藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析

1、第十一章 抗生素類(lèi)藥物的分析藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析一、概述1.抗生素（antibiotics）： 在低微濃度下即可對(duì)某些生物（病原微生物）的生命活動(dòng)有特異抑制作用的化學(xué)物質(zhì)的總稱(chēng)2.分類(lèi)內(nèi)酰胺類(lèi)氨基糖苷類(lèi)四環(huán)素類(lèi)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)多烯大環(huán)類(lèi)多肽類(lèi)藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析3.來(lái)源： 生物合成（發(fā)酵） 化學(xué)合成或半合成4.抗生素的特點(diǎn)： 化學(xué)純度較低 活性組分易發(fā)生變異 穩(wěn)定性差生產(chǎn)工藝復(fù)雜發(fā)酵過(guò)程不易控制易受污染藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析5.抗生素質(zhì)量分析采用生物學(xué)法與物理化學(xué)法鑒別：理化方法、微生物法檢查：水分、pH值、異常毒性、熱原、細(xì)菌內(nèi)毒素、降壓物質(zhì)等含量/效價(jià)測(cè)定： 微生物法 ： 與臨床

2、療效吻合,靈敏度高；但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí) 理化方法：準(zhǔn)確度與專(zhuān)屬性較高, 且操作簡(jiǎn)便；但與臨床療效有偏差藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析二、 內(nèi)酰胺類(lèi)包括青霉素類(lèi)和頭孢菌素類(lèi)1.化學(xué)結(jié)構(gòu)：青霉素類(lèi)：6-APA為母核頭孢菌素類(lèi)：7-ACA為母核*藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析2. 主要理化性質(zhì)：1）酸性（羧基）： pKa 2.5-2.8 酸性較強(qiáng) 與堿金屬成鹽后水溶性好2） UV（共軛）： 青霉素類(lèi)：苯環(huán)取代基 頭孢菌素類(lèi)：母核有共軛結(jié)構(gòu)藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析3）旋光性： 有多個(gè)手性碳4）穩(wěn)定性（內(nèi)酰胺）： 干燥條件較穩(wěn)定，溶液不穩(wěn)定 青霉素 降解、失效氧化劑、酸、堿酶、金屬離子、藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析

3、3. 鑒別1）羥肟酸鐵反應(yīng)：內(nèi)酰胺類(lèi) 羥肟酸 顯色2）茚三酮反應(yīng)-氨基 藍(lán)紫色3）雙縮脲反應(yīng)內(nèi)酰胺類(lèi) 紫色4）光譜法（UV、NMR）5）色譜法（HPLC、TLC）NH2OHHClNaOHFe3+H+茚三酮 堿性酒石酸銅呈色反應(yīng)藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析頭孢利定的NMR鑒別法(JP14)取本品50mg溶于0.5ml重水中，測(cè)定NMR光譜時(shí)，應(yīng)顯示3.8 附近 6.97.5 7.99.0 單峰信號(hào) 多重峰信號(hào) 多重峰信號(hào) 2 ： 3 ： 5強(qiáng)度比藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析頭孢氨芐鑒別的TLC條件ChP(2000) 5mg/ml 2l 硅膠G 0.1mol/L枸櫞酸液-0.2mol/LNa2HPO4

4、-丙酮(120:80:3)；0.1%茚三酮溶液顯色USP(24) 25mg/ml 5l 硅膠 醋酸乙酯-水-乙腈-冰HAc(48:18:14:14)；短波長(zhǎng)UV光檢出BP(1999) 0.4%(W/V) 1l 硅烷化硅膠HF254 15.4% NH4Ac(pH6.2)-丙酮(85:15)；254nm檢出藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析4.特殊雜質(zhì)檢查聚合物、有關(guān)物質(zhì)、異構(gòu)體等頭孢他啶中聚合物測(cè)定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用葡聚糖凝膠G-10（40120m）為填充劑，玻璃柱內(nèi)徑1.31.5cm，床體積5060ml；流動(dòng)相A為含3.5%硫酸銨的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鈉2.19g和磷酸

