1,3-β-D-葡聚糖的檢驗(yàn)與臨床.

1、1,3-D-葡聚糖檢驗(yàn)與臨床天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院胡志東E-mail: 1AIDS插管等侵襲性治療腫瘤和免疫抑制治療骨髓和實(shí)體器官移植廣譜抗生素治療 侵襲性真菌感染率上升2嚴(yán)重真菌感染迅速上升勢頭 危重病人的存活期延長延長了真菌感染的 高 危 期使此類患者業(yè)已增加的人數(shù)進(jìn)一步擴(kuò)大醫(yī)學(xué)和相關(guān)科學(xué)的進(jìn)步是日益嚴(yán)重的威脅！3真菌感染的危險因素：中心靜脈插管尿道插管廣譜抗生素氣管插管腹部外科腸胃外營養(yǎng)營養(yǎng)不良住院時間感染之前定殖4侵襲性真菌感染條件致病性真菌念珠菌病曲霉病隱球菌病其他5診斷方法影像學(xué)組織病理學(xué)/細(xì)胞學(xué)培養(yǎng)血清學(xué)分子生物學(xué)方法： Platelia Aspergillus ELISA Fung

2、itell assay PCRunavailable傳統(tǒng)的方法6真菌病實(shí)驗(yàn)室診斷主要內(nèi)容準(zhǔn)確、快速檢出真菌病原體真菌鏡檢真菌培養(yǎng)組織病理生理生化血清學(xué)方法分子生物學(xué)7鏡檢和培養(yǎng)方法敏感性低 血培養(yǎng)：在腫瘤和血液病病人中，50%尸檢證實(shí)深部念珠菌感染的病例血培養(yǎng)陰性。培養(yǎng)結(jié)果陽性僅表示存在某種真菌，區(qū)分定植和感染困難培養(yǎng)時間長有些標(biāo)本采集困難8非培養(yǎng)方法優(yōu)點(diǎn)快速報告結(jié)果敏感性提高取材簡便多以真菌在致病狀態(tài)產(chǎn)生的物質(zhì)為檢測標(biāo)志物，結(jié)果陽性提示有致病性定量檢測可判斷感染嚴(yán)重程度及療效評估9非培養(yǎng)診斷的方法簡介真菌細(xì)胞壁成分1-3 - - D-葡聚糖檢測G試驗(yàn) 真菌抗原檢查半乳甘露聚糖galactom

3、annan) 抗原GM) 甘露聚糖(mannan)抗原隱球菌莢膜多糖抗原乳膠凝集試驗(yàn)真菌特異的代謝產(chǎn)物D-阿拉伯糖醇真菌 DNA 的檢測10臨床診斷、擬診的微生物學(xué)1 合格痰標(biāo)本直接鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲，且連續(xù)培養(yǎng)2次別離到同種真菌2 BALF經(jīng)直接鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲真菌培養(yǎng)陽性3 痰液或BALF直接鏡檢發(fā)現(xiàn)新生隱球菌4 乳膠凝集法檢測隱球菌莢膜多糖抗原陽性5 G實(shí)驗(yàn)連續(xù)兩次陽性6 GM實(shí)驗(yàn)連續(xù)兩次陽性11侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)EORTC/MSG2021修訂版宿主因素臨床特征病原學(xué)真菌鏡檢真菌培養(yǎng)組織病理學(xué)檢查血清學(xué)檢查方法間接證據(jù)CSF隱球菌抗原陽性確診GM-test, G-test臨床診斷Clinic

4、al Infectious Diseases 2021; 46121,3 - - D-葡聚糖檢測13b1,6葡聚糖 磷脂雙分子層幾丁質(zhì)麥角固醇b1,3葡聚糖合成酶mannoproteins1,3真菌細(xì)胞膜、壁結(jié)構(gòu)羊毛固醇C14去甲基化酶14位復(fù)原和78位異構(gòu)酶角鯊烯環(huán)氧化酶141,3-D-葡聚糖結(jié)構(gòu)葡聚糖廣泛存在于真菌細(xì)胞壁中1,3-D-葡聚糖占真菌壁成分50%以上，是真菌細(xì)胞壁上的特有成分以1,3-糖苷鍵連接的葡萄糖殘基骨架作為主鏈以分支狀1-6-D葡萄糖殘基作為側(cè)鏈151,3-D-葡聚糖特性對熱極為穩(wěn)定，高壓121并不能使其滅活。在念珠菌和曲霉菌細(xì)胞壁中含量較多，對G實(shí)驗(yàn)靈敏。當(dāng)真菌進(jìn)入人

