能。但是PVDF膜最大的優(yōu)點(diǎn)不僅于此：更好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)耐受性使PVDF膜在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測中成為

38、理想選擇；而且單個(gè)凝膠的泳道復(fù)本可用于多種目的，如考馬斯亮藍(lán)染色后切出條帶并進(jìn)行N-末端測序、蛋白消化/肽分離/內(nèi)部測序和免疫檢測（Kurien,et al.,2003)。特別是需要做N端蛋白測序，在相當(dāng)“嚴(yán)酷”的清洗條件下，當(dāng)尼龍或者硝纖膜已經(jīng)降解的情況下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。所以PVDF也是要做蛋白測序的唯一選擇。此外，個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，一些強(qiáng)疏水蛋白用PVDF膜效果會(huì)更好一些。PVDF膜適用的檢測方法也不少，化學(xué)發(fā)光、常規(guī)顯色、同位素和標(biāo)準(zhǔn)染色都一樣OK，但不適合熒光。PVDF膜特別注意的是需要100%甲醇預(yù)處理（不超過15秒）再用緩沖液平衡，才能用，而且適用過程中萬一干了也要同樣程

39、序再處理（不過要真出現(xiàn)這種問題也是自己欠扁，誰要你不小心呢，轉(zhuǎn)膜前處理也就罷了，轉(zhuǎn)膜后再這樣處理可能會(huì)影響后繼的抗體識(shí)別呢）。PVDF膜同樣分0.45um和0.2um的，后者孔徑小，對(duì)小分子蛋白有較好的攔截吸附，背景可能會(huì)比前者稍高。PVDF膜常見(chn jin)的有以下幾個(gè)品牌公司產(chǎn)品名孔徑適用范圍參考價(jià)格MilliporeImmobilon Transfer Membranes0.45um0.2um$212Bio-RadImmun-Blot PVDF MembraneChemiluminescent, colorimetric western blots,amino-terminal sequence and total amino acid compositionPiercePVDF Membrane0.45um0.2umWestern, Southern, N