5、二氫鈉0.54g，加水1000ml使溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0），流動(dòng)相B為0.01%十二烷基硫酸鈉溶液；流速為每分鐘1ml；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。以流動(dòng)相A為流動(dòng)相，用1mg/ml藍(lán)色葡聚糖2000溶液進(jìn)樣200l進(jìn)行測(cè)定，理論板數(shù)應(yīng)不低于900，拖尾因子在0.751.5，對(duì)照品溶液以流動(dòng)相B為流動(dòng)相，重復(fù)進(jìn)樣200l，峰面積值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)小于5.0%藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析對(duì)照品溶液的制備：取頭孢他啶對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加水制成每1ml中含頭孢他啶100g的溶液，搖勻測(cè)定法 取本品適量，精密稱(chēng)定，加水制成每1ml中約含頭孢他啶20mg的溶液，立即進(jìn)樣200l，以流動(dòng)相A為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，

6、記錄色譜圖；另取對(duì)照品溶液200l注入液相色譜儀，以流動(dòng)相B為流動(dòng)相，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算，本品含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計(jì)不得過(guò)0.3%藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：測(cè)定頭孢呋辛酯的HPLC系統(tǒng)為ODS分析柱；0.2mol/L磷酸二氫銨-甲醇（62:38）為流動(dòng)相，流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm。要求頭孢呋辛酯A，B異構(gòu)體之間，頭孢呋辛酯A異構(gòu)體與頭孢呋辛酯2-異構(gòu)體之間的分離度應(yīng)大于1.5；理論板數(shù)按頭孢呋辛酯A異構(gòu)體峰計(jì)算，應(yīng)不低于1500藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析異構(gòu)體 取本品適量，配制成每1ml中約含0.25mg

7、的甲醇-流動(dòng)相(11)的溶液，取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖。B異構(gòu)體峰的相對(duì)保留時(shí)間約為0.85，A異構(gòu)體峰的相對(duì)保留時(shí)間為1.0。供試品色譜圖中A異構(gòu)體峰的面積與A、B異構(gòu)體峰的面積和之比應(yīng)為0.480.55。 40020600302010時(shí)間(min)峰高(mAU)65432113.95411.9192.401藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析 有關(guān)物質(zhì) 取本品適量，精密稱(chēng)定，加流動(dòng)相制成每1ml中約含0.2mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加流動(dòng)相制成每1ml中約含6g的溶液，作為對(duì)照溶液。取對(duì)照溶液20l注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿(mǎn)量程的10%，再取供

8、試品溶液和對(duì)照品溶液各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的2.5倍，供試品溶液如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的和，不得大于對(duì)照溶液主峰的面積藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析5.含量測(cè)定1）碘量法（ChP2000）原理：青霉素與頭孢菌素本身不與碘反應(yīng)，但其堿性降解產(chǎn)物可消耗碘青霉素族頭孢菌素族NaOH水解4I2H +8I-I2+2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6定量過(guò)量剩余藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析反應(yīng)分兩步進(jìn)行：水解反應(yīng) (按化學(xué)計(jì)算量進(jìn)行)氧化-還原反應(yīng) (無(wú)定量關(guān)系，受溫度、pH值和時(shí)間等因素影響，應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)條件并采用標(biāo)準(zhǔn)品平行對(duì)照測(cè)定)藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析

9、空白試驗(yàn)因樣品中雜質(zhì)會(huì)消耗碘，故應(yīng)作空白試驗(yàn) 空白試驗(yàn)與經(jīng)典空白試驗(yàn)不同：加入樣品，不加堿，其余試劑（醋酸鹽緩沖液，碘液，硫代硫酸鈉）都加藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析試驗(yàn)條件：（I2氧化）弱酸性（pH4.5） 堿 I2 IO3- + I- 酸 某些藥物與碘生成復(fù)鹽沉淀溫度（2426） 溫度38 時(shí)未水解的供試品亦消耗碘反應(yīng)時(shí)間：（ 20分鐘）20分鐘后，耗碘量隨時(shí)間的變化較小藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析特點(diǎn)靈敏度高：樣品 : 碘 = 1 : 8反應(yīng)條件、實(shí)驗(yàn)操作要求高含量1份含量V對(duì)、V對(duì)空V樣、V樣空加試劑次序、反應(yīng)時(shí)間、滴定速度相同含量 對(duì)照品 V樣空 - V樣 W對(duì) V對(duì)空 - V對(duì) W樣藥