5、體血液或深部組織后，經(jīng)吞噬細(xì)胞的吞噬、消化等處理后，(1-3)-D-葡聚糖可從胞壁中釋放出來，從而使血液及其它體液中含量增高。當(dāng)真菌在體內(nèi)含量減少時，機(jī)體免疫系統(tǒng)可將其去除。在淺部真菌感染中，(1-3)-D-葡聚糖未被釋放出來，故其在體液中的量不增高?？捎糜跈z測念珠菌、毛孢子菌、曲霉菌、鐮刀菌、卡氏肺孢子菌不可檢測隱球菌、接合菌根霉/毛霉等16“G試驗(yàn)緣何而來？17比濁法反響機(jī)理細(xì)菌內(nèi)毒素 1-3-D-GlucanLAL-RM(反響物)因子C活化因子C 因子B活化因子B 活化因子G 因子G凝固酶原 凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白凝膠定量濁度儀Turbidimetric technique GEL18

6、分析前本卷須知采用無熱原采血管抽血后2h內(nèi)送檢血標(biāo)本4-8最多存放48h檢測環(huán)境應(yīng)保持清潔191,3-D-葡聚糖相關(guān)影響因素以下情況可出現(xiàn)假陽性：使用纖維素膜進(jìn)行血透，標(biāo)本或患者暴露于紗布或其他含有葡聚糖的材料；靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；鏈球菌血癥；操作者處理標(biāo)本時存在污染；使用多糖類抗癌藥物、放化療造成的粘膜損傷導(dǎo)致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌經(jīng)胃腸道進(jìn)入血液等也可能造成假陽性。 201,3-D-葡聚糖檢測臨床價值早期診斷：侵襲性真菌感染增多且復(fù)雜，早期病癥無特異性，往往被原發(fā)病掩蓋，病程長，發(fā)現(xiàn)較晚，死亡率高。因此對深部真菌感染治療成敗的關(guān)鍵在于早期診斷。指導(dǎo)用藥：快

7、速確定真菌感染后，選擇好治療方案,有針對性使用抗真菌類藥物。為臨床選用副作用小，療效高，價格適宜的藥物提供準(zhǔn)確的依據(jù)。評價效果：應(yīng)用抗真菌藥物后，定期檢測血漿中葡聚糖濃度變化，評價選用藥物的有效性。監(jiān)護(hù)病程：監(jiān)護(hù)深部真菌感染易感人群的病發(fā)狀態(tài)。動態(tài)觀察：易感人群，監(jiān)測臨床療效。21曲霉菌半乳甘露聚糖GMFigure 1-10 Noncompetitive sandwich method of immunoassay22中性粒細(xì)胞減少癥患者40例 開展為曲霉菌病的高危人群該研究選擇1,3-D-葡聚糖BG和半乳甘露聚糖GM兩個指標(biāo) 用于監(jiān)測中性粒細(xì)胞減少性成人曲霉菌病患者BG和GM兩項(xiàng)指標(biāo)均可用于

8、指導(dǎo)臨床診斷和治療真菌性疾病, 但BG可早于GM升高. BG和GM聯(lián)合檢測用于曲霉菌病的診療, 其特異性和陽性率均為100% . 例 1Carmen Pazos, Jose Ponton結(jié)論： BG和GM聯(lián)合檢測有助于臨床鑒定血液病患者是否合并真菌感染, 并將單一試驗(yàn)假陽性給診療帶來的影響降低到最小 .1,3-D-葡聚糖與循環(huán)半乳甘露聚糖的檢測比較： 用于治療和監(jiān)測中性粒細(xì)胞減少性成人曲霉菌病 23不同患者BG() and GM()體液變化情況侵襲性曲霉菌病合并急性髓樣白血病患者給予兩性霉素B和卡泊芬凈用藥 治療過程中BG和GM變化情況24(b) 侵襲性曲霉病合并慢性淋巴細(xì)胞白血病患者 未使用