10、物分析抗生素類(lèi)藥物的分析2）電位配位滴定法（汞量法） 原理：青霉素不與汞鹽反應(yīng)，其堿性降解產(chǎn)物可與Hg2+絡(luò)和 Hg+ + 2R-SH (RS)2Hg + 2H+ 方法說(shuō)明： a 空白試驗(yàn)與碘量法類(lèi)似，加樣品，不加NaOH b 與碘量法相比，汞量法不需對(duì)照試驗(yàn)藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析3）酸堿滴定法4）硫醇汞鹽法 青霉素 青霉烯酸硫醇汞鹽5）羥肟酸比色法 內(nèi)酰胺類(lèi) 紅色6）HPLC法：應(yīng)用廣泛咪唑HgCl2（max 324345nm）NH2OHH+Fe3+藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析阿莫西林克拉維酸鉀片色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉7.8g

11、，加水900 ml溶解，用磷酸或10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.40.1，加水稀釋至1000ml)-甲醇(95:5)為流動(dòng)相；流速為0.7ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。阿莫西林峰與克拉維酸峰的分離度應(yīng)大于3.5 測(cè)定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水適量，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液10l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取阿莫西林對(duì)照品與克拉維酸對(duì)照品各適量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉維酸0.25mg的混合溶液，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積分別計(jì)算供試品中C16H19N3

12、O5S和C8H9NO5的含量。藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析三、氨基糖苷類(lèi)1.化學(xué)結(jié)構(gòu)鏈霉素 都是以氨基環(huán)醇與氨基糖縮合而成的苷 分子結(jié)構(gòu)中都含有多羥基 均為堿性抗生素藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析2.性質(zhì)1）堿性（氨基）：臨床應(yīng)用其硫酸鹽2）溶解度（氨基、羥基）：水溶性3）旋光性（糖）：多個(gè)手性碳4）穩(wěn)定性（苷）：強(qiáng)酸、堿條件均可水解藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析3.鑒別1）茚三酮反應(yīng)： 具羥基胺類(lèi),-氨基酸性質(zhì) 鏈霉素 + 水和茚三酮 藍(lán)紫色2） N-甲基葡萄糖胺（Elson-Morgan）反應(yīng)： 鏈霉素 N-甲基葡萄糖胺 紅色水解對(duì)二甲氨基苯甲醛乙酰丙酮OH-藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析3）麥芽酚（M

13、altol)反應(yīng) (鏈霉糖特有） 鏈霉素 麥芽酚 紫紅色OH-重排Fe3+8-羥基喹啉 NaOBr或-萘酚 OH-水解4）坂口（Sakaguchi）反應(yīng)： (鏈霉胍特有） 鏈霉素 鏈霉胍 橙紅5）硫酸鹽反應(yīng)藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析4. 檢查1）鏈霉素中鏈霉素B的檢查 來(lái)源：發(fā)酵中產(chǎn)生 BP：薄層色譜法（雜質(zhì)對(duì)照品法）藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析2）慶大霉素C 組分測(cè)定 （系統(tǒng)適用性試驗(yàn)） 色譜柱：ODS 流動(dòng)相：H2O-HAc-MeOH配制的庚烷磺酸鈉溶液(0.2M)，必要時(shí)調(diào)節(jié)甲醇的含量 檢測(cè)波長(zhǎng)：330nm（鄰苯二甲醛柱前衍生） 要求：NC2 2000，C2a峰和C2峰的分離度應(yīng)符合要求，

14、重復(fù)進(jìn)樣RSD2.0%5. 含量 微生物法、HPLC法等藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析四、四環(huán)素類(lèi)1.化學(xué)結(jié)構(gòu)藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析2.性質(zhì)1）兩性： -OH：酸性 N(CH3)2：堿性 與酸、堿均可成鹽；臨床多用鹽酸鹽2）旋光性3）UV和熒光： 4）與金屬離子絡(luò)合： 酚羥基、烯醇基與Ca2+、Mg2+絡(luò)合顯色藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析5）穩(wěn)定性 易發(fā)生異構(gòu)化,降解等反應(yīng),性質(zhì)不穩(wěn)定弱酸性（pH2-6） A環(huán)C-4異構(gòu)化 差向四環(huán)素酸性（pH 2） C環(huán)脫水 脫水四環(huán)素 堿性 C環(huán)開(kāi)環(huán)，形成內(nèi)酯 異四環(huán)素藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析 AApH2.06.0差向異構(gòu)體DDDCBBCBC脫水四環(huán)素類(lèi)異四環(huán)素OH-藥物分析抗生素類(lèi)藥物的分析3.鑒別1）濃硫酸反應(yīng)2）FeCl3反應(yīng)： （酚羥基） 顯紅色褐色3） TLC、HPLC4）熒光： （ 含共軛雙鍵） 紫外燈照射下