9、兩性霉素B治療 BG ()和GM ()變化情況25(c) 多發(fā)性骨髓瘤患者(非侵襲性曲霉病) BG結(jié)果假陽性BG ()和GM ()26(d) Hodgkins 淋巴瘤 (非侵襲性曲霉病)患者 GM結(jié)果假陽性 BG ()和GM ()27(e) 急性髓樣白血病患者(非侵襲性曲霉病)白色念珠菌和光滑念珠菌 培養(yǎng)陽性 BG和GM結(jié)果假陰性 BG ()和GM ()28(f) 慢性淋巴細(xì)胞白血病患者(非侵襲性曲霉病)白色念珠菌 培養(yǎng)陽性 BG和GM結(jié)果陰性 BG ()和GM ()29120名兒童 7月8歲1,3-D-葡聚糖定量檢測結(jié)果： 中位數(shù) 32 pg/ml 平均值 68128 pg/ml 高值 5例

10、 12歲 348 pg/ml 2歲 374 pg/ml 14歲 491 pg/ml 13歲 754 pg/ml 14歲 947 pg/ml 94例(78%) 180pg/ml例 2 Smith, Daniel K.Benjamin,Jr, etc. CLINICALAND VACCINE IMMUNOLOGY,July2007結(jié)論研究數(shù)據(jù)顯示, 健康兒童的1,3-D-葡聚糖水平高于健康成人 .該指標(biāo)用于兒童感染性疾病的診斷應(yīng)慎重, 1,3-D-葡聚糖在兒童群體的正常值區(qū)間有待進(jìn)一步研究 .兒童1,3-D-葡聚糖水平研究30非免疫功能低下兒童1,3-D-葡聚糖水平31收集患者82例 侵襲性真菌感

11、染組 22例 其他真菌感染組 鐮刀菌/接合菌/絲孢菌感染 17 例 念珠菌感染 23例 對照組(血液腫瘤患者非真菌感染) 20例414份血清標(biāo)本檢測GM 409份血清標(biāo)本檢測BG侵襲性曲霉菌病患者在留取血清標(biāo)本前已接受抗真菌藥物治療 (包括聚烯類、氮雜茂類、棘球白素類等)半乳甘露聚糖和1,3-D-葡聚糖用于診斷血液腫瘤患者煙曲霉菌感染敏感性較低, 結(jié)論 對于血液腫瘤患者合并侵襲性真菌感染的診斷, BG的敏感度優(yōu)于GM .例 332侵襲性真菌感染或者GM和BG檢測結(jié)果比較33例 41,3-D-葡聚糖和抗白色念珠菌細(xì)胞壁抗原的IgG亞型抗體用于系統(tǒng)性念珠菌感染診療系統(tǒng)性念珠菌病患者 IgG亞型體液

12、水平升高 抗細(xì)胞壁碎片IgG1抗體(IgG1-CW) 抗磷酸肽甘露聚糖片段IgG2抗體(IgG2-PPM)系統(tǒng)性念珠菌病患者 IgG1-CW/ IgG2-PPM比值升高結(jié)論1,3-D-葡聚糖以及IgG1-CW、IgG2-PPM可用于早期診斷系統(tǒng)性 念珠菌病 .1,3-D-葡聚糖與IgG亞型相結(jié)合檢測可提高陽性預(yù)測值，有效指導(dǎo) 早期抗真菌藥物治療 ., L.Edebo,etc34念珠菌感染患者14例 1,3-D-葡聚糖結(jié)果陽性系統(tǒng)性念珠菌病患者14例1,3-D-葡聚糖檢測結(jié)果均大于20 pg/ml35血漿1,3-D葡聚糖檢測對血液病患者侵襲性真菌感染的診斷價值本研究收集疑為IFI的血液病患者血漿

13、標(biāo)本162例,其中化療后患者85例,造血干細(xì)胞移植后患者77例。按照歐洲癌癥研究治療組織及真菌研究組(EORTC/MSG)診斷標(biāo)準(zhǔn),所有病例中有確定診斷2例,臨床診斷18例,擬診75例,排除診斷67例。結(jié)果說明:以20 ng/m l為診斷界值,G試驗(yàn)的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值(PPV)和陰性預(yù)測值(NPV)分別為75%、91%、72.4%和92.4%。在75例擬診病例中,其中有51例G試驗(yàn)陽性,且對廣譜抗生素?zé)o效而經(jīng)過抗真菌治療有效,經(jīng)過臨床回憶性分析符合IFI,說明G試驗(yàn)使IFI診斷率提高31.4%。例 5劉芳,吳彤,等. 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志Journal of Experimental

14、Hematology 202136G試驗(yàn)對IF I診斷率的影響在所有162例患者中,假設(shè)無G試驗(yàn)作為診斷標(biāo)準(zhǔn),僅20例患者到達(dá)確診+臨床診斷真菌感染標(biāo)準(zhǔn),占總病例數(shù)12.3%。假設(shè)將G試驗(yàn)陽性作為微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn),那么有71例達(dá)確診+臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),占總病例數(shù)的43.8%。在75例擬診病例中,其中51例真菌培養(yǎng)陰性而G試驗(yàn)陽性的患者,均對廣譜抗生素?zé)o效而經(jīng)過抗真菌治療病情好轉(zhuǎn),經(jīng)過臨床回憶性分析符合IFI,故G試驗(yàn)使IFI診斷率提高了31.4%。37血漿1,3-D葡聚糖對深部真菌感染診斷的研究例 6趙勇,王紅,等. 中國真菌學(xué)雜志2007年8月第2卷第4期該研究共留取用于檢測血漿葡聚糖的標(biāo)本182份

15、,其中來自確診病例和高度疑似病例(真陽性)共18份,其余為可能感染病例(18份)和無深部真菌感染病例(146份,真陰性)。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果提示血漿葡聚糖水平對深部真菌感染診斷的準(zhǔn)確性優(yōu)于單純依靠各種標(biāo)本真菌培養(yǎng)或真菌涂片是否陽性對深部真菌感染的判斷。AUC95%置信區(qū)間葡聚糖0.8870.795-0.979真菌培養(yǎng)0.8400.744-0.936真菌涂片0.8330.738-0.927用于診斷深部真菌感染各指標(biāo)ROC曲線下面積38血清1,3-D-葡聚糖檢測在念珠菌菌血癥診斷中的價值例 7對2007年1月至2021年4月的25例念珠菌菌血癥患者、60例細(xì)菌菌血癥患者、25例念珠菌口咽定植者、20例健康

16、體檢者的血清1,3-D-葡聚糖含量進(jìn)行比較分析。念珠菌菌血癥組的血清1,3-D-葡聚糖含量為115.242.3 ng/L,明顯高于其他各組,其他各組間的血清1,3-D-葡聚糖含量無顯著差異。結(jié)論:血清1,3-D-葡聚糖的檢測是診斷念珠菌菌血癥的有效指標(biāo)。四組間比較:F=119.493,P0.105;念珠菌菌血癥組與細(xì)菌菌血癥組、念珠菌口咽定植組、健康體檢組的兩兩比較: P值均0.05.劉英其. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志2021年9月第19卷第9期39血漿1,3-D-葡聚糖與抗深部白色念珠菌感染藥物療效關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究例 8李世榮,王紅,等. 臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2007年第6卷第6期本文采用110只小鼠隨

17、機(jī)分成3組,空白對照組、模型組、氟康唑組,建立深部白色念珠菌感染的動物模型。定量檢測血漿中1,3-D-葡聚糖的含量,雙腎組織勻漿液培養(yǎng)計數(shù)菌落數(shù)。用于探討深部真菌感染小鼠血漿1,3-D-葡聚糖水平與抗真菌藥物療效的關(guān)系。各處理組不同時間點(diǎn)血漿1,3-D-葡聚糖的比較組別治療前治療第1天治療第3天治療第5天模型組4791.474415.995397.004640.993537.984259.212355.313663.52氟康唑組3978.093500.152976.153953.12662.601665.5417.8715.03對照組8.956.06治療前模型組血漿(13)-D-葡聚糖水平明顯

18、高于空白對照組,說明血漿1,3-D-葡聚糖水平異常升高可以反映深部真菌感染的存在。氟康唑組血漿1,3-D-葡聚糖水平隨著治療逐漸減低,從治療第5天開始與模型組相比,血漿1,3-D-葡聚糖水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),說明血漿(13)-D-葡聚糖水平與氟康唑的治療呈量效關(guān)系。40大鼠感染曲霉菌后1,3-D-葡聚糖水平變化該研究目的在于建立患侵襲性肺曲霉菌病動物模型, 監(jiān)測其血清1,3-D-葡聚糖濃度變化, 評價抗真菌感染療效 .結(jié)論1,3-D-葡聚糖可用于早期檢測侵襲性肺曲霉菌病和評價抗真菌藥物療效Nathan , Laura , etc. 例 9大鼠感染曲霉菌后第三天1,3-D-葡聚糖

19、水平明顯升高 609pg/ml41卡氏肺孢子蟲肺炎血清學(xué)標(biāo)志物卡氏肺孢子蟲肺炎(Pneumocystis pneumonia, PCP) 當(dāng)宿主防御機(jī)能受損時易引起疾病,最常見的是血液系統(tǒng)惡性疾病, 淋巴增生性疾病,腫瘤化療和艾滋病等引起的細(xì)胞免疫缺乏 .PCP因沒有特異性診斷指標(biāo)和明顯臨床病癥較難治療, 通常多藥物聯(lián)合治療, 常引發(fā)多器官感染 .該研究收集患者57例 標(biāo)本支氣管肺泡灌洗液BAL 檢測工程： 乳酸脫氫酶 LDH (肺部感染炎癥指標(biāo)) 1,3-D-葡聚糖 BG (真菌感染標(biāo)志物) KL-6 (間質(zhì)性肺炎標(biāo)志物)結(jié)論1,3-D-葡聚糖為診斷PCP的最正確指標(biāo).LDH與氧分壓相結(jié)適宜

20、用于反映肺部組織損害程度.對于嚴(yán)重呼吸衰竭患者, BAL的 1,3-D-葡聚糖水平能準(zhǔn)確反映患者病情 .Sadatomo Tasaka, Naoki Hasegawa, etc.Chest2007例 1042PCP組與非PCP組 LDH / BG / KL-6 水平比較434445各工程ROC曲線下面積為： KL-6 0.730 1,3-D-葡聚糖的ROC曲線下面積明顯高于其他兩個指標(biāo) (p 0.01)提示1,3-D-葡聚糖為診斷卡氏肺孢子蟲肺炎(PCP)的最正確指標(biāo)BG、LDH和 KL-6 ROC曲線461,3-D-葡聚糖和白色念珠菌芽管抗體用于診斷和治療成人中性粒細(xì)胞減少性念珠菌病檢測白念

21、珠菌芽管抗體(CAGT)在系統(tǒng)性白念珠菌感染診斷中具有一定的診斷意義結(jié)論BG和CAGT聯(lián)合檢測利于血液病患者合并真菌感染的檢測兩試驗(yàn)相結(jié)合可降低單一試驗(yàn)的假陽性率Carmen Pazos,Mara-Dolores Moragues, etc. Rev Iberoam Micol 2006例 1147不同患者BG()and 抗CAGT()抗體動態(tài)變化情況侵襲性念珠菌病患者合并急性髓樣白血病 使用兩性霉素B 治療后BG和CAGT變化情況48(b) 疑似侵襲性念珠菌病患者合并慢性淋巴細(xì)胞白血病未使用兩性霉素B治療 BG和CAGT滴度變化情況BG()and 抗CAGT()49(c) 多發(fā)性骨髓瘤(非念

22、珠菌感染)患者BG結(jié)果假陽性 BG()and 抗CAGT()50(d) 非Hodgkins 淋巴瘤(非念珠菌感染)患者 CAGT結(jié)果假陽性 BG()and 抗CAGT()51天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 病例1患者A，女性，82歲。病史：2021年8月31日外傷后，面部、左上肢疼痛、伴大小便失禁5天入院，于干部保健科接受治療。入院第一周 21222324252627入院第二周282930 1234入院第三周567891011NovDec送檢血培養(yǎng)(需氧+厭氧)需氧瓶報陽 為季也蒙假絲酵母菌無厭氧菌生長再次送檢血培養(yǎng) 結(jié)果同21日G試驗(yàn)檢測: 682.6 pg/ml請感染科會診: 診斷為真菌血癥且不除外真菌敗血癥給予科塞斯50mg靜滴因患者體弱給予輸入乳糜營養(yǎng)液數(shù)天科塞斯已用11天給予輸血漿200ml 改變膠體滲透壓G試驗(yàn)檢測52病例1 治療過程11月21日 送檢血培養(yǎng)(需氧+厭氧) 需氧瓶報陽 為季也蒙假絲酵母菌 無厭氧菌生長11月23日 再次送檢血培養(yǎng)(需氧+厭氧) 結(jié)果同上11月24日 送檢G試驗(yàn) 報告結(jié)果為11月26日 請感染科會診：患者為真菌血癥 目前不除外真菌敗血癥 給予科塞斯50mg靜滴以抗真菌血癥11月29日 患者病情平穩(wěn) 無發(fā)熱寒戰(zhàn)11月30日 因患者體弱 給予輸入乳糜營養(yǎng)液數(shù)天12月2日 患者病情穩(wěn)定 未訴不適 神情 兩肺呼吸音粗